Том 14, № 4 (2022)

Метилирование – важнейшая эпигенетическая модификация ДНК, участвующая в регуляции транскрипции, импринтинге, установлении Х-инактивации, формировании структуры хроматина. Метилирование ДНК в геноме чаще всего ассоциировано с подавлением транскрипции и с формированием закрытого гетерохроматина. Однако результаты полногеномных исследований профиля метилирования ДНК, транскрипционной активности генов заставили пересмотреть эту парадигму. Промоторы многих генов остаются активными, несмотря на их метилирование. Отличия в распределении метилирования ДНК в норме и патологии позволяют рассматривать метилирование в качестве диагностического маркера или терапевтической мишени. Все это повышает интерес к изучению факторов, влияющих на метилирование ДНК и участвующих в его интерпретации. За последнее время найдено большое количество белковых факторов, способность которых связываться с ДНК зависит от метилирования. Многие из этих белков выступают не только как активаторы или репрессоры транскрипции, но и влияют на уровень метилирования ДНК. Эти факторы рассматриваются как потенциальные терапевтические мишени при заболеваниях, в основе которых лежат или изменение метилирования ДНК, или изменение активности белков, связывающихся с метилированной ДНК. Помимо белковых факторов, на метилирование ДНК может влиять вторичная структура ДНК, которая также служит терапевтической мишенью. В представленном обзоре обобщены результаты последних исследований профиля метилирования геномной ДНК, обсуждаются причины избегания метилирования некоторыми участками ДНК, а также факторы, способные влиять на уровень метилирования ДНК и использоваться в качестве мишени для терапии.

Система эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) удаляет из ДНК различные объемные повреждения, которые вызывают существенные искажения регулярной структуры двойной спирали. Такие повреждения, в основном ковалентные аддукты, сформированные по азотистым основаниям ДНК, могут появляться под действием ультрафиолетового и ионизирующего излучения, а также в результате взаимодействия ДНК с химически активными веществами эндогенного и экзогенного происхождения. В условиях роста количества повреждений ДНК, например, при проведении интенсивной химио- и комплексной терапии, а также при нарушении процессов репарации ДНК, объемные аддукты могут оказываться в составе кластерных повреждений. Кластерные повреждения представляют собой два или более повреждений, расположенных в пределах одного или двух витков спирали ДНК. Несмотря на то что репарация одиночных повреждений ДНК системой NER в эукариотической клетке изучена достаточно полно, в механизме репарации объемных повреждений, расположенных в составе кластеров, многое остается неясным. Выявление структурных особенностей участков ДНК, содержащих нерепарируемые кластерные повреждения, представляет значительный интерес, в том числе ввиду взаимосвязи между эффективностью действия некоторых противоопухолевых препаратов и активностью клеточных систем репарации. В обзоре проанализированы данные о формировании кластерных повреждений, содержащих объемные аддукты, потенциальной биологической значимости таких повреждений, а также о методах оценки их количества, рассмотрены причины подавления катализируемой системой NER эксцизии объемных повреждений из состава кластеров.

Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) играет важную роль в жизни и прокариот, и эукариот – как низших (дрожжи и грибы), так и высших (млекопитающие). В геномах архей гены DAAO пока не найдены. При этом даже внутри одной группы организмов (бактерии, дрожжи и грибы, млекопитающие) DAAO характеризуются очень низкой гомологией аминокислотных последовательностей. Особенно это выражено у бактериальных DAAO. Высокая вариабельность первичных структур DAAO сильно ограничивает поиск генов новых ферментов в известных геномах. В результате многие гены DAAO (если не большинство) остаются или неаннотированными, или неправильно аннотированными. Нами предложен подход, в котором биоинформатические методы в сочетании с анализом общей структуры и структуры активного центра используются для подтверждения того, что найденный ген кодирует именно оксидазу D-аминокислот и предсказания возможного типа ее субстратной специфичности. С помощью поиска по гомологии получают набор кандидатных последовательностей, проводят моделирование третичной структуры отобранных ферментов и сравнивают их с экспериментальными и модельными структурами известных DAAO. Показана эффективность предложенного подхода для дискриминации DAAO и глициноксидаз. С использованием этого подхода в шести штаммах экстремофильных бактерий найдены гены новых DAAO, и впервые в мире один ген идентифицирован в геноме галофильных архей. Предварительные эксперименты подтвердили предсказанную специфичность DAAO из Natronosporangium hydrolyticum ACPA39 в отношении D-Leu и D-Phe.

Комплексный анализ фенотипа клеток воспалительного инфильтрата опухолевой стромы является перспективным направлением молекулярной онкологии. Также крайне актуальным представляется изучение не только мембраносвязанных форм различных молекул, связанных с иммунной регуляцией, но и их растворимых форм. Проведен комплексный анализ тканевых и циркулирующих форм белков PD-1 и PD-L1, а также макрофагов и В-клеток стромы злокачественных опухолей желудка для оценки их клинической и прогностической значимости. Проведен иммуноферментный и иммуногистохимический анализ 63 образцов опухолей и плазмы крови от больных раком желудка. Показано, что злокачественные опухоли желудка сильно инфильтрированы В-клетками, количество которых сравнимо с содержанием макрофагов. Обнаружена ассоциация экспрессии PU.1 с размером опухоли, а именно, опухоли большего размера содержат меньше PU.1+ инфильтрирующих клеток (p = 0.005). Не выявлено клинической значимости CD20+ и CD163+ клеток, однако их количество в строме было больше на более ранних стадиях заболевания и при отсутствии метастазов. Показано также, что содержание PD-L1 в опухолевых клетках не ассоциировано с клиническими и морфологическими характеристиками рака желудка, в то время как экспрессия PD-L1 в стромальных клетках опухоли ассоциирована с наличием отдаленных метастазов. Анализ прогностической значимости исследованных маркеров показал, что CD163 статистически значимо ассоциирован с неблагоприятным прогнозом данного заболевания (p = 0.019). Отмечена также тенденция к благоприятному прогнозу в случае экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках (p = 0.122). Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности изучения растворимых и тканевых маркеров опухолевой стромы для прогнозирования течения рака желудка. Актуальным представляется поиск комбинаций маркеров, комплексный анализ которых поможет персонализировать современную противоопухолевую терапию.

Известно, что мозговой нейротрофический фактор (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) вовлечен в патогенез болезни Альцгеймера (БА). Однако фармакологическое использование полноразмерного нейротрофина затрудняет его макромолекулярная белковая природа. В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова создан дипептидный миметик BDNF – ГСБ-214 (гептаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-метионил-L-серина), активирующий in vitro TrkB, PI3K/Akt и PLC-γ1. ГСБ-214 проявил нейропротекторную активность при транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у крыс (в дозе 0.1 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б)) и улучшил память в тесте распознавания нового объекта (0.1 и 1.0 мг/кг, в/б). Изучено влияние ГСБ-214 на память в условиях скополаминовой и стрептозотоциновой моделей БА в связи с активацией рецепторов TrkB. БА моделировали хроническим в/б введением скополамина или однократным введением стрептозотоцина в желудочки мозга крыс. ГСБ-214 вводили в течение 10 дней после окончания введения скополамина в дозах 0.05, 0.1 и 1 мг/кг (в/б) или в течение 14 дней после введения стрептозотоцина в дозе 0.1 мг/кг (в/б). Эффект дипептида оценивали в тесте распознавания нового объекта, зависимость мнемотропного действия от Trk-рецепторов выявляли, используя соединение K252A – специфический блокатор нейротрофиновых Trk-рецепторов. ГСБ-214 в дозах 0.05 и 0.1 мг/кг статистически значимо предотвращал вызванное скополамином ухудшение долговременной памяти и не влиял на кратковременную. На стрептозотоциновой модели ГСБ-214 полностью устранял ухудшение кратковременной памяти. Мнемотропный эффект ГСБ-214 не регистрировался при блокаде Trk-рецепторов K252A.

В 2022 году во многих странах за пределами африканского континента начала распространяться инфекция, вызываемая вирусом оспы обезьян, что с новой силой привлекло внимание медиков и ученых к вопросу о необходимости вакцинации против данной инфекции. Вакцинацию имеющейся в России оспенной вакциной первого поколения на основе штамма LIVP вируса осповакцины (VACV) рекомендовано проводить методом трансэпидермальной инокуляции (скарификации кожи, с/к). Однако многолетний опыт показал, что этот метод не обеспечивает высокой надежности введения вируса в кожу пациентов. Альтернативой методу с/к может быть интрадермальная (внутрикожная, в/к) инъекция вакцины. Эффективность в/к вакцинации может зависеть от места инъекции вируса. В данной работе сравнили развитие гуморального и клеточного иммунных ответов на введение штамма LIVP VACV мышам линии BALB/c в один и тот же район хвоста методами в/к или с/к. В обоих случаях использовали дозу вируса, равную 10⁵ БОЕ. Не выявлено статистически значимых различий в динамике и уровне продукции VACV-специфичных IgM и IgG при использовании обоих методов вакцинации. ELISpot-анализ спленоцитов вакцинированных мышей показал, что в/к введение VACV LIVP индуцирует достоверно больший Т-клеточный иммунный ответ, чем с/к инокуляция. Для оценки протективности на 45 день после иммунизации мышей интраназально инфицировали высоколетальными дозами вируса оспы коров (CPXV) или эволюционно далеко отстоящим от VACV и CPXV вирусом эктромелии (ECTV). Оба метода вакцинации обеспечивали полную защиту мышей от заражения CPXV, но в группе в/к иммунизированных мышей, инфицированных ECTV, выжило 50% мышей, а в группе с/к иммунизированных – 17%. Таким образом, в/к инъекция VACV может обеспечивать более надежную иммунную защиту от ортопоксвирусных инфекций по сравнению с классической с/к техникой.