Том 5, № 4 (2013)

Современная биомедицина и фармакология требуют создания новых, более совершенных клеточных моделей заболеваний. Одним из перспективных направлений в данной области является применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), получаемых путем репрограммирования соматических клеток. Однако для полноценного использования данной технологии необходимо тщательное изучение ИПСК на молекулярном, эпигенетическом и функциональном уровнях. Современные методы анализа свидетельствуют о том, что ИПСК очень схожи с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) по профилю экспрессии белоккодирующих генов, генов микроРНК, метилированию ДНК, спектру и паттерну распределения ковалентных модификаций гистонов. Тем не менее показано, что ИПСК обладают характерными особенностями, приобретенными как в процессе репрограммирования, так и в результате сохранения ряда черт эпигеномов и транскриптомов исходных соматических клеток-предшественников. Явление сохранения черт эпигеномов и транскриптомов исходных соматических клеток получило название «эпигенетическая память». Данный обзор посвящен явлению «эпигенетической памяти» в контексте процесса репрограммирования, влиянию «памяти» на свойства ИПСК, а также возможности ее использования в клеточных технологиях.

Аптамеры – короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулами различной природы. Когда почти четверть века назад была разработана технология получения аптамеров, сразу же предположили, что она может послужить революционизирующим началом для решения многих проблем диагностики и терапии разнообразных заболеваний. Многочисленные попытки практического использования аптамеров, хотя и были иногда успешными, однако в целом результаты оказались значительно скромнее, чем ожидалось. Настоящий обзор посвящен главным образом не успехам в использовании аптамеров, а тем проблемам, которые затрудняют их широкое применение в терапии и диагностике, и тем подходам, которые могут существенно повлиять на расширение областей применения аптамеров.

Отсутствие эффективных противовирусных препаратов затрудняет противодействие опасному РНК-содержащему вирусу гриппа типа А (H1N1). Установлено, что секретируемая рибонуклеаза бацилл (биназа) проявляет противовирусную активность как при одноцикловой, так и при многоцикловой репродукции вируса гриппа А в диапазоне нетоксичных для эпителиальных клеток концентраций и множественности инфекции 0.01–0.1. Обработка вируса биназой в концентрации 1 мкг/мл в течение 15–30 мин снижала в 3–10 раз количество фокусобразующих единиц вируса и подавляла развитие вирусиндуцированного цитопатического действия в клетках легких человека линии А549. Обсуждаются возможные механизмы взаимодействия фермента с вирусом. Положительный заряд биназы, как и гемагглютинина вируса, обуславливает их электростатическое связывание с отрицательно заряженной сиаловой кислотой на клеточной поверхности с последующим проникновением в клетку. После потери капсидной оболочки и выхода вирусной РНК из эндосомы возможно ее непосредственное каталитическое расщепление интернализованной биназой. Полученные данные подтверждают перспективы использования биназы в качестве противовирусного агента, эффективного в отношении пандемического вируса гриппа А (H1N1). Несомненный прогресс в данном направлении исследований связан с установлением детальных механизмов противовирусного действия биназы и разработкой наиболее эффективного способа ее практического применения.

Рассеянный склероз (РС) - хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, поражающее в основном людей молодого и среднего возраста. На сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что без активации B-клеточного ответа развитие данной патологии невозможно. Хотя точный механизм, лежащий в основе этиологии РС, неизвестен, многие ученые полагают, что при определенном сочетании генетических и экологических факторов индуктором заболевания может служить вирусная или бактериальная инфекция. В данной работе мы поставили своей задачей с помощью сочетания методов широкомасштабного секвенирования и функционального отбора охарактеризовать поли- и кроссреактивные антитела, способные одновременно узнавать вирусные белки и аутоантигены, инициируя таким образом развитие болезни путем механизма молекулярной мимикрии. Мы обнаружили, что кроссреактивное узнавание двух антигенов, вероятно, обусловлено сочетанием индивидуального узнавания легкой и тяжелой цепью своего конкретного антигена. Выявленная высокая структурная гомология исследованных аутоантител с различными противовирусными антителами позволила нам предположить, что в индукции РС главенствующая роль может принадлежать целому ряду патогенов, а не какому-то определенному вирусу.

Трехмерные модели кожи и эпидермиса позволяют получать достоверную информацию о таких заболеваниях, как псориаз, поскольку они точно имитируют структуру кожи. Из кератиноцитов новорожденных мышат нами получена трехмерная модель эпидермиса, которую обработали цитокинами. В представленной работе оценена пригодность этой трехмерной модели для изучения псориаза, описаны изменения в ее структуре и экспрессии генов после обработки провоспалительными цитокинами. Показано, что обработка трехмерной модели интерлейкином 17 или комбинацией фактора некроза опухолей и интерферона γ приводит к изменениям структуры, сходным с проявлениями акантоза при псориазе. Наблюдаемые изменения в экспрессии генов металлопротеиназ и других биомаркеров псориаза (mki67, krt16 и fosl1) были сходны с изменениями в пораженной коже больных. Обработка модели интерфероном γ и фактором некроза опухолей приводит к более выраженным изменениям экспрессии генов, чем обработка интерлейкином 17. Напротив, обработка клеток HaCaT фактором некроза опухолей и интерфероном γ не влияла существенно на экспрессию fosl1, но снижала экспрессию mki67, интерлейкин 17 практически не влиял на экспрессию krt16 и mki67, но снижал экспрессию fosl1. Результаты исследования подтверждают возможность использования трехмерной модели эпидермиса мыши для изучения псориаза.

Гидролаза эфиров альфа-аминокислот (AEH, [КФ 3.1.1.43]) является перспективным биокатализатором синтеза β-лактамных антибиотиков – как пенициллинов, так и цефалоспоринов. Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген AEH из Xanthomonas rubrilineans (XrAEH). В представленной работе с целью рационального дизайна XrAEH методом гомологичного моделирования построена структура этого фермента и проведен анализ его активного центра. Идентифицированы остатки, образующие каталитическую триаду (Ser175, His341 и Asp308), а также остатки, входящие в оксианионный центр (Tyr83 и Tyr176) и карбоксилатный кластер (карбоксильные группы остатков Asp311, Asp209 и Glu310). Показано, что оптимальная конформация остатков каталитической триады реализуется при суммарном заряде карбоксилатного кластера, равного –1. С помощью докинга получены структуры комплексов XrAEH с ампициллином, амоксициллином, цефалексином, метиловыми эфирами D-фенилглицина и 4-окси-D-фенилглицина. С помощью моделирования комплексов фермента с различными субстратами проведен анализ полученных структур и определен ряд антибиотиков, при синтезе которых фермент XrAEH будет наиболее эффективен.

В экспериментах на кожно-грудинной мышце лягушки с использованием внеклеточного микроэлектродного отведения миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП) и флуоресцентной микроскопии (краситель FM1-43) исследовали влияние деполяризации постоянным током мембраны нервных окончаний на секрецию медиатора и процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул. Показано, что в контроле деполяризация мембраны нервного окончания вызывает выраженное повышение частоты МТКП (секреции квантов медиатора) и экзоцитоза (выгрузка FM1-43 из предварительно загруженных красителем синаптических везикул), которое связано с увеличением внутриклеточной концентрации Са2+ при открытии потенциал-зависимых Са-каналов. При блокировании Са-каналов и связывании внутриклеточных ионов Са2+ (совместное действие ионов Cd2+ и EGТА-АМ) деполяризующий ток слабо увеличивал частоту МТКП и экзоцитоз везикул. Процессы эндоцитоза (загрузка FM1-43 во вновь образующиеся синаптические везикулы) как в контроле, так и при совместном действии ионов Cd2+ и EGТА-АМ протекали пропорционально количеству синаптических везикул, подвергнувшихся экзоцитозу. Высказано предположение, что в двигательном нервном окончании лягушки кроме Са-зависимого экзо- и эндоцитоза синаптических везикул существует Са-независимый экзо- и эндоцитоз, который может активироваться непосредственно деполяризацией мембраны.