Таргетинг внеклеточных везикул к дендритным клеткам и макрофагам

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: АПК – антигенпрезентирующие клетки; ВВ – внеклеточные везикулы; ДК – дендритные клетки; МФ – макрофаги; МНК – мононуклеарные клетки; ОБМ – основной белок миелина; РС – рассеянный склероз; GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; IL – интерлейкин; VSV-G – гликопротеид G везикулярного вируса стоматита (vesicular stomatitis virus G).

ВВЕДЕНИЕ

Стремительное развитие современной биомедицины предполагает создание терапевтических препаратов, обладающих высокой селективностью и низкой токсичностью. Появление таких препаратов требует не только разработки высокоактивных терапевтических компонентов, но и обеспечение их эффективной доставки к определенным органам, тканям и клеткам-мишеням [1, 2]. Существенный прогресс в области адресной доставки препаратов достигнут с помощью антитело-направленной терапии, дарпинов и использования наночастиц [3–6]. Использование внеклеточных везикул (ВВ) в качестве носителей белковых молекул имеет ряд таких преимуществ, как (1) природная биосовместимость клеточной мембраны и мембран ВВ, (2) способность ВВ проникать через гематоэнцефалический барьер, (3) возможность изменения белкового состава мембраны ВВ [7]. Модификация белкового профиля мембран ВВ позволяет осуществлять адресную доставку терапевтического содержимого ВВ внутрь желаемых клеток-мишеней [8, 9].

Предшественниками ВВ в области направленной доставки терапевтических препаратов и первыми наиболее подробно изученными носителями являются липосомы. Многие препараты, относящиеся к данной категории, успешно прошли клинические испытания и введены в клиническую практику [10–12]. Один из перспективных препаратов для лечения рассеянного склероза (РС) на основе липосом – Ксемус [13–15], состоящий из маннозилированных липосом, нагруженных иммунодоминантными пептидами основного белка миелина (ОБМ). Терапевтические пептиды доставляются направленно в антигенпрезентирующие клетки (АПК) – дендритные клетки (ДК) и макрофаги (МФ) – за счет остатков маннозы на поверхности липосом. Предполагаемый механизм действия заключается в гиперпрезентации доставляемых фрагментов ОБМ в составе главного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности АПК, что и вызывает иммуносупрессию и подавление аутоиммунного воспаления. Ксемус успешно прошел доклинические испытания и II стадию клинических испытаний. Предполагается проведение фазы III клинических испытаний для получения разрешения на применение на территории Российской Федерации. Однако при РС необходимо регулярное пожизненное поступление таких липосом в организм, что сопряжено с определенными экономическими трудностями и неудобством для пациентов. Более удобными носителями фрагментов ОБМ для длительной терапии пациентов с РС могут оказаться ВВ. Опираясь на существующие методы получения ВВ [16], можно создать генетически кодируемый препарат ВВ, нагруженных пептидами ОБМ. Использование аутологичных клеток человека в качестве клеток-продуцентов позволит совершить переход к персонализированной медицине и избежать необходимости в постоянных инъекциях, снижающих качество жизни [17].

В представленной работе описана система адресной доставки содержимого ВВ к АПК. По аналогии с препаратом Ксемус выбран поверхностный маркер ДК и МФ – CD206 (маннозный рецептор) [18]. Данный рецептор связывает гликоконъюгаты, оканчивающиеся остатками маннозы, фукозы или N-ацетил-D-глюкозамина, присутствующие в больших количествах на поверхности патогенных микроорганизмов [19]. Конформационные изменения, возникающие в рецепторе при взаимодействии с остатком маннозы, приводят к интернализации связанного патогена и его транспорту в лизосомы [20], что объясняется высоким уровнем экспрессии данного рецептора на ДК и МФ – классических АПК иммунной системы человека. Нами разработана система наработки ВВ, несущих на своей поверхности наноантитело ламы, специфичное к CD206 человека и мыши. Эти везикулы имеют размер порядка 100–140 нм и несут экзосомальные маркеры [7]. Мы показали возможность доставки целевого белка в клетки-мишени при использовании таргетированных везикул, а также доставки целевого белка в ДК и МФ человека. Полученные данные позволят использовать стратегию нацеливания генетически кодируемых везикул в АПК для разработки препаратов, направленных на коррекцию иммунного ответа у пациентов с аутоиммунными, вирусными и онкологическими заболеваниями.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Плазмиды

