Том 5, № 2 (2013)

РНК-интерференция является удобным инструментом, позволяющим модулировать экспрессию генов. Широкому применению РНК-интерференции мешает несовершенство методов эффективной доставки изучаемых генов в клетки-мишени. Одна из удобных и эффективных систем переноса генов и их экспрессии - система, основанная на применении лентивирусных векторов, направляющих синтез малых шпилечных РНК (shРНК) - предшественников siРНК. Использование подобных систем позволяет добиться устойчивой и долговременной экспрессии shРНК в клетках. В представленном обзоре рассмотрены такие подходы к созданию лентивирусных векторов, направляющих синтез shРНК, как адаптация процессинга искусственных shРНК к механизмам, используемым клеточными микроРНК, и экспрессия сразу нескольких shРНК. В настоящее время активно разрабатываются подходы к применению РНК-интерференции в терапии наследственных, онкологических и вирусных заболеваний. Совершенствование методов конструирования лентивирусных векторов, а также изучение механизмов процессинга малых интерферирующих РНК позволяют рассматривать лентивирусные векторы, направляющие синтез shРНК, как один из самых перспективных инструментов доставки малых интерферирующих РНК.

Инактивация Х-хромосомы - сложный эпигенетический процесс, который существует у сумчатых и плацентарных млекопитающих. Предполагают, что возникновение этого процесса связано с дифференцировкой половых хромосом и необходимостью компенсации дозы генов Х-хромосомы у самцов и самок. В обзоре рассмотрены особенности процесса инактивации X-хромосомы у сумчатых и плацентарных, а также обсуждаются гипотезы о его происхождении и эволюции.

В женских соматических клетках млекопитающих работает эпигенетический механизм дозовой компенсации, включающий инактивацию одной из двух Х-хромосом через формирование факультативного гетерохроматина. В отличие от плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) мыши, статус Х-хромосомы в плюрипотентных клетках человека является эпигенетически пластичным признаком. Известно, что для гетерохроматина свойственна поздняя репликация в поздней S-фазе клеточного цикла после репликации эухроматина. Это характерно и для факультативного гетерохроматина инактивированной Х-хромосомы. Принято считать, что неактивная Х-хромосома в клетках млекопитающих всегда имеет большую конденсацию в интерфазном ядре. Предполагается, что именно плотная упаковка определяет позднюю репликацию инактивированной Х-хромосомы. Методом полнохромосомной ДНК-гибридизации на интерфазных ядрах мы показали, что ПСК человека с инактивированной Х-хромосомой могут иметь как релаксированную, так и компактную хромосомную территорию неактивной Х-хромосомы. Поздняя репликация инактивированной Х-хромосомы также не зависит от степени компактизации ее хромосомной территории. Тем не менее для перехода Х-хромосомы к активному состоянию при ее реактивации и для синхронной репликации необходимым условием является декомпактизация хромосомной территории Х-хромосомы.

Регуляция транскрипции в бактериальных системах рестрикции-модификации (Р-М) является важным процессом, обеспечивающим согласованную экспрессию тандема ферментов - ДНК-метилтрансферазы (МТазы) и эндонуклеазы рестрикции (ЭР), защищающих клетку от проникновения чужеродной ДНК. В данной работе исследовали С5-цитозиновую МТазу Ecl18kI (M.Ecl18kI), по структуре и свойствам практически идентичную МТазе SsoII (M.SsoII). Обе МТазы ингибируют экспрессию собственного гена и активируют экспрессию гена сопряженной ЭР, связываясь с регуляторным участком в промоторной области этих генов. Нами изучено комплексообразование M.Ecl18kI и РНК-полимеразы Escherichia coli с промоторными областями генов МТазы и ЭР, детализирован механизм регуляции экспрессии генов в системе Р-М Ecl18kI. Показано, что M.Ecl18kI конкурирует с РНК-полимеразой за связывание с промоторным участком, однако непосредственных контактов между M.Ecl18kI и РНК-полимеразой не выявлено. Изучены свойства мутантных форм М.Ecl18kI и M.SsoII. Установлено, что аминокислотные замены в N-концевой области M.Ecl18kI, выполняющей регуляторную функцию, влияют не только на способность этого белка взаимодействовать с регуляторным участком и выступать в роли фактора транскрипции, но и на его способность связывать и метилировать ДНК-субстрат. Потеря МТазой метилирующей активности не препятствует регуляции этим белком транскрипции генов в системе Р-М Ecl18kI и даже усиливает сродство к регуляторному участку. Однако наличие в молекуле M.Ecl18kI домена, ответственного за метилирование, необходимо для выполнения регуляторной функции M.Ecl18kI.

Большинство нейродегенеративных патологий связано с появлением цитотоксических олигомеров и агрегатов мутантных белков, вызывающих дисфункцию клеток мозга и их гибель. В представленной работе изучали функции белковых факторов, как способствующих образованию агрегатов, так и предотвращающих этот процесс. К таким белкам можно отнести глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (ГАФД), тканевую трансглутаминазу (тТГ) и молекулярный шаперон - белок теплового шока 70 (БТШ70). Используя технологию siРНК, мы показали, что подавление экспрессии ГАФД в модели болезни Хантингтона (БХ) вызывает снижение на 45-50% уровня агрегации мутантного хантингтина, содержащего повтор из 103 остатков глутамина, и повышение количества выживших клеток. Впервые установлено, что блокирование синтеза ГАФД снижает степень агрегации супероксиддисмутазы-1 (СОД1) с мутацией G93A в модели амиотрофического бокового склероза (АБС). Обработка клеток, имитирующих БХ и АБС, ингибитором активности ГАФД, гидроксинонненалом (ГНЕ) также снижает количество агрегирующего материала. Агрегации мутантных белков способствует также тканевая трансглутаминаза. Подавление активности этого фермента с помощью цистамина препятствует образованию агрегатов мутантной СОД1 и хантингтина. Роль БТШ70 в контроле агрегации мутантного хантингтина изучали с использованием линии клеток с индуцибельной экспрессией шаперона. Увеличивая содержание БТШ70, мы добились снижения числа и размеров растущих агрегатов мутантного хантингтина. Таким образом, модуляция функции/количества трех белков (ГАФД, трансглутаминазы и БТШ70) влияет на патогенез таких распространенных нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Хантингтона и амиотрофический боковой склероз.