Том 8, № 4 (2016)

Теломераза - один из ключевых компонентов аппарата поддержания длины концов линейных хромосом эукариот - теломер. В результате удаления затравки, используемой для репликации ДНК, линейные хромосомы укорачиваются в каждом раунде деления. На концах линейных хромосом находятся специальные повторяющиеся теломерные последовательности, которые предотвращают потерю генетической информации в результате недорепликации. В соматических клетках высших эукариот теломеры укорачиваются, пока не становятся настолько короткими, что уже не могут выполнять свою функцию. В таких обстоятельствах клетка претерпевает кризис и, как правило, погибает. В редких случаях происходит активация теломеразы, и клетка приобретает неограниченный потенциал деления. Некоторые клетки (половые, эмбриональные, стволовые, а также соматические клетки с высоким пролиферативным потенциалом) поддерживают теломеразную активность, необходимую им для выполнения своих функций. В большинстве соматических клеток теломераза не активна. Для активности теломеразы in vitrо необходимы два основных компонента - теломеразная обратная транскриптаза и теломеразная РНК. Реактивация теломеразы в раковых клетках происходит в результате восстановления экспрессии гена обратной транскриптазы. Экспрессия теломеразной РНК в большинстве клеток человека конститутивна, что позволяет предполагать другие функции этой РНК, еще недостаточно изученные. Настоящий обзор посвящен биогенезу теломеразных РНК дрожжей и человека. Мы решили остановиться именно на этих организмах ввиду того, что в последние годы произошел прорыв в изучении процессинга теломеразных РНК разных видов дрожжей и человека.

В последнее десятилетие прогресс в методах визуализации живых систем с помощью флуоресцентных маркеров был в основном связан с обнаружением различных вариантов цветных флуоресцентных белков. Применение этих белков имеет свои ограничения. В ряде случаев предпочтительно использовать флуоресцентные зонды на основе небольших органических молекул. В обзоре рассмотрен арсенал синтетических низкомолекулярных флуорофоров, который перекрывает практически весь спектр от УФ до видимой и ближней инфракрасной области. Приведены данные по сайт-направленным реакциям включения синтетических флуорофоров в целевые клеточные белки. Обсуждается применение низкомолекулярных флуорофоров для решения различных биологических задач, в частности, для определения локальных концентраций ионов и рН в живых системах.

Многие процессы жизнедеятельности клетки связаны с перестройкой биологических мембран. Семейство BAR-доменных белков играет ключевую роль в формировании и детекции локальных изгибов мембран и привлечении к мембранам других белков, в том числе регулирующих перестройки актинового цитоскелета. Основываясь на структурных и филогенетических свойствах, BAR-домены принято делить на несколько групп, по-разному воздействующих на мембраны и выполняющих разные функции в клетке. Однако в последнее время появляется все больше свидетельств функциональных различий даже в пределах одной группы этого семейства. В настоящем обзоре рассмотрены принципы взаимодействия различных групп BAR-доменов и их отдельных представителей с мембранами.

Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, заключающаяся в мультиферментативном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды c использованием ферментов нуклеинового обмена термофильных микроорганизмов (рибокиназы, фосфорибозилпиро- фосфатсинтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы). Клонирован ген рибокиназы термофильного микроорганизма Thermus sp. 2.9, два разных гена фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы) и ген аденин-фосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) из Thermus thermophilus HB27. Получены высокопродуктивные штаммы-продуценты Escherichia coli, разработаны методы выделения упомянутых ферментов, изучена их субстратная специфичность. Показана возможность использования этих фер- ментов для превращения D-пентоз в 5-фосфаты, а затем под действием рибокиназы и PRPP-cинтетаз - в 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты, конденсация которых с аденином и рядом его структурных аналогов, катализируемая APR-трансферазой, приводила к получению искомых нуклеотидов. На примере 2-хлор(фтор)-аденозинмонофосфата (2Cl-AMP и 2F-AMP) показана возможность использования системы термофильных ферментов в одном реакционном объеме для получения биологически активных нуклеотидов из D-рибозы и соответствующих гетерооснований в присутствии ATP, рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы.

Нестабильность клонального состава популяции опухолевых клеток при острых лимфобластных лейкозах (ОЛЛ) усложняет процесс контроля минимальной остаточной болезни (МОБ) и эффективности терапии по установленным в дебюте заболевания мишеням, специфичным для данного пациента. Основные работы, в которых изучали эволюцию опухолевых клеток со сменой клональных реаранжировок генов TCR и IG в рецидиве заболевания, выполнены на детских ОЛЛ. Данные для взрослых больных ОЛЛ ограничены,тогда как ОЛЛ у взрослых и детей имеют различия в особенностях биологии и прогноза заболевания. Цель нашей работы состояла в изучении клональных реаранжировок генов IG и TCR и их стабильности у взрослых больных с ОЛЛ. Реаранжировки выявляли методом ПЦР по протоколу BIOMED-2 с последующим анализом фрагментов. У 83% пациентов выявили несоответствие клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве заболевания. Клональная эволюция может быть одним из механизмов опухолевой прогрессии. Не исключена изначальная неоднородность состава опухолевых клеток, и в то время как одни клоны исчезают под воздействием терапии, другие, не распознанные из-за недостаточной чувствительности метода, приобретают способность к пролиферации. Кроме того, в течение заболевания реаранжировки могут меняться благодаря сохраняющейся активности рекомбиназного комплекса, что приводит к появлению опухолевых клонов de novo. Изучение механизмов клональной эволюции, способности терапии влиять на процессы клональной эволюции позволит выделить новые прогностические факторы, разработать тактику диагностики МОБ, расширит современные представления о механизмах онкогенеза.

Изучена возможность возбуждения фототоксичного флавопротеида miniSOG (фотосенсибилизатора) в раковых клетках в результате биолюминесценции, вызванной окислением субстрата фуримазина люциферазой NanoLuc, и оценена индуцированная фототоксичность in vitro. Показано, что в присутствии субстрата фуримазина люцифераза NanoLuc, введенная в составе генетической конструкции, содержащей miniSOG, в эукариотические клетки, вызывает возбуждение фототоксичного флавопротеида miniSOG. При этом miniSOG проявляет фотоиндуцированную цитотоксичность, и смертность клеток в стабильно трансфицированной линии составляет 48%.

Законодательное регулирование в России сегодня катастрофически отстает от уровня развития генной инженерии. Только взвешенный и научно обоснованный подход к позиционированию организмов, полученных с применением различных генно-инженерных технологий, а также к оценке рисков, связанных с ними, позволит эффективно использовать результаты передовых технологий генной инженерии в экономике. В отсутствие востребованности этих результатов в практическом секторе сложившаяся ситуация приведет к отставанию в научных исследованиях и к потере имеющихся сегодня компетенций.