Для получения конструкции pCMV-NanoLuc-Jun (Addgene ID: 167308) ген, кодирующий люциферазу NanoLuc, амплифицировали с праймеров For_NanoLuc и Rev_NanoLuc (таблица) и лигировали в вектор pCMV-Jun по сайтам рестрикции HindIII/KpnI. Последовательность, кодирующая укороченный VSV-G (pCMV-VSV-G_truncated) (аминокислотная последовательность: EHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFII-GLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK), амплифицирована с полноразмерного VSV-G (AddgeneID: 138479) с праймеров For_VSVG_trunc и Rev_VSVG_trunc (таблица) и клонирована в вектор pCMV по сайтам BstBI/ClaI.

 

Праймеры, использованные для создания конструкций

Праймер	Нуклеотидная последовательность
For_CD206	5’-TGGGGTGAATTGCTTCGGAAGTCAGGTTCAACTGCAGGAGTC-3’
Rev_CD206	5’-GAATGTGAGGATGTTCGAAGCTGCCTCCTCCTGAGC-3’
For_NanoLuc	5’- TCTGGTACCATGGTCTTCACACTCGAA-3’
Rev_NanoLuc	5’- GGGTGGTGGTGGTGGCAAGCTT -3’
For_VSVG_trunc	5’-GGGGTGAATTGCTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3’
Rev_VSVG_trunc	5’-AGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGCTCC-3’

 

Ген, кодирующий наноантитело ламы α-CD206 (клон 3.49) [21], синтезирован и клонирован на 5’-конец укороченного VSV-G в конструкцию pCMV-VSV-G_truncated для эукариотической экспрессии и в вектор pET22 для прокариотической экспрессии. Для наработки рекомбинантного антитела ламы α-CD206 в прокариотической системе экспрессии на С-конец белка был добавлен гистидиновый эпитоп для аффинной очистки и 3×FLAG-эпитоп для детекции вторичными антителами.

Клеточные линии

Клетки линии HEK293T культивировали в полной среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США); клеточные линии Jurkat и DC2.4 культивировали в полной среде RPMI с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco).

Для получения популяций стимулированных ДК и МФ из периферической крови человека центрифугированием в градиенте фиколла выделяли мононуклеарные клетки (МНК). Полученные клетки инкубировали в полной среде RPMI с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота до тех пор, пока предшественники ДК и МФ не прикрепятся к пластику. После этого неприкрепившиеся клетки удаляли, к прикрепившимся добавляли IL-4 (50 нг/мл) и GM-CSF (100 нг/мл). Дифференцировку МНК в дендритные клетки проводили в течение 6 дней со сменой среды, содержащей свежую порцию цитокинов, каждые 2 дня.

Все клеточные линии культивировали при температуре 37°С и 8% CO₂.

Продукция антитела ламы α-CD206-FLAG в прокариотической системе экспрессии

Рекомбинантное антитело ламы α-CD206 нарабатывали в прокариотической системе экспрессии – в клетках E. coli BL21 (DE3). Ночную культуру клеток инокулировали в среду 2xYT в соотношении 1 : 100 и растили до OD₆₀₀ = 0.6. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида. Культуру инкубировали при высокой аэрации (16 ч, 28°С). Затем центрифугировали при 3500 g в течение 10 мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl pH 8.0; 150 мМ NaCl; 1 мМ PMSF) и добавляли лизоцим до конечной концентрации 0.2 мг/мл. Инкубировали при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет вязким. Для дезинтеграции клеточной массы использовали ультразвук. Полученный раствор центрифугировали при 20000 g в течение 10 мин при 4°С. Надосадочную жидкость фильтровали через 0.45-мкм фильтр, затем наносили на колонку Ni-NTA (Qiagen). Для очистки от примесных белков через колонку пропускали буфер нанесения (50 мМ Трис-HCl pH 8.0; 150 мМ NaCl), затем промывочный буфер с имидазолом (50 мМ Трис-HCl pH 8.0; 150 мМ NaCl; 20 мМ имидазол). Элюировали буферным раствором (50 мМ Трис-HCl pH 8.0; 150 мМ NaCl; 350 мМ имидазол).

