Acta Naturae

Недавние достижения в области вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) произвели революцию в репродукции человека, предоставив надежду миллионам пар, сталкивающимся с проблемами бесплодия. Тем не менее с ростом популярности этих методов возникли опасения относительно их потенциального воздействия на целостность генома потомства, зачатого с помощью ВРТ. Особенно важен вопрос о влиянии этих технологий на частоту de novo мутаций – генетических изменений, которые возникают спонтанно в зародышевой линии или в раннем эмбриогенезе и могут быть связаны с различными заболеваниями человека. Степень, в которой ВРТ может напрямую влиять на частоту de novo мутаций, остается предметом научных споров. В данном обзоре рассмотрены последние исследования, посвященные связи между ВРТ и частотой de novo мутаций, подчеркнута необходимость дальнейших исследований для выяснения клинической значимости этих мутаций и их долгосрочных последствий для здоровья потомства.

Внеклеточные везикулы (ВВ) секретируются практически всеми клетками млекопитающих и переносят различные активные биомолекулы, участвуя в межклеточных взаимодействиях. Патологические ВВ способствуют прогрессии опухоли, участвуя в таких процессах, как метастазирование, ангиогенез и уход опухолевых клеток из-под иммунного контроля. С другой стороны, выявлен потенциал ВВ как неинвазивных биомаркеров. В этом обзоре рассмотрены последние достижения в методах выделения и характеризации ВВ, молекулярные механизмы их биогенеза и роль в прогрессии рака. Кроме того, обсуждаются новые стратегии изучения молекулярного состава и профилирования ВВ для использования в диагностике методом жидкостной биопсии. Возможность использования ВВ для диагностики рака и мониторинга эффективности терапии подчеркивает их растущую значимость как универсальных диагностических инструментов.

Защитный ответ растений ассоциирован с накоплением флавоноидов, путь биосинтеза которых в растениях чеснока Allium sativum L. не охарактеризован. В данной работе в геноме A. sativum идентифицированы восемь генов халконсинтаз AsCHS1–8, предположительно катализирующих первую стадию синтеза флавоноидов в растениях чеснока. Установлено, что эти гены локализованы на четырех хромосомах. Гены AsCHS2, 6–8 содержат 1–2 интрона, тогда как AsCHS1, 3–5 безинтронные. Анализ органоспецифичных профилей экспрессии генов выявил значимый уровень транскриптов только AsCHS3 и 8. И только для AsCHS8 показано изменение уровня экспрессии при воздействии абиотических стрессоров (засоление, засуха, холод) и экзогенных фитогормонов (абсцизовая кислота, метилжасмонат). Полученные результаты позволяют предположить, что два гена из восьми – AsCHS3 и 8 могут определять синтез флавоноидов повсеместно в процессе развития растения чеснока; из них AsCHS8 экспрессируется существенно выше и участвует в ответе растения на стрессовые факторы. Остальные шесть генов (AsCHS1, 2, 4–7) могут участвовать в биосинтезе флавоноидов в узкоспециализированных клетках/тканях/органах или на отдельных стадиях развития растения чеснока. Проведенные нами идентификация и характеристика генов AsCHS1–8 халконсинтаз чеснока может стать основой для дальнейшего анализа механизмов регуляции стрессовой адаптации A. sativum, а также других видов Allium.

Ранее мы показали, что белок Aef1 дрозофилы, содержащий домены цинковых пальцев, взаимодействует с DUB-модулем комплекса SAGA. Сайты связывания белка Aef1 колокализуются с комплексами модификации и ремоделирования хроматина SAGA и dSWI/SNF, а также с репликационным комплексом ORC. Белок Aef1 преимущественно локализован на промоторах активных генов (55% сайтов) и может участвовать в регуляции транскрипции этих генов. В представленной работе установлено, что сайты связывания белка Aef1 в клетках S2 дрозофилы, расположенные вне промоторов генов, являются областями с пониженной плотностью нуклеосом и колокализуются с комплексами SAGA, dSWI/SNF и ORC. Сайты связывания Aef1 колокализуются с белком CBP и гистоновой меткой H3K27Ac, что считается меткой активных энхансеров. С целью изучения роли белка Aef1 в регуляции транскрипции провели RNA-Seq-эксперимент в нормальных клетках S2 дрозофилы и в клетках с РНК-интерференцией Aef1. Показали, что белок Aef1 влияет на транскрипцию 342 генов, причем более половины из них (178) содержат Aef1 на своих промоторах или энхансерах. Таким образом, белок Aef1 может привлекаться как на промоторы, так и на энхансеры и участвовать в регуляции транскрипции соответствующих генов как прямо, так и опосредованно.

