Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd2754510.32607/actanaturae.27545Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleTwo Key Substitutions in the Chromophore Environment of mKate2 Produce an Enhanced FusionRed-like Red Fluorescent ProteinДве ключевые замены в хромофорном окружении белка mKate2 для получения улучшенного FusionRed-подобного красного флуоресцентного белкаRuchkinD. A.РучкинД. А.
Russian Federation
noobissat@ya.ruGavrikovA. S.ГавриковА. С.
Russian Federation
noobissat@ya.ruKolesovD. V.КолесовД. В.
Russian Federation
noobissat@ya.ruGorokhovatskyA. Yu.ГороховатскийА. Ю.
Russian Federation
noobissat@ya.ruChepurnykhT. V.ЧепурныхТ. В.
Russian Federation
noobissat@ya.ruMishinA. S.МишинА. С.
Russian Federation
noobissat@ya.ruMaximovEugene G.МаксимовЕ. Г.
Russian Federation
noobissat@ya.ruPletnevaN. V.ПлетневаН. В.
Russian Federation
noobissat@ya.ruPletnevV. Z.ПлетневВ. З.
Russian Federation
noobissat@ya.ruPavlovaA. M.ПавловаА. М.
Russian Federation
noobissat@ya.ruNikitinV. A.НикитинВ. А.
Russian Federation
noobissat@ya.ruBogdanovA. M.БогдановА. М.
Russian Federation
noobissat@ya.ruShemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of SciencesИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наукLomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет имени М.В. ЛомоносоваPirogov Russian National Research Medical UniversityРоссийский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пироговаİzmir Institute of TechnologyИзмирский институт технологий250720251721181312010202419022025Copyright ©; 2025, Ruchkin D.A., Gavrikov A.S., Kolesov D.V., Gorokhovatsky A.Y., Chepurnykh T.V., Mishin A.S., Maximov E.G., Pletneva N.V., Pletnev V.Z., Pavlova A.M., Nikitin V.A., Bogdanov A.M.Copyright ©; 2025, Ручкин Д.А., Гавриков А.С., Колесов Д.В., Гороховатский А.Ю., Чепурных Т.В., Мишин А.С., Максимов Е.Г., Плетнева Н.В., Плетнев В.З., Павлова А.М., Никитин В.А., Богданов А.М.2025Ruchkin D.A., Gavrikov A.S., Kolesov D.V., Gorokhovatsky A.Y., Chepurnykh T.V., Mishin A.S., Maximov E.G., Pletneva N.V., Pletnev V.Z., Pavlova A.M., Nikitin V.A., Bogdanov A.M.Ручкин Д.А., Гавриков А.С., Колесов Д.В., Гороховатский А.Ю., Чепурных Т.В., Мишин А.С., Максимов Е.Г., Плетнева Н.В., Плетнев В.З., Павлова А.М., Никитин В.А., Богданов А.М.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/27545

Red fluorescent proteins (RFPs) are often probes of choice for living tissue microscopy and whole-body imaging. When choosing a specific RFP variant, the priority may be given to the fluorescence brightness, maturation rate, monomericity, excitation/emission wavelengths, and low toxicity, which are rarely combined in an optimal way in a single protein. If additional requirements such as prolonged fluorescence lifetime and/or blinking ability are applied, the available repertoire of probes could dramatically narrow. Since the entire diversity of conventional single-component RFPs belongs to just a few phylogenetic lines (DsRed-, eqFP578- and eqFP611-derived being the major ones), it is not unexpected that their advantageous properties are split between close homologs. In such cases, a systematic mutagenetic analysis focusing on variant-specific amino acid residues can shed light on the origins of the distinctness between related RFPs and may aid in consolidating their strengths in new RFP variants. For instance, the protein FusionRed, despite being efficient in fluorescence labeling thanks to its good monomericity and low cytotoxicity, has undergone considerable loss in fluorescence brightness/lifetime compared to the parental mKate2. In this contribution, we describe a fast-maturing monomeric RFP designed semi-rationally based on the mKate2 and FusionRed templates that outperforms both its parents in terms of molecular brightness, has extended fluorescence lifetime, and displays a spontaneous blinking pattern that is promising for nanoscopy use.

