Том 6, № 4 (2014)

Калиевые потенциал-управляемые каналы (Kv) играют важную роль в разнообразных клеточных процессах, таких, как функционирование возбудимых клеток, регуляция апоптоза, клеточной дифференцировки и роста, выделение нейротрансмиттеров, гормонов, обеспечение сердечной деятельности и др. Нарушение функционирования Kv-каналов приводит к тяжелым наследственным заболеваниям и развитию опухолей, в том числе злокачественных. Понимание механизмов функционирования Kv-каналов - ключевой фактор для определения причин заболеваний, связанных с мутациями каналов, и поиска новых лекарственных средств. Механизм активации каналов - тема продолжающихся дебатов, и консенсус в этом вопросе пока не достигнут. В данном обзоре рассмотрены ключевые этапы изучения механизмов функционирования Kv-каналов и описаны основные модели их активации, известные к настоящему времени.

Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы (rAd) являются эффективным молекулярным инструментом для генной терапии и генной вакцинации. С помощью таких векторов нужные гены можно доставить и экспрессировать в клетках различных эпителиев, печени, в иммунных и кроветворных клетках животных и человека. Успех генной терапии и генной вакцинации зависит от интенсивности продукции целевого белка, кодируемого вектором. В представленной работе изучено влияние агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR) на эффективность трансдукции и экспрессии rAd в антигенпредставляющих клетках животных и человека. Установлено, что агонисты TLR2, 4, 5, 7, 8 и 9 значительно усиливают продукцию белка в клетках, трансдуцированных rAd со вставкой гена этого белка. Эффект усиления реализуется в дендритных клетках и макрофагах, экспрессирующих цитоплазматический (GFP), мембранный (HA) или секреторный (SEAP) белки. На лабораторных мышах показано усиление экспрессии целевого белка с помощью фармацевтического агониста TLR4. В отличие от агонистов других TLR, агонист TLR3 подавляет продукцию GFP или SEAP в клетках, трансдуцированных rAd со вставкой гена этих белков. Предполагается, что усиление экспрессии целевого белка связано с активацией сигнального пути MyD88 → NF-kB, а подавление - с активацией сигнального пути TRIF → IRF. При активации обоих сигнальных путей агонистом TLR4 доминирует сигнал MyD88 → NF-kB, стимулирующий продукцию белка, кодируемого трансгеном в составе rAd.

Актуальным направлением в современной медицинской диагностике является создание нацеленных на патологические мишени конструкций на основе фотолюминесцентных наночастиц, обладающих высокой фото- и химической стабильностью, а также спектрами поглощения и испускания фотолюминесценции в области «окна прозрачности» биоткани. В работе получена двухкомпонентная конструкция на основе антистоксовых нанофосфóров (НАФ) и противоопухолевых мини-антител 4D5scFv для селективного мечения клеток, гиперэкспрессирующих опухолевый маркер HER2, характерный для целого ряда метастазирующих опухолей человека. Высокоаффинная белковая пара барстар : барназа (Bs : Bn), обладающая чрезвычайной устойчивостью в широком диапазоне pH и температур, использована в качестве молекулярного адаптера, обеспечивающего самосборку двухкомпонентной конструкции. На клетках аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, гиперэкспрессирующих HER2, показана высокая избирательность связывания полученной двухкомпонентной конструкции 4D5scFv-Bn : Bs-НАФ с опухолевыми клетками. Предложенный подход позволяет получать аналогичные конструкции для визуализации различных специфических маркеров в патогенных тканях, в том числе в злокачественных новообразованиях.

Белки человека SLURP-1 и SLURP-2, принадлежащие семейству Ly-6/uPAR, секретируются различными клетками, включая эпителиальные и иммунные. Эти белки действуют как ауто/паракринные гормоны, регулирующие рост и дифференцировку кератиноцитов, а также участвуют в контроле воспалительных процессов и злокачественной трансформации клеток. Предполагаемой мишенью SLURP-1 и SLURP-2 являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) типа α7 и α3β2 соответственно. Детальные молекулярные механизмы, лежащие в основе действия SLURP-1 и SLURP-2, остаются в настоящее время не охарактеризованными. SLURP-2 - один из наименее изученных белков семейства Ly-6/uPAR. В представленной работе разработаны система продукции SLURP-2 в клетках Escherichia coli и протокол ренатурации белка из цитоплазматических телец включения. Получены миллиграммовые количества рекомбинантного SLURP-2 и его 13С-15N-меченого аналога. Рекомбинантный белок охарактеризован методом ЯМР-спектроскопии, построена модель пространственной структуры SLURP-2. На клетках колоректальной аденокарциномы человека НТ-29, экспрессирующих нАХР только типа α7, проведено сравнительное исследование действия рекомбинантных белков SLURP-1 и SLURP-2. Показано, что SLURP-1 и SLURP-2 оказывают антипролиферативный эффект, вызывая значительное снижение популяции клеток в течение 48 ч, при этом методами флуоресцентной микроскопии не выявлено ни апоптотической, ни некротической гибели клеток. Полуэффективные концентрации (ЕС50) составили ~ 0.1 и 0.2 нМ для SLURP-1 и SLURP-2 соответственно. Максимальный эффект (~ 54 и 63% живых клеток относительно контроля) наблюдали при концентрации SLURP-1 и SLURP-2, равной 1 мкМ. Полученные данные указывают на нАХР типа α7 как на главный рецептор, ответственный за антипролиферативный эффект белков SLURP в эпителиальных клетках человека.