В эукариотических клетках мРНК, содержащие преждевременные стоп-кодоны, разрушаются системой нонсенс-опосредованного распада (NMD). В результате взаимодействия между системами NMD и альтернативного сплайсинга генерируются NMD-чувствительные транскрипты (NMD targets, NMDT), которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов по механизму непродуктивного сплайсинга. Для понимания этого механизма необходимо правильно идентифицировать события альтернативного сплайсинга, приводящие к появлению NMDT. В данной работе для нахождения событий альтернативного сплайсинга, их классификации и количественной оценки разработан вычислительный конвейер NMDj, который в отличие от существующих методов не опирается на сравнение NMDT с наиболее похожим на него кодирующим транскриптом, а использует набор характеристических интронов, отличающих NMDT от кодирующих транскриптов. Тестирование на смоделированных данных секвенирования РНК показало, что NMDj способен количественно определять события альтернативного сплайсинга, приводящие к проявлению NMDT, с большей точностью, чем другие существующие для этой цели методы. NMDj представляет собой универсальный метод, подходящий для классификации сколь угодно сложных событий альтернативного сплайсинга, приводящих к появлению NMDT. Вычислительный конвейер NMDj доступен через репозиторий https://github.com/zavilev/NMDj/.

Известно, что длинные некодирующие РНК, или lncRNA (long non-coding RNA), могут привлекать белки-модификаторы хроматина к определенным геномным локусам, участвуя таким образом в эпигенетической регуляции экспрессии генов. Ранее были созданы две базы данных HiMoRNA и RNA-Chrom. Первая содержит области эпигенетических модификаций (пики), скоррелированные с экспрессией длинных некодирующих РНК, вторая – полногеномные взаимодействия десятков тысяч РНК с хроматином. В данной работе мы интегрировали эти два ресурса, что позволило сгенерировать интерпретируемые и поддерживаемые экспериментальными данными гипотезы о механизмах эпигенетической регуляции экспрессии генов длинными некодирующими РНК. С этой целью мы адаптировали веб-интерфейс HiMoRNA и RNA-Chrom таким образом, чтобы для каждой триады «lncRNA–эпигенетическая модификация–ассоциированный с модификацией ген» из HiMoRNA можно было получить контакты соответствующей lncRNA с конкретным геномным локусом или со всем геномом в RNA-Chrom. В частности, нами показано, что для lncRNA MALAT1, HOXC-AS2, NEAT1, NR2F1-AS1, PVT1, MEG3 большинство пиков HiMoRNA находятся на расстоянии до 25 т.п.н. от контактов данных lncRNA из RNA-Chrom. Подробно исследованы и подтверждены контакты lncRNA MIR31HG и PVT1 c пиками HiMoRNA для меток H3K27ac и H3K27me3 в локусах генов GLI2 и LATS2 соответственно, которые, как показано, регулируются данными РНК. Таким образом, интеграция баз HiMoRNA и RNA-Chrom позволяет прояснить роль конкретных lncRNA в регуляции гистоновых модификаций на уровне как отдельных локусов, так и полного генома. Мы считаем, что данная интеграция является удобным и ценным инструментом, который может значительно облегчить функциональную аннотацию lncRNA человека.

Красные флуоресцентные белки (RFP) часто используются в качестве предпочтительных флуоресцентных меток в микроскопии живых тканей и визуализации целого организма. При выборе конкретного варианта RFP приоритетными могут быть такие характеристики, как молекулярная яркость флуоресценции, скорость созревания хромофора, мономерность, длины волн возбуждения/эмиссии флуоресценции и низкая токсичность, которые в конкретном белке редко сочетаются оптимальным образом. Если же к метке предъявляются дополнительные требования, такие как продолжительное время жизни флуоресценции и/или мигание (blinking), то доступный набор вариантов может существенно сузиться. Поскольку все разнообразие традиционных моногенных RFP относится лишь к нескольким филогенетическим линиям (основные из которых – производные DsRed, eqFP578 и eqFP611), их практически значимые свойства ожидаемо распределены между близкими гомологами. В таких случаях систематический мутационный анализ, ориентированный на вариант-специфичные аминокислотные остатки, может пролить свет на происхождение различий между родственными RFP и быть полезным для объединения их преимуществ в новых вариантах RFP. Так, белок FusionRed, эффективный для флуоресцентного мечения благодаря высокой степени мономерности и низкой цитотоксичности, имеет значительно сниженные яркость и время жизни флуоресценции по сравнению с предковым mKate2. Нами охарактеризован новый быстро созревающий мономерный RFP, полученный на основе mKate2 и FusionRed, превосходящий оба родительских белка по молекулярной яркости, обладающий увеличенным временем жизни флуоресценции и спонтанным миганием, перспективным для наноскопии.