Красные флуоресцентные белки (RFP) часто используются в качестве предпочтительных флуоресцентных меток в микроскопии живых тканей и визуализации целого организма. При выборе конкретного варианта RFP приоритетными могут быть такие характеристики, как молекулярная яркость флуоресценции, скорость созревания хромофора, мономерность, длины волн возбуждения/эмиссии флуоресценции и низкая токсичность, которые в конкретном белке редко сочетаются оптимальным образом. Если же к метке предъявляются дополнительные требования, такие как продолжительное время жизни флуоресценции и/или мигание (blinking), то доступный набор вариантов может существенно сузиться. Поскольку все разнообразие традиционных моногенных RFP относится лишь к нескольким филогенетическим линиям (основные из которых – производные DsRed, eqFP578 и eqFP611), их практически значимые свойства ожидаемо распределены между близкими гомологами. В таких случаях систематический мутационный анализ, ориентированный на вариант-специфичные аминокислотные остатки, может пролить свет на происхождение различий между родственными RFP и быть полезным для объединения их преимуществ в новых вариантах RFP. Так, белок FusionRed, эффективный для флуоресцентного мечения благодаря высокой степени мономерности и низкой цитотоксичности, имеет значительно сниженные яркость и время жизни флуоресценции по сравнению с предковым mKate2. Нами охарактеризован новый быстро созревающий мономерный RFP, полученный на основе mKate2 и FusionRed, превосходящий оба родительских белка по молекулярной яркости, обладающий увеличенным временем жизни флуоресценции и спонтанным миганием, перспективным для наноскопии.

RFPFusionRedmKate2fluorescent proteinfluorescence lifetimeRFPFusionRedmKate2флуоресцентный белоквремя жизни флуоресценцииRussian Science FoundationРоссийский научный фонд23-24-00011Cardarelli F. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 11. P. 4164.Rodriguez E.A., Campbell R.E., Lin J.Y., Lin M.Z., Miyawaki A., Palmer A.E., Shu X., Zhang J., Tsien R.Y. // Trends Biochem. Sci. 2017. V. 42. № 2. P. 111–129.Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. № 10. P. 969–973.Wiedenmann J., Schenk A., Röcker C., Girod A., Spindler K.-D., Nienhaus G.U. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. V. 99. № 18. P. 11646–11651.Wiedenmann J., Schenk A., Röcker C., Girod A., Spindler K.-D., Nienhaus G.U. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 18. P. 11646–11651.Schnitzler C.E., Keenan R.J., McCord R., Matysik A., Christianson L.M., Haddock S.H.D. // Mar. Biotechnol. N. Y. N. 2008. V. 10. № 3. P. 328–342.Merzlyak E.M., Goedhart J., Shcherbo D., Bulina M.E., Shcheglov A.S., Fradkov A.F., Gaintzeva A., Lukyanov K.A., Lukyanov S., Gadella T.W.J., et al. // Nat. Methods. 2007. V. 4. № 7. P. 555–557.Merzlyak E.M., Goedhart J., Shcherbo D., Bulina M.E., Shcheglov A.S., Fradkov A.F., Gaintzeva A., Lukyanov K.A., Lukyanov S.А., Gadella T.W.J., et al. // Nat. Methods. 2007. V. 4. № 7. P. 555–557.Weissleder R. // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. № 4. P. 316–317.Frangioni J.V. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. V. 7. № 5. P. 626–634.Smith A.M., Mancini M.C., Nie S. // Nat. Nanotechnol. 2009. V. 4. № 11. P. 710–711.Shemiakina I.I., Ermakova G.V., Cranfill P.J., Baird M.A., Evans R.A., Souslova E.A., Staroverov D.B., Gorokhovatsky A.Y., Putintseva E.V., Gorodnicheva T.V., et al. // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 1204.Costantini L.M., Baloban M., Markwardt M.L., Rizzo M.A., Guo F., Verkhusha V.V., Snapp E.L. // Nat. Commun. 2015. V. 6. P. 7670.Cranfill P.J., Sell B.R., Baird M.A., Allen J.R., Lavagnino Z., de Gruiter H.M., Kremers G.-J., Davidson M.W., Ustione A., Piston D.W. // Nat. Methods. 2016. V. 13. № 7. P. 557–562.Kost L.A., Nikitin E.S., Ivanova V.O., Sung U., Putintseva E.V., Chudakov D.M., Balaban P.M., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // PloS One. 2017. V. 12. № 9. P. e0184225.Kost L.A., Nikitin E.S., Ivanova V.O., Sung U., Putintseva E.V., Chudakov D.M., Balaban P.M., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // PLoS One. 2017. V. 12. № 9. P. e0184225.Shen Y., Dana H., Abdelfattah A.S., Patel R., Shea J., Molina R.S., Rawal B., Rancic V., Chang Y.-F., Wu L., et al. // BMC Biol. 2018. V. 16. № 1. P. 9.Kost L.A., Ivanova V.O., Balaban P.M., Lukyanov K.A., Nikitin E.S., Bogdanov A.M. // Sensors. 2019. V. 19. № 13. P. 2982.Yoon S., Pan Y., Shung K., Wang Y. // Sensors. 2020. V. 20. № 17. P. 4998.Manna P., Hung S.-T., Mukherjee S., Friis P., Simpson D.M., Lo M.N., Palmer A.E., Jimenez R. // Integr. Biol. Quant. Biosci. Nano Macro. 2018. V. 10. № 9. P. 516–526.Mukherjee S., Hung S.-T., Douglas N., Manna P., Thomas C., Ekrem A., Palmer A.E., Jimenez R. // Biochemistry. 2020. V. 59. № 39. P. 3669–3682.Lambert T.J. // Nat. Methods. 2019. V. 16. № 4. P. 277–278.Muslinkina L., Pletnev V.Z., Pletneva N.V., Ruchkin D.A., Kolesov D.V., Bogdanov A.M., Kost L.A., Rakitina T.V., Agapova Y.K., Shemyakina I.I., et al. // Int. J. Biol. Macromol. 2020. V. 155. P. 551–559.Shcherbo D., Murphy C.S., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Chepurnykh T.V., Shcheglov A.S., Verkhusha V.V., Pletnev V.Z., Hazelwood K.L., Roche P.M., et al. // Biochem. J. 2009. V. 418. № 3. P. 567–574.García-Nafría J., Watson J.F., Greger I.H. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 27459.Costantini L.M., Fossati M., Francolini M., Snapp E.L. // Traffic Cph. Den. 2012. V. 13. № 5. P. 643–649.Engler C., Gruetzner R., Kandzia R., Marillonnet S. // PloS One. 2009. V. 4. № 5. P. e5553.Engler C., Gruetzner R., Kandzia R., Marillonnet S. // PLoS One. 2009. V. 4. № 5. P. e5553.Engler C., Kandzia R., Marillonnet S. // PloS One. 2008. V. 3. № 11. P. e3647.Engler C., Kandzia R., Marillonnet S. // PLoS One. 2008. V. 3. № 11. P. e3647.Engler C., Marillonnet S. // Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 2011. V. 729. P. 167–181.Ermakova Y.G., Pak V.V., Bogdanova Y.A., Kotlobay A.A., Yampolsky I.V., Shokhina A.G., Panova A.S., Marygin R.A., Staroverov D.B., Bilan D.S., et al. // Chem. Commun. 