Моноциты периферической крови больных атеросклерозом предактивированы и обладают некоторыми чертами тканевых макрофагов. Их адгезия к эндотелию в 1.5 раза выше, чем у моноцитов здоровых субъектов, и они экспрессируют ряд рецепторов и антигенов, характерных для тканевых макрофагов. В дополнение к этому ранее мы показали, что в моноцитах крови больных атеросклерозом, так же как и при in vitro-дифференцировке моноцитов в макрофаги, значительно активируется биосинтез ганглиозидов, главная функция которых - формирование мембранных рафтов. В настоящей работе мы исследовали экспрессию мембранных рафтов на различных субпопуляциях моноцитов в норме и при атеросклерозе. Моноциты больных атеросклерозом, как показано методом проточной цитометрии, отличались от моноцитов здоровых субъектов двукратным увеличением процентного содержания промежуточной субпопуляции (CD14 ⁺⁺/CD16 ⁺) и повышением экспрессии фракталкинового рецептора CX3CR1 на промежуточной и неклассической субпопуляциях (CD14 ⁺⁺/CD16 ⁺ и CD14 ⁺/CD16 ⁺⁺) (в 2.3 и 1.8 раза соответственно). Это свидетельствует о предактивированном состоянии моноцитов больных. В то же время экспрессия маркера мембранных рафтов была одинаковой на субпопуляциях моноцитов обеих исследованных групп. Однако изучение in vitro дифференцировки моноцитов в макрофаги показало, что уже на первые сутки культивирования экспрессия мембранных рафтов повышалась в 2 раза и к 7-му дню возрастала в 3 раза в сравнении со свежевыделенными моноцитами. Таким образом, можно предположить, что при атеросклерозе моноциты накапливают ганглиозиды, которые используются для формирования мембранных рафтов при макрофагальной дифференцировке моноцитов после их миграции в интиму артерий.

Антимикробные пептиды (АМП) являются важнейшими компонентами системы врожденного иммунитета человека и животных. Охарактеризован ряд АМП, выделенных нами из лейкоцитов русского осетра Acipenser gueldenstaedtii - представителя подкласса хрящевых ганоидов, формирующих наиболее древнюю группу костных рыб. Структурный анализ пептидов, названных аципенсинами (Ac), показал, что лейкоциты осетра содержат шесть пептидов с молекулярными массами 5336.2, 3803.0, 5173.0, 4777.5 и 5449.4 и 2740.2 Да, обозначенных Ac1-Ac6 соответственно. Нами определены полные первичные структуры всех выделенных пептидов и исследована биологическая активность трех главных компонентов - Ас1, Ас2 и Ac6. Установлено, что Ас1, Ас2, Ас3, Ас4 и Ас5 представляют собой N-концевые ацетилированные фрагменты 1-50, 1-35, 1-49, 1-44 и 1-51 гистона Н2А соответственно, а Ас6 является фрагментом 62-85 гистона Н2А. Выделенные из лейкоцитов пептиды Ас1 и Ас2 обладают высокой антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий ( Escherichia coli ML-35p, Listeria monocytogenes EGD, MRSA ATCC 33591), а также гриба Candida albicans 820. Ас6 активен только в отношении грамотрицательной бактерии. Активность Ac1 и Ас2 в отношении гриба и MRSA снижалась при повышении ионной силы раствора. В концентрациях, близких к минимальным ингибирующим, Ас1, Ас2 и Ас6 увеличивали проницаемость наружной мембраны E. coli ML-35p для хромогенного маркера, но их влияние на проницаемость цитоплазматической мембраны бактерии не было существенным по сравнению с действием мембраноактивного пептида протегрина 1. Все три аципенсина не проявляли гемолитической активности в отношении эритроцитов человека в диапазоне концентраций от 1 до 40 мкМ и не оказывали цитотоксических эффектов на клетки К-562 и U-937 (1-20 мкМ) in vitro. Обнаружение в лейкоцитах осетра антимикробных пептидов, производных гистона Н2А, свидетельствует в пользу предположения о биологически значимой роли гистонов и их фрагментов в обеспечении противоинфекционной защиты.

Описан новый класс аналогов нуклеиновых кислот, содержащих фосфорилгуанидиновую группу. Окисление связанного с полимерным носителем динуклеозид-β-цианэтилфосфита йодом в присутствии 1,1,3,3-тетраметилгуанидина приводит к образованию динуклеотида, содержащего незаряженную тетраметилфосфорилгуанидиновую группу (Tmg), в качестве основного продукта. Tmg-группа устойчива в условиях твердофазного олигонуклеотидного синтеза, последующего удаления защитных групп и отщепления олигонуклеотида от полимерного носителя аммонолизом. Олигонуклеотиды, содержащие Tmg-группу, способны связываться с комплементарными последовательностями ДНК и РНК со сродством, лишь незначительно отличающимся от сродства природных олигодезоксирибонуклеотидов.