Повреждения ДНК при тепловом стрессе

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Тепловой стресс (тепловой шок, гипертермия) - один из наиболее хорошо изученных комплексных стресс факторов. В реакции клетки на тепловой стресс уча ствует большинство субклеточных компартментов и метаболических процессов [1-3]. Давно известно, что клетки, подвергнутые тепловому стрессу, обла дают повышенной чувствительностью к агентам, ин дуцирующим двухцепочечные разрывы ДНК (ДЦР), в частности к ионизирующей радиации [4, 5]. Это явление получило название «температурная радио чувствительность». Предполагалось, что причина этого эффекта заключается в способности теплового стресса ингибировать системы репарации ДНК [5]. Действительно, за несколько десятилетий обнару жено, что тепловой стресс способен ингибировать ключевые компоненты практически всех систем ре парации (рисунок). Тепловой стресс подавляет ак тивность систем эксцизионной репарации основа ний (BER, base excision repair) [6-9] и нуклеотидов (NER, nucleotide excision repair) [10, 11]. Наиболее изучено действие теплового стресса на эксцизион ную репарацию оснований: тепловой стресс может непосредственно инактивировать ДНК-полимеразу ? и некоторые ДНК-гликозилазы [6, 9]. Недавно по лучили свидетельства того, что тепловой стресс мо жет также ингибировать систему репарации оши бочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair) [12]. Наибольший вклад в температурную радиочувстви тельность вносит подавление систем репарации ДЦР, которое происходит при тепловом стрессе. Известно, что тепловой стресс подавляет работу систем как не гомологичного соединения концов ДНК (NHEJ, nonhomologous end joining), так и гомологичной реком бинации (HR, homologous recombination). В случае NHEJ влияние теплового стресса ограничивается комплексом ДНК-зависимой протеинкиназы (DNAPK): показано, что гипертермия может приводить к агрегации гетеродимера Ku70/80 (и соответственно к уменьшению его ДНК-связывающей активности), подавлению экспрессии Ku80 и/или к ингибирова нию каталитической субъединицы DNA-PK [13-15]. Иначе обстоит дело с HR - тепловой стресс способен ингибировать эту систему репарации на нескольких ключевых этапах [16]. Вопросам влияния гипертер мии на системы репарации высших эукариот посвя щен недавно опубликованный обзор П.М. Кравчик и соавт. [17], к которому мы и адресуем читателей. Основным же предметом нашего мини-обзора будет вопрос о прямых повреждениях ДНК, которые спосо бен индуцировать тепловой стресс (рисунок). ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ Тепловой стресс может не только ингибировать си стемы репарации ДНК, но и выступать в качестве по вреждающего ДНК агента. Так, известно, что тепло вой стресс может приводить к накоплению в клетке 8-оксогуанина, дезаминированного цитозина и апу риновых участков ДНК (AP-сайтов) [18-20]. Можно представить, что подобные повреждения ДНК, как и одноцепочечные разрывы ДНК (ОЦР), пассивно накапливаются в клетке в результате ингибирования тепловым стрессом систем эксцизионной репарации. Более интересным и дискуссионным является вопрос о природе индуцированных тепловым стрессом ДЦР в ДНК, а также о возможности активной индукции тепловым стрессом ОЦР. Долгое время считалось, что тепловой стресс не индуцирует ДЦР, а приводит только к возникновению ОЦР, которые образуются в результате ингибирования гипертермией процес са репликации ДНК [21-23]. С помощью несколь ких комплементарных подходов (метод ДНК-комет, флуоресцентное мечение разрывов с помощью ДНК полимеразы I) мы показали, что тепловой стресс дей ствительно индуцирует ОЦР в клетках, находящих ся в S-фазе клеточного цикла [24]. В той же работе показано, что гипертермия способна ингибировать репликацию ДНК: в зависимости от температуры и клеточной линии тепловой стресс приводит либо к замедлению, либо к аресту репликативных вилок [24]. Стоит, однако, отметить, что возникновение ОЦР в S-фазных клетках не связано с ингибированием тепловым стрессом репликации ДНК [25]. Недавно мы идентифицировали механизм возникновения ОЦР при тепловом стрессе. Оказалось, что тепловой стресс индуцирует ОЦР путем ингибирования ДНК топоизомеразы I (top1), фермента, релаксирующего супервитки в молекуле ДНК, внося временный ОЦР [25]. В ходе каталитического цикла top1 происходит разрезание одной цепи ДНК и образование промежу точного ковалентно