Окрашивание ДК и МФ рекомбинантным антителом ламы α-CD206

Возможность использования рекомбинантного антитела ламы α-CD206 для адресной доставки белковых препаратов к АПК верифицировали на ДК и МФ из периферической крови человека. Для этого брали 500000 клеток, отмывали 2 раза в буфере PBS и ресуспендировали в 100 мкл раствора, содержащего 15–300 мкг/мл рекомбинантных антител ламы α-CD206-FLAG. Инкубировали в течение 1 ч при 4°С и постоянном деликатном перемешивании. После инкубации клетки отмывали 2 раза PBS и окрашивали вторичными антителами к эпитопу FLAG, конъюгированными с флуоресцентной меткой PE по протоколу производителя (BioLegend, США). Для контрольного окрашивания использовали антитело к маркеру CD206 человека, конъюгированное с флуоресцентной меткой PE (или α-human α-CD206-PE) (BioLegend). В качестве отрицательного контроля окрашивали клетки линии HEK293T и нестимулированные МНК.

Наработка и очистка внеклеточных везикул

ВВ нарабатывали в клетках линии HEK293T. С этой целью клетки при достижении 90% монослоя трансфицировали одновременно тремя конструкциями: pCMV-VSV-G (или pCMV-VSV-G_truncated или pCMV-α-CD206_VSV-G_truncated), pCMV-EPN, pCMV-NanoLuc. Среду от клеток, содержащую ВВ, собирали через 48 ч и подвергали дифференциальному центрифугированию (300 g 10 мин; 1000 g 20 мин). Далее супернатант фильтровали через мембрану 0.4 мкм и концентрировали с использованием Amicon Ultra-0.5 100 кДа (Millipore, Ирландия). Для избавления от различных примесей концентрат несколько раз промывали буфером PBS. Концентрацию ВВ определяли с использованием набора CBQCA Protein Quantitation Kit (Invitrogen, США).

Инкубация внеклеточных везикул с клетками

ВВ, несущие репортерный белок люциферазу, выравнивали в соответствии с концентрацией белка в препарате, добавляли к 300000 клеток (Jurkat и DC2.4) и инкубировали в течение 2 ч при 37°С и 8% CO₂. В качестве контроля использовали свободную люциферазу NanoLuc-Jun, не загруженную в ВВ. После инкубации клетки промывали PBS при 300 g в течение 10 мин, затем инкубировали в буфере с протеиназой К (Invitrogen) в конечной концентрации 0.1 мг/мл при температуре 37°С в течение 15 мин. После инкубации клетки дважды отмывали в PBS. Cодержание люциферазы в клетках анализировали с использованием набора NanoGlo Luciferase Assay System (Promega, США). На тест брали 30000 клеток и ресуспендировали их в 15 мкл PBS, затем к ним добавляли 15 мкл лизирующего буфера, содержащего субстрат люциферазы. Сигнал детектировали на плашечном ридере VarioScan (Thermo Scientific, США) при 460 нм.

Адресная доставка NanoLuc в ДК и МФ при помощи таргетированных ВВ

К гетерогенной популяции стимулированных ДК и МФ из периферической крови человека добавляли таргетированные ВВ (несущие на своей поверхности укороченный вариант VSV-G, слитый с антителом α-CD206) в концентрации 5–20 мкг/мл. Инкубировали в течение 2 ч при 37°С и 8% CO₂. Затем клетки аккуратно промывали по методике, описанной выше, ресуспендировали в полной среде ДМЕМ и инкубировали еще 16 ч в среде без везикул. Через 16 ч клетки окрашивали антителами к α-CD206-PE человека (BioLegend). Проводили клеточный сортинг на приборе Sony SH800 (Германия). Выделяли две субпопуляции клеток – CD206⁺ и CD206^-. Из каждой субпопуляции брали по 30000 клеток на люциферазный тест.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рекомбинантного антитела, специфичного к поверхностному маркеру дендритных клеток и макрофагов

Для таргетной доставки содержимого генетически кодируемых везикул внутрь АПК мы выбрали поверхностный маркер ДК и МФ (М2) – CD206 (макрофагальный маннозный рецептор) [18]. Нами подобрано кросс-реактивное наноантитело ламы Nb3.49 [21], взаимодействующее с маннозным рецептором человека и мыши. Эта кросс-реактивность чрезвычайно полезна при проведении доклинических испытаний таргетированных внеклеточных везикул на животной модели с возможностью дальнейшего использования этого антитела и при проведении клинических испытаний. Для проверки функциональности и специфичности данного антитела было создано рекомбинантное наноантитело α-CD206-FLAG в прокариотической системе экспрессии на основе вектора pET22. Для детекции и аффинной очистки использовали гистидиновый эпитоп, для дополнительного увеличения чувствительности детекции на N-конец белка добавляли 3×FLAG-эпитоп.

Специфичность полученного наноантитела верифицирована на субпопуляции ДК человека. Для этого мононуклеарные клетки (МНК) из периферической крови человека культивировали в полной питательной среде в присутствии IL-4 и GM-CSF в течение недели с частичной заменой среды каждые 2 дня. При таких условиях в культуре лимфоцитов человека стимулируется дифференцировка ДК и МФ [22]. К полученной культуре ДК добавляли препарат очищенного рекомбинантного наноантитела α-CD206-FLAG, после стадий инкубаций и отмывок добавляли вторичные антитела к FLAG-эпитопу, конъюгированные с флуоресцентной меткой PE (рис. 1). Окрашивание стимулированных МНК человека с использованием рекомбинантного наноантитела α-CD206-FLAG позволило четко детектировать субпопуляцию ДК, сопоставимую с субпопуляцией, выделяемой при окрашивании коммерчески доступным флуоресцентным антителом α-CD206-PE. Таким образом, мы подтвердили функциональность и специфичность α-CD206-FLAG в формате наноантитела ламы, что позволяет использовать его для дальнейшей адресной доставки белковых препаратов при помощи ВВ к АПК.

 

Рис. 1. Цитофлуорометрический анализ окрашивания ДК и МФ периферической крови человека при помощи рекомбинантных антител к поверхностному маркеру CD206. Дифференцировку ДК и МФ из МНК периферической крови человека стимулировали IL-4 и GM-CSF в течение 7 дней. На гистограммах отображен сигнал связывания клеток с рекомбинантным наноантителом α-CD206-FLAG в различных концентрациях с последующей визуализацией сигнала флуоресцентными антителами α-FLAG-PE (бордовый, красный, розовый) или с коммерчески доступным антителом α-CD206-PE (зеленый). Неокрашенные клетки и окрашенные только вторичными антителами (α-FLAG-PE) обозначены серым цветом. На нижней панели изображено контрольное связывание клеточной линии HEK293T с рекомбинантным наноантителом α-CD206-FLAG (голубой). На оси X отложен сигнал флуоресценции, на оси Y – количество зарегистрированных событий. На каждой гистограмме показано количество клеток (%), связавшихся с анализируемыми антителами

 

Доставка содержимого внеклеточных везикул внутрь клеток

Оценка эффективности проникновения терапевтического препарата в клетки-мишени – необходимый этап в разработке носителей белковых препаратов. Наиболее удобно такую оценку можно проводить при использовании флуоресцентных белков или люциферазы в качестве доставляемого препарата. Существенный недостаток флуоресцентных белков – большая молекулярная масса и необходимость использования высокочувствительных методов детекции. В связи с этим, в качестве доставляемого препарата мы использовали люциферазу NanoLuc, обладающую хорошими спектральными характеристиками и небольшим размером (19 кДа).

