Том 7, № 3 (2015)

В настоящее время все больше лекарственных препаратов производят в культурах клеток млекопитающих. С целью повышения уровня и стабильности экспрессии целевых рекомбинантных белков в клеточных культурах используют различные регуляторные элементы, механизмы действия которых пока недостаточно изучены. В обзоре охарактеризованы и обсуждены потенциальные механизмы действия таких регуляторных элементов.

В обзоре обобщены результаты экспериментальных исследований последних лет, посвященных стимуляции восстановления периферических нервных проводников с помощью стволовых и прогениторных клеток. Проанализированы данные о подборе клеточных элементов, способных вырабатывать нейротрофические и ростовые факторы и выживать при пересадке в поврежденный нервный ствол или кондуит. Описаны способы усовершенствования кондуитов, соединяющих сегменты перерезанного нерва. Представлены данные о механизмах влияния пересаженных клеток на рост и регенерацию нервных волокон реципиента. Отмечены возможные негативные последствия трансплантации стволовых клеток. Подчеркнута необходимость дальнейшего изучения судьбы пересаженных клеток в условиях измененного микроокружения.

Ранее нами было показано, что аминокислотные замены в рекомбинантной формиатдегидрогеназе сои Glycine max (SoyFDH) Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val (Алексеева и соавт., Биохимия, 2012), Phe290Asp, Phe290Asn и Phe290Ser (Alekseeva et al., Prot. Eng. Des. Select, 2012) приводят к значительному (до 30-100 раз) увеличению термостабильности фермента. Методом направленного мутагенеза в двойной мутант SoyFDH Ala267Met/Ile272Val были введены замены Phe290Asp, Phe290Asn и Phe290Ser. Объединение трех замен не привело к заметному изменению каталитических свойств мутантного фермента. Стабильность полученных тройных мутантов изучали по кинетике термоинактивации и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Показано, что термостабильность новых мутантных SoyFDH намного выше, чем у их предшественников. По стабильности лучшая форма SoyFDH - Ala267Met/Ile272Val/Phe290Asp - оказалась сравнимой с наиболее стабильными формиатдегидрогеназами дикого типа из других источников. Результаты, полученные обоими методами, свидетельствуют о большом синергическом вкладе отдельных аминокислотных замен в стабилизацию фермента.

Клеточные линии млекопитающих широко используются для получения клеток-продуцентов рекомбинантных белков. Обычно стабильные трансгенные клеточные линии содержат много встроек экспрессионного вектора в одном месте генома. Транскрипция через трансген может быть одной из причин репрессии целевого гена при длительном культивировании таких клеточных линий. В настоящей работе с целью предотвращения транскрипции через трансген использовали известные терминаторы транскрипции вируса SV40, β- и γ-глобиновых генов человека. Показано, что терминаторы транскрипции увеличивают и стабилизируют экспрессию репортерного гена EGFP в трансгенных линиях клеток яичников китайского хомячка (СНО). Таким образом, терминаторы транскрипции могут использоваться для получения культур клеток млекопитающих с высоким и стабильным уровнем наработки целевого белка.

Коморбидность, или сочетание нескольких заболеваний у одного индивида, - явление распространенное и широко исследуемое. Однако генетические основы неслучайного сочетания болезней остаются недостаточно изученными. Современные технологии и методы анализа геномных данных делают возможным определение генетического профиля у больных, «обремененных» множеством болезней (полипатии, конгломераты болезней), и его сравнение с профилем больных отдельными формами патологии. Проведено ассоциативное исследование трех групп больных с различными сочетаниями сердечно-сосудистых заболеваний и контрольной группы. Выборки больных формировались по принципу только одного заболевания - ишемическая болезнь сердца (ИБС), сочетание двух заболеваний - ИБС и артериальная гипертония (АГ), сочетание нескольких болезней - ИБС, АГ, сахарный диабет типа 2 (СД2) и гиперхолестеринемия (ГХ). Генотипирование проводили на платформе геномного сервиса «Мой ген» (www.i-gene.ru). Представлен анализ ассоциаций более 1400 генетических полиморфных вариантов с изучаемыми фенотипами. С фенотипом «только ИБС» ассоциировано 14 полиморфных вариантов, в том числе, относящихся к генам APOB, CD226, NKX2-5, TLR2, DPP6, KLRB1, VDR, SCARB1, NEDD4L, SREBF2, и варианты в межгенных промежутках rs12487066, rs7807268, rs10896449 и rs944289. С фенотипом «ИБС в сочетании с АГ» ассоциировано 13 генетических маркеров, в том числе в генах BTNL2, EGFR, CNTNAP2, SCARB1, HNF1A и межгенные полиморфные варианты rs801114, rs10499194, rs13207033, rs2398162, rs6501455, rs1160312. С сочетанием нескольких болезней сердечно-сосудистого континуума (ССК) ассоциировано 14 генетических маркеров, в том числе в генах TAS2R38, SEZ6L, APOA2, KLF7, CETP, ITGA4, RAD54B, LDLR и MTAP и варианты в межгенных промежутках rs1333048, rs1333049 и rs6501455. Для фенотипов «только ИБС» и «ИБС в сочетании с АГ» выявлен один общий генетический маркер - rs4765623 гена SCARB1; для «ИБС в сочетании с АГ» и сочетанием нескольких заболеваний (синтропией) выявлено два общих генетических маркера - rs663048 гена SEZ6L и rs6501455, находящийся в межгенном регионе; между «синтропией» и «только ИБС» не найдено общих генов из числа изученных. В результате классифицирующего анализа принадлежности ассоциированных генов к основным метаболическим путям организма установлено, что гены липидного обмена вовлечены в формирование всех трех вариантов течения болезней ССК, а гены иммунного ответа специфичны для «изолированной» формы ИБС. Показано также, что коморбидность представляет собой дополнительную сложность на пути использования данных ассоциативных генетических исследований в тестах наследственной предрасположенности к заболеваниям, так как генетический профиль сочетанных заболеваний может отличаться от профиля отдельных, не сочетанных форм патологии.

TSPO - белок-переносчик холестерина в митохондриальный матрикс (транслокаторный белок), участвует в биосинтезе нейростероидов. В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова сконструирован топологический аналог лиганда TSPO Алпидема - дипептид ГД-23 (амид N-карбобензокси-L-триптофанил-L-изолейцина). Установлено, что ГД-23 в дозах 0.05-0.5 мг/кг (в/б) проявляет анксиолитическую активность в приподнятом крестообразном лабиринте и ноотропную активность в тесте распознавания нового объекта в условиях скополаминовой амнезии у грызунов. Показано, что ГД-23 не влияет на спонтанную двигательную активность, что исключает его седативное действие. Анксиолитическая и ноотропная активности ГД-23 блокируются антагонистом TSPO PK11195, что подтверждает участие TSPO в фармакологических эффектах дипептида.

Определяли целесообразность и информативность молекулярно-генетического исследования клональности при периферической Т-клеточной лимфоме (ПТКЛ). Анализировали биоптаты пораженных органов, кровь и костный мозг 30 пациентов с диагнозом периферическая Т-клеточная лимфома. Клональность Т-клеток оценивали по реаранжировкам генов TCRG и TCRB методом ПЦР с последующим секвенированием фрагментов. Исследование клональности по генам TCRG и TCRB позволяет доказать наличие опухоли у большинства (97%) пациентов с ПТКЛ. Методом ПЦР показано поражение костного мозга и/или лейкемизация у большинства (93%) пациентов, тогда как морфологически поражение костного мозга подтверждено только у 73% пациентов. Множественные реаранжировки генов Т-клеточных рецепторов γ и β, утрата и появление новых, присутствие нескольких опухолевых клонов обнаружено у 63% пациентов с ПТКЛ. Возможно, они связаны с генетической нестабильностью при ПТКЛ. Сделан вывод, что наличие множественных клональных реаранжировок TCRG и TCRB при ПТКЛ должно учитываться при использовании данного метода в диагностических целях. Клональная эволюция опухоли, появление новых клональных пиков (клонов) не свидетельствуют о появлении новой опухоли. Множественные реаранжировки генов TCRG и TCRB при ПТКЛ затрудняют оценку минимальной остаточной болезни.

Фитоэстрогены - соединения растительного происхождения, обладающие эстрогеноподобной активностью. В организме млекопитающих фитоэстрогены связываются с рецепторами эстрогенов (ER) и участвуют в регуляции роста клеток и транскрипции генов. Некоторые фитоэстрогены могут оказывать цитотоксическое и антипролиферативное воздействие на опухолевые клетки. Изучено действие представителей основных групп фитоэстрогенов на клетки рака молочной железы с различным рецепторным статусом, проанализированы молекулярные пути, отвечающие за реализацию антипролиферативного эффекта лидерного соединения. Антипролиферативный эффект высоких доз фитоэстрогенов (апигенина, генистеина, кверцетина, нарингенина) не зависел от статуса рецепторов стероидных гормонов в клетках рака молочной железы. Соединения этого класса проявили сходную эффективность в ER-положительной и ER-отрицательной модели. Наибольшая антипролиферативная активность обнаружена при инкубации клеток рака молочной железы с апигенином, наименьшая - с нарингенином. Апигенин в высоких дозах (50 мкМ) ингибировал активность рецепторов эстрогенов, индуцированную 17β-эстрадиолом, и не проявлял эстрогеноподобную активность. Культивирование HER2-положительных клеток линии SKBR3 с апигенином приводит к снижению экспрессии HER2/neu с параллельной деградацией последнего субстрата каспаз - белка PARP. Таким образом, антипролиферативные эффекты высоких доз фитоэстрогенов в клетках рака молочной железы не зависят от рецепторов стероидных гормонов. Среди изученных соединений наиболее перспективным в качестве противоопухолевого средства является апигенин, значительно ингибирующий пролиферацию и вызывающий гибель клеток рака молочной железы, в том числе HER2-положительных.

«Науки о жизни» - одно из приоритетных направлений развития научно-технологического комплекса России. Научные интересы работающих в этой области российских коллективов охватывают широкий спектр проблем, начиная с конструирования приборов и заканчивая сложнейшими молекулярно-биологическими экспериментами. Основываясь на предложениях по формированию тематик исследований и проектов, поступивших в Минобрнауки России за 2013-2014 годы, сформулирована Концепция реализации приоритетного направления «Науки о жизни». В Концепции определены четыре вектора развития: (1) персональная геномика и постгеномные технологии; (2) возможность интеграции устройств и материалов с организмом; (3) память и пластичность мозга; (4) биоактивные субстанции.