2018. V. 54. № 23. P. 2898–2901.Manna P., Jimenez R. // J. Phys. Chem. B. 2015. V. 119. № 15. P. 4944–4954.Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden C., Saalfeld S., Schmid B., et al. // Nat. Methods. 2012. V. 9. № 7. P. 676–682.Protasova E.A., Mishin A.S., Lukyanov K.A., Maksimov E.G., Bogdanov A.M. // Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. 2021. V. 20. № 6. P. 791–803.Subach F.V., Verkhusha V.V. // Chem. Rev. 2012. V. 112. № 7. P. 4308–4327.Wachter R.M., Elsliger M.A., Kallio K., Hanson G.T., Remington S.J. // Struct. Lond. Engl. 1993. 1998. V. 6. № 10. P. 1267–1277.Wachter R.M., Elsliger M.A., Kallio K., Hanson G.T., Remington S.J. // Struct. Lond. Engl. 1998. V. 6. № 10. P. 1267–1277.Bindels D.S., Haarbosch L., van Weeren L., Postma M., Wiese K.E., Mastop M., Aumonier S., Gotthard G., Royant A., Hink M.A., et al. // Nat. Methods. 2017. V. 14. № 1. P. 53–56.Pletnev S., Shcherbo D., Chudakov D.M., Pletneva N., Merzlyak E.M., Wlodawer A., Dauter Z., Pletnev V. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 43. P. 28980–28987.Janin J., Rodier F. // Proteins. 1995. V. 23. № 4. P. 580–587.Luo J., Liu Z., Guo Y., Li M. // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 14214.Kim B.B., Wu H., Hao Y.A., Pan M., Chavarha M., Zhao Y., Westberg M., St-Pierre F., Wu J.C., Lin M.Z. // Sci. Rep. 2022. V. 12. № 1. P. 3678.Kremers G.-J., Hazelwood K.L., Murphy C.S., Davidson M.W., Piston D.W. // Nat. Methods. 2009. V. 6. № 5. P. 355–358.Kredel S., Oswald F., Nienhaus K., Deuschle K., Röcker C., Wolff M., Heilker R., Nienhaus G.U., Wiedenmann J. // PloS One. 2009. V. 4. № 2. P. e4391.Kredel S., Oswald F., Nienhaus K., Deuschle K., Röcker C., Wolff M., Heilker R., Nienhaus G.U., Wiedenmann J. // PLoS One. 2009. V. 4. № 2. P. e4391.Lam A.J., St-Pierre F., Gong Y., Marshall J.D., Cranfill P.J., Baird M.A., McKeown M.R., Wiedenmann J., Davidson M.W., Schnitzer M.J., et al. // Nat. Methods. 2012. V. 9. № 10. P. 1005–1012.Mamontova A.V., Grigoryev A.P., Tsarkova A.S., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // Russ. J. Bioorganic Chem. 2017. V. 43. № 6. P. 625–633.Mamontova A.V., Grigoryev A.P., Tsarkova A.S., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // Rus. J. Bioorganic Chem. 2017. V. 43. № 6. P. 625–633.Klementieva N.V., Pavlikov A.I., Moiseev A.A., Bozhanova N.G., Mishina N.M., Lukyanov S.A., Zagaynova E.V., Lukyanov K.A., Mishin A.S. // Chem. Commun. Camb. Engl. 2017. V. 53. № 5. P. 949–951.Mukherjee S., Thomas C., Wilson R., Simmerman E., Hung S.-T., Jimenez R. // Phys. Chem. Chem. Phys. PCCP. 2022. V. 24. № 23. P. 14310–14323.Gavrikov A.S., Baranov M.S., Mishin A.S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2020. V. 522. № 4. P. 852–854.Zhang H., Lesnov G.D., Subach O.M., Zhang W., Kuzmicheva T.P., Vlaskina A.V., Samygina V.R., Chen L., Ye X., Nikolaeva A.Y., et al. // Nat. Methods. 2024. V. 21. № 4. P. 657–665.Mukherjee S., Douglas N., Jimenez R. // J. Phys. Chem. Lett. 2024. V. 15. № 6. P. 1644–1651.