Поверхность клеток-мишеней покрыта большим количеством мембранных белков, способных опосредовать неспецифичное взаимодействие растворимых белков с клетками-мишенями in vitro, искажая таким образом визуализацию реального распределения доставляемых ВВ между клетками. В своей работе мы минимизируем уровень неспецифического сигнала, опосредованного залипанием растворимой (не заключенной в везикулы) люциферазы, добавляя стадию инкубации клеток с протеиназой К. Внеклеточные везикулы, нагруженные люциферазой, и свободную люциферазу добавляли к клеткам-мишеням. После инкубации в течение 2 ч клетки отмывали от везикул и свободной люциферазы либо только фосфатно-солевым буфером, либо с дальнейшей инкубацией с протеиназой К. Как видно из рис. 2, инкубация клеток с протеиназой К позволяет снизить уровень неспецифичного сигнала по сравнению с клетками, которые инкубировали в буфере без добавления протеиназы К. При этом сигнал, полученный от клеток, инкубированных с ВВ, более чем на порядок выше сигнала, полученного от клеток, инкубированных со свободной люциферазой. Использование протеиназы К на стадиях отмывки подтверждает, что доставляемая люцифераза проникает внутрь клеток, а не залипает на мембране. Таким образом, нам удалось обеспечить доставку люциферазы внутрь клеток с использованием внеклеточных везикул и оптимизировать условия детекции данного сигнала.

 

Рис. 2. Инкубация клеток-мишеней с внеклеточными везикулами, загруженными NanoLuc-люциферазой. Подобраны условия детекции сигнала доставляемых внутрь клеток ВВ, загруженных люциферазой. Неспецифичный сигнал от свободной люциферазы NanoLuc, залипающей на клетках, детектируется при использовании отмывок только с буфером PBS (серые столбцы), добавление стадии инкубации с протеиназой К (зеленые столбцы) позволяет в дальнейшем детектировать сигнал только от люциферазы, доставленной внутрь клеток. Для детекции NanoLuc, доставленного к клеткам, использовали люциферазный тест

 

Основной компонент, определяющий способность внеклеточных везикул проникать внутрь клетки-мишени – вирусный гликопротеид VSV-G, который связывается с рецепторами липопротеинов низкой плотности, присутствующими в большом количестве на поверхности клеток млекопитающих [23]. Таким образом, используя полноразмерный VSV-G для доставки содержимого везикул внутрь клеток-мишеней, невозможно достичь высокой специфичности адресной доставки. В своей работе мы добились увеличения специфичности адресной доставки при использовании укороченного варианта VSV-G. В данном варианте VSV-G присутствует только стержневая часть белка [24], отвечающая за отпочковывание внеклеточных везикул от клетки-продуцента и освобождение содержимого везикулы внутри клетки-мишени. При этом становится возможным использование укороченной последовательности VSV-G, объединенной с рекомбинантным наноантителом, способным к высокоспецифическому взаимодействию с клеткой-мишенью, без потери функциональности получаемых внеклеточных везикул. Для проверки эффективности доставки препарата внутрь клеток мы использовали ВВ, загруженные люциферазой NanoLuc, несущие на своей поверхности различные варианты VSV-G: (1) полноразмерный VSV-G, (2) укороченный VSV-G, (3) укороченный VSV-G с экспонированным на поверхности наноантителом, специфически узнающим маркер дендритных клеток и макрофагов – CD206 (рис. 3).

 

Рис. 3. Схематическое изображение генетически кодируемой везикулы с различными вариантами VSV-G на поверхности. 1 – полноразмерный VSV-G, 2 – укороченный VSV-G, 3 – укороченный VSV-G с экспонированным наноантителом α-CD206

 

Для проверки функционирования везикул, несущих различные варианты гликопротеида VSV-G, использовали линию дендритных клеток мыши DC2.4 и линию Jurkat (иммортализованные Т-клетки человека). Клетки инкубировали с различными вариантами везикул либо с раствором свободной люциферазы и отмывали в присутствии протеиназы К. Относительные значения интенсивности люминесценции, полученные с использованием люциферазного теста, приведены на рис. 4. В данном эксперименте значения, полученные при инкубации клеток с препаратом везикул, несущих полноразмерный VSV-G, приняты за 100%, так как именно в этом случае наблюдается максимальное взаимодействие везикул и клеток-мишеней. Использование укороченной формы VSV-G в 5–10 раз снижает эффективность доставки люциферазы в клетки-мишени. Это связано с тем, что нарушается функция распознавания рецептором липопротеинов низкой плотности. Подстановка наноантитела α-CD206 к укороченному VSV-G позволила добиться существенного увеличения целевой доставки белка в клетки-мишени. При этом при использовании антитела α-CD206 наблюдается более эффективная доставка белка к дендритным клеткам DC2.4, чем к клеткам Jurkat.

 

Рис 4. Сравнение эффективности доставки целевого белка внутрь клеток-мишеней при использовании внеклеточных везикул, загруженных люциферазой NanoLuc и несущих на своей поверхности различные варианты вирусного гликопротеида VSV-G. Анализ проводили на клеточных линиях DC2.4 (зеленые столбцы) и Jurkat (синие столбцы). Эффективность доставки при использовании внеклеточных везикул с полноразмерным VSV-G принята за 100% для каждой клеточной линии. В качестве контроля использовали свободную люциферазу NanoLuc, не загруженную внутрь везикул (образец «NanoLuc»)

 

В дальнейшем внеклеточные везикулы планируется использовать для направленной доставки терапевтических препаратов в организме человека. Однако использование линейных клеточных линий не позволяет достоверно воспроизводить реальное распределение АПК и уровень экспрессии маркеров на клеточной поверхности. Для доказательства функциональности разработанных таргетированных внеклеточных везикул с укороченным VSV-G в условиях гетерогенной популяции клеток мы использовали МНК периферической крови человека, в которых стимулировали дифференцировку ДК и МФ. Препарат таргетированных внеклеточных везикул, загруженных люциферазой, инкубировали с данной гетерогенной популяцией клеток, содержащей клетки CD206⁺ и CD206^-. Далее анализируемые клетки отмывали, окрашивали флуоресцентным антителом α-CD206-PE и разделяли на две субпопуляции – CD206⁺ и CD206^- с использованием проточной цитофлуорометрии. Содержание люциферазы, доставленной внутрь клеток-мишеней, определяли отдельно в субпопуляциях клеток CD206⁺ и CD206^-. Нам удалось достигнуть высокой специфичности доставки люциферазы преимущественно в клетки CD206⁺ (рис. 5).

 

Рис. 5. Направленная доставка целевого белка внутрь клеток-мишеней при помощи таргетированных внеклеточных везикул. Таргетированные α-CD206 внеклеточные везикулы, загруженные NanoLuc, инкубировали с мононуклеарными клетками периферической крови человека после стимуляции дифференцировки ДК и МФ. После цитофлуорометрического сортинга субпопуляций CD206+ и CD206- показано, что весь препарат NanoLuc был доставлен к клеткам CD206+. В люциферазном тесте использовали одинаковое количество клеток CD206+ и CD206-

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящий момент одним из основных приоритетов разработок лекарственных препаратов является увеличение селективности доставки. В этом исследовании нами предложен усовершенствованный метод таргетной доставки терапевтических белковых препаратов, заключенных внутрь ВВ. Высокая биосовместимость и биоразлагаемость ВВ дает им огромное преимущество перед искусственными наночастицами. Добавление рекомбинантного антитела ламы α-CD206 к N-концу укороченной формы VSV-G позволяет повысить селективность доставки ВВ преимущественно к CD206⁺ клеткам без значимого снижения уровня продукции данных ВВ. Функциональность разработанных конструкций подтверждена на линейных дендритных клетках DC2.4 мыши и на гетерогенных субпопуляциях стимулированных ДК и МФ периферической крови человека. Полученные данные указывают на возможность использования стратегии нацеливания генетически кодируемых внеклеточных везикул в АПК для создания препаратов, направленных на коррекцию иммунного ответа у пациентов с аутоиммунными, вирусными и онкологическими заболеваниями. Препараты на основе везикул способны доставлять в клетки не только целевые белковые молекулы, но и липиды, нуклеиновые кислоты, транскрипционные факторы [1]. В перспективе подобные таргетные препараты на основе ВВ можно использовать