связанного комплекса фермента с ДНК. Стабилизация такого комплекса является ос новным механизмом генотоксического действия ядов top1 (например, камптотецина и его производных) [26, 27]. Тепловой стресс (45°С) не только способен подавлять каталитическую активность фермента, он приводит к накоплению в клетке ковалентно свя занных комплексов top1 и ДНК. Можно заключить, что действие гипертермии на top1 схоже с действи ем ядов, с той лишь разницей, что тепловой стресс, вероятно, подавляет активность top1 на всех стади ях каталитического цикла. Хотя известно, что tор1 может связываться с уже существующими в клет ке ОЦР [28, 29], в случае теплового стресса именно она является причиной их возникновения. Наиболее убедительные доказательства этого получены в опы тах по подавлению экспрессии фермента с помощью РНК-интерференции [25]. Показано, что в условиях сниженной экспрессии top1 не активируется про грамма клеточного старения, зависящего от индук ции ОЦР и их конвертации в персистирующие ДЦР [25]. Это свидетельствует о том, что в клетках, не экс прессирующих top1, не происходит образования ОЦР при тепловом стрессе. Таким образом, роль top1 в образовании индуцированных тепловым стрес сом ОЦР кажется нам вполне очевидной. Интересно также и то, что в клетках HeLa ковалентно связан ные комплексы top1 с ДНК эффективно образуются только при температурах выше 44°С. Таким образом, при клинически релевантных температурах - 41- 43°С - не должно происходить образования ОЦР. Тот факт, что возникновение ОЦР при тепловом стрес се в основном наблюдается в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла, обусловлен тем, что ос новная функция top1 - разрешение топологических проблем, возникающих в ходе репликации ДНК. Можно утверждать, что чувствительность неделя щихся клеток (терминально дифференцированных, арестованных на стадии G0 и т.д.) в смысле возникно вения ОЦР должна быть существенно снижена. Она не может полностью отсутствовать, так как функции top1 в клетке не ограничены процессом реплика ции ДНК. В связи с этим стоит отметить, что индук ция тепловым стрессом ОЦР, вероятно, происходит не только в S-фазе клеточного цикла - ОЦР возни кают и в G1- и G2-фазах, однако с крайне малой ча стотой. Согласно нашим неопубликованным данным, количество возникающих ОЦР при тепловом стрессе в разных клеточных линиях напрямую коррелирует с уровнем экспрессии top1. Суммируя полученные данные, можно утверждать, что тепловой стресс ин гибирует активность top1 in vivo и приводит к фор мированию ковалентно связанных комплексов между ферментом и ДНК и, как следствие, к образованию ОЦР. ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ Возникающие при тепловом стрессе ОЦР служат источником образования ДЦР. Такие ДЦР обладают несколькими интересными характеристиками - они специфичны для S-фазы клеточного цикла и воз никают в клетке не сразу после воздействия тепло вого стресса, а спустя 3-6 ч [25]. Эти отсроченные ДЦР возникают вследствие столкновения реплика тивных вилок, возобновивших движение после ин дуцированного тепловым стрессом ареста, с ОЦР, которые образуются в результате ингибирования top1 [25]. Замедленная кинетика образования таких ДЦР, с одной стороны, связана с ингибированием при тепловом стрессе репликации ДНК, а с другой, с подавлением процесса транскрипции [25]. Процесс активной транскрипции необходим для детекции и последующего снятия комплекса top1, ковалент но связанного с ДНК, что приводит к демаскирова нию ОЦР и создает возможность для столкновения с ними репликативных вилок [30, 31]. Судя по всему, отсроченные ДЦР эффективно распознаются кле точными системами, о чем свидетельствуют ATM/ ATR-зависимое фосфорилирование H2AX (маркер ДЦР) и последующее привлечение других факторов репарации к сайту разрыва (53BP1, Rad51 и др.). Тем не менее репарация таких повреждений не происхо дит, что приводит к существованию в клетке посто янного сигнала о повреждении ДНК и, как следствие, к запуску программы преждевременного клеточного старения [25, 32]. Таким образом, нами впервые установлен меха низм формирования отсроченных ДЦР в результате действия теплового стресса. Однако вопрос о том, может ли тепловой стресс немедленно индуциро вать ДЦР, долгое время оставался дискуссионным. В течение последних лет в разных лабораториях показано, что тепловой стресс может индуциро вать фосфорилирование гистона H2AX [33-37], яв ляющееся одним из первых событий в процессах узнавания и репарации ДЦР [38, 39]. Тем не менее интерпретация этих результатов достаточно про тиворечива: некоторые утверждают, что фокусы ?H2AX маркируют ДЦР, индуцированные темпера турой [34, 37]; другие склонны считать, что тепловой шок сам по себе не приводит к повреждению ДНК, а ?H2AX в этом случае является побочным продук том клеточного ответа на стресс [33, 35, 36]. Недавно нами доказана способность гипертермии провоци ровать образование ДЦР [24, 40]. Это подтвержде но с использованием двух независимых подходов: метода ДНК-комет и техники мечения концов ДНК терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой. Однако эффект температурной индукции ДЦР ха рактерен только для клеток, находящихся в G1 и G2-фазах клеточного цикла. Эти ДЦР маркиру ются ATM-зависимым фосфорилированием H2AX [24]. Интересно, что сразу после воздействия ги пертермии не наблюдается привлечения к фокусам ?H2AX других факторов репарации, в частности белка 53BP1 [24, 41]. В то же время такие ДЦР до статочно эффективно репарируются в течение пер вых 3-6 ч после теплового стресса. Вероятно, это означает, что активная репарация индуцирован ных тепловым стрессом ДЦР начинается не сразу после воздействия, а спустя некоторое время после функционального восстановления ингибированных тепловым стрессом систем репарации. До сих пор, однако, не ясно, каков механизм (медиатор) немед ленного формирования ДЦР в условиях теплового стресса. В качестве возможных кандидатов на эту роль можно рассматривать такие процессы, как ак тивация ретроэлементов [42, 43], генерация актив ных форм кислорода [18], остановка транскрипции [44, 45]. Выше перечислены процессы, которые, как известно, могут приводить к образованию ДЦР и, при определенных условиях, происходить при тепловом стрессе. Тем не менее ни одна из этих гипотез не может убедительно объяснить индук цию тепловым стрессом ДЦР в не-S-фазных клет ках. На наш взгляд, наиболее вероятный механизм формирования индуцированных тепловым стрес сом ДЦР состоит в подавлении активности ДНК топоизомеразы II (top2), фермента, изменяющего топологию ДНК путем внесения временных ДЦР [46]. Такие разрывы сопровождаются образованием ковалентной связи между молекулой белка и одним из концов цепи ДНК. Ингибирование top2 на стадии ковалентно связанного комплекса приводит к обра зованию ДЦР [46]. Достаточно давно получены дан ные о том, что тепловой стресс может ингибировать активность top2 in vitro [47]. Тот факт, что тепло вой стресс может снижать генотоксический потен циал ядов top2, также свидетельствует о влиянии гипертермии на этот фермент [48]. Существуют две изоформы top2, причем экспрессия одной из них за висит от стадии клеточного цикла [49, 50]. Такая ди намика экспрессии могла бы легко объяснить зави симость индукции ДЦР от фазы клеточного цикла. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Подводя итог, можно утверждать, что, помимо ком плексного подавления почти всех систем репарации в клетках высших эукариот, тепловой стресс напря мую приводит к образованию различных поврежде ний ДНК. Интересно, что тип и судьба индуцируемых тепловым стрессом повреждений зависят от стадии клеточного цикла, на которой клетка подверглась действию высоких температур. Так, в S-фазе клеточ ного цикла гипертермия приводит к top1-зависимому образованию ОЦР, часть из которых спустя несколь ко часов может конвертироваться в сложно репа рируемые ДЦР. В то же время тепловой стресс не медленно индуцирует ДЦР в клетках, находящихся на стадии G1 или G2 клеточного цикла. Несмотря на то что в общем виде описываемая схема действия теплового стресса характерна для всех проанализи рованных нами клеточных линий, стоит все же иметь в виду, что количество разрывов и степень репараци онного ответа клетки могут очень сильно варьировать в зависимости от силы теплового стресса и типа (ли нии) клеток.

Об авторах

O. Л. Кантидзе

Институт биологии гена РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kantidze@gmail.com
Россия

A. K. Величко

Институт биологии гена РАН

Email: kantidze@gmail.com
Россия

A. В. Лужин

Институт биологии гена РАН

Email: kantidze@gmail.com
Россия

С. В. Разин

Институт биологии гена РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: sergey.v.razin@usa.net
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы