Том 10, № 4 (2018)

Биологические микрочипы являются аналитическим инструментом, позволяющим реализовать в доступной форме сложные интегративные подходы геномики и протеомики, решать задачи персонализированной медицины - проводить обследование пациента для выявления заболевания задолго до проявлений клинических симптомов, прогнозировать тяжесть протекания патологических и инфекционных процессов, выбирать эффективные и рациональные режимы терапии. Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения множества специфических реакций и исследования взаимодействий молекул биополимеров, таких, как ДНК, белки, гликаны. Одним из пионеров технологии биологических микрочипов стал Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), предложив иммобилизацию молекулярных зондов в трехмерной структуре гидрофильного геля. С момента первых экспериментов по секвенированию с помощью гибридизации на олигонуклеотидных микроматрицах, проведенных 30 лет назад, гидрогелевые биочипы ИМБ РАН прошли долгий и успешный путь от фундаментальных исследований до клинической лабораторной диагностики. Настоящий обзор посвящен обсуждению ключевых аспектов технологии гидрогелевых биочипов и ряду актуальных приложений к мультиплексному анализу ДНК и белковых биомаркеров социально значимых заболеваний, включая молекулярно-генетические, иммунологические и эпидемиологические аспекты патогенеза.

Резистентность к антибиотикам развивается уже более 2 млрд лет и широко распространена среди микроорганизмов. Ключевую роль в формировании резистентности играют бактериальные ферменты, классификация которых основана на участии в различных каталитических процессах: модификации ферментов, являющихся мишенями антибиотиков, и внутриклеточных мишеней, трансформации молекул антибиотиков и осуществлении реакций клеточного метаболизма. Основные механизмы развития резистентности связаны с эволюцией суперсемейств бактериальных ферментов, обусловленной изменчивостью кодирующих их генов, совокупность которых получила название «резистом». Десятки тысяч ферментов и их мутантов, реализующих различные механизмы резистентности, образуют новое сообщество, названное «энзистом». Анализ структуры и функциональных особенностей ферментов - мишеней разных классов антибиотиков, позволит выработать новые стратегии преодоления резистентности.

Неконтролируемая агрегация белков, сопровождающаяся формированием специфических включений, является важной составляющей патогенеза многих распространенных нейродегенеративных заболеваний, известных как протеинопатии. Промежуточные продукты этой агрегации токсичны для нейронов и вызывают их гибель. Стратегия разработки патогенетической терапии протеинопатий основывается на создании препаратов, способных как подавлять прогрессию протеинопатии, так и повышать выживаемость пораженных нейронов. Результаты десятилетних исследований, проведенных в отечественных и западных ведущих лабораториях, позволили заключить, что обладающий нейропротекторным эффектом отечественный препарат Димебон (Latrepirdine) способен, как и ряд других соединений из группы гаммакарболинов, модулировать течение нейродегенеративного процесса и в in vitro, и в in vivo модельных системах. Накопленные данные позволяют рассматривать гамма-карболины в качестве перспективной основы для разработки патогенетической терапии протеинопатий.

Обыкновенные мармозеты (Callithrix jacchus) - игрунковые обезьяны Нового Света, широко используются в биомедицинских исследованиях. Нами представлены оптимизированные протоколы оценки параметров адаптивного клеточного иммунитета мармозет, включая оценку субпопуляционного состава лимфоцитов и определение основных маркеров созревания и активации Т- и В-клеток методом проточной цитометрии с использованием панели флуоресцентно меченных антител. Образцы цельной крови восьми мармозет окрашивали флуоресцентно меченными моноклональными антителами к популяционным маркерам (CD45, CD3, CD20, CD4, CD8) и маркерам созревания и активации лимфоцитов (CD69, CD62L, CD45RO, CD107a и CD27) и анализировали методом проточной цитометрии. Популяция CD45+ клеток включала 22.7 ± 5.5% CD3-CD20+ клеток и 67.6 ± 6.3% CD3+CD20-клеток. Популяция CD3+ клеток состояла из 55.7 ± 5.5% CD3+CD4+CD8- и 34.3 ± 3.7% CD3+CD4-CD8+. Маркеры активации и созревания лимфоцитов выявлены в соответствующих популяциях в следующих пропорциях: CD62L на 54.0 ± 10.7% CD3+CD4+ и 74.4 ± 12.1% CD3+CD8+ клеток; CD69 на 2.7 ± 1.2% CD3+CD4+ и 1.2 ± 0.5% CD3+CD8+ клеток; CD45RO на 1.6 ± 0.6% CD3+CD4+ и 1.8 ± 0.7% CD3+CD8+ клеток; CD107a на 0.7 ± 0.5% CD3+CD4+ и 0.5 ± 0.3% CD3+CD8+ клеток; CD27 на 94.6 ± 2.1% CD3+ и 8.9 ± 3.9% CD20+ клеток. Доля CD3+CD4+CD45RO+ клеток у самок и самцов значимо различалась (1.9 ± 0.5% у самок и 1.1 ± 0.2% у самцов; p < 0.05). Доля CD20+CD27+ клеток значимо коррелировала с возрастом животных (r = 0.923, p <0.005). Определены базовые параметры адаптивного клеточного иммунитета, характерные для интактных мармозет, не имеющих маркеров системной иммунной активации. Знание этих параметров и проведение описанных процедур необходимы для оценки изменений иммунного статуса мармозет под воздействием профилактических и терапевтических иммунобиологических препаратов.

Впервые у этнических русских проведен анализ ассоциации с развитием рассеянного склероза (РС) гаплогрупп H, J, K и U митохондриального генома, а также отдельных полиморфных вариантов генов митохондриальной ДНК (мтДНК), дискриминирующих эти гаплогруппы (m.1719G > A, m.7028C > T, m.9055G > A, m.10398A > G, m.12308A > G). Исследуемая выборка включала 283 неродственных больных ремиттирующей формой РС и 290 здоровых доноров. Наблюдали ассоциацию гаплогруппы J c РС (P = 0.0055; ОШ = 2.00 [95% ДИ 1.21-3.41]). При гендерной стратификации значимая ассоциация сохранялась у женщин (P = 0.0083; ОШ = 2.20 [95% ДИ 1.19-4.03]). Проведен мультилокусный анализ ассоциации с РС сочетаний гаплогрупп мтДНК и вариантов 38 ядерных генов, вовлеченных в функционирование иммунной системы. Выявлены ассоциированные с РС биаллельные сочетания гаплогруппы J с аллелями CCL5 rs2107538*A, PVT1 rs2114358*G, TNFSF14 rs1077667*C и IL4 rs2243250*C, поодиночке не ассоциированными значимо с РС. Для сочетания гаплогруппы J и аллеля CCL5*A (P = 0.00043; ОШ = 5.47 [95% ДИ 1.85-16.15]) при помощи двух статистических критериев (значение PFLINT в точном трехфакторном тесте, подобном точному критерию Фишера, и фактор синергии, SF) установлен эпистатический (синергический) характер взаимодействия компонентов (PFLINT = 0.025; SF = 4.32 [95% ДИ 1.20-15.60]). Сочетание гаплогруппы J с аллелем PVT1*G характеризуется PFLINT = 0.084; SF = 3.05 [95% ДИ 1.00-9.31] и также может быть эпистатическим. Таким образом, впервые показано взаимодействие компонентов ядерного и митохондриального геномов при формировании риска развития РС.

В экспериментах in vitro и in vivo изучено действие Иммуномакса - агониста TLR4 растительного происхождения. В частности, с использованием культуры макрофагов, выделенных из костного мозга мышей, показано, что Иммуномакс переводит макрофаги мыши из состояния М0 и М2 в М1 (для определения фенотипа использовали данные об экспрессии мРНК генов ARG1 и iNOS). Профилактическое (противовирусное) действие Иммуномакса изучено как на модели инфекции мышей респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), так и на модели обострения бронхиальной астмы на фоне РСВ-инфекции. В эксперименте с вирусиндуцированным обострением бронхиальной астмы выявили достоверное снижение вирусной нагрузки в гомогенатах легких мышей, обработанных Иммуномаксом, а также тенденцию к снижению уровня Th2-зависимых овальбуминспецифических IgG1-антител в сыворотке крови, преобладание М1-фенотипа макрофагов в легких, повышение РСВ-активированных CD4+ Т-клеток, содержащих внутриклеточный IFN-γ (Th1-клетки), и одновременно значительное снижение CD4+ клеток, секретирующих внутриклеточный IL-4 (Th2-клетки), определенных в селезенках мышей методом ELISPOT через 1.5 месяца после окончания эксперимента. Эти данные свидетельствуют о том, что применение Иммуномакса поляризует иммунный ответ в сторону Th1 и, по-видимому, может быть использовано в качестве средства для профилактики РСВ-инфекции на фоне иммунного ответа аллергического типа.

Ранее мы показали, что инсуляторный белок Su(Hw), содержащий домен цинковых пальцев, взаимодействует с ENY2 и привлекает ENY2-содержащие комплексы на Su(Hw)-зависимые инсуляторы дрозофилы, участвуя одновременно в регуляции транскрипции и позиционировании ориджинов репликации. В данной работе обнаружено, что ENY2 взаимодействует еще с одним белком - CG9890, который также содержит домен цинковых пальцев. Подтверждено взаимодействие ENY2 и CG9890. Показано, что белок CG9890 локализован в клеточном ядре и взаимодействует c белковыми комплексами SAGA, ORC, dSWI/SNF, TFIID, THO.

Впервые на атомистическом уровне описано взаимодействие фермента бутирилхолинэстеразы с экотиофатом - популярным модельным соединением, аналогом боевых отравляющих веществ VX и VR. При помощи методов молекулярного моделирования обнаружена конкуренция между двумя конформациями экотиофата в активном центре. Первая, близкая к конформации для способа связывания субстратов холинового ряда - бутирилхолина и бутирилтиохолина, - является ингибирующей, так как не способна к реакции с ферментом; вторая, реакционноспособная, обладает существенно худшей оценкой энергии связывания. Таким образом, экотиофат совмещает черты ингибиторов двух типов: конкурентного и суицидального. Данное наблюдение поможет уточнить кинетическую схему реакции для аккуратной оценки кинетических констант, что особенно важно при дизайне новых вариантов бутирилхолинэстеразы, способных к полному циклу гидролиза фосфорорганических соединений.

Acid resistance (AR) in Escherichia coli is an important trait that protects this microorganism from the deleterious effect of low-pH environments. Reports on biofilm formation in E. coli K12 showed that the genes participating in AR were differentially expressed. Herein, we investigated the relationship between AR genes, in particular those coding for specific transcriptional regulators, and their biofilm-forming ability at the phenotypic level. The latter was measured in 96-well plates by staining the bacteria attached to the well, following 24-hour growth under static conditions, with crystal violet. The growth conditions were as follows: Luria Bertani (LB) medium at neutral and acidic pH, at 37°C or 25°C. We observed that the three major transcriptional regulators of the AR genes (gadX, gadE, gadW) only marginally affected biofilm formation in E. coli. However, a striking and novel finding was the different abilities of all the tested E. coli strains to form a biofilm depending on the temperature and pH of the medium: LB, pH 7.4, strongly supported biofilm formation at 25°C, with biofilm being hardly detectable at 37°C. On the contrary, LB, pH 5.5, best supported biofilm formation at 37°C. Moreover, we observed that when E. coli carried a plasmid, the presence of the plasmid itself affected the ability to develop a biofilm, typically by increasing its formation. This phenomenon varies from plasmid to plasmid, depends on growth conditions, and, to the best of our knowledge, remains largely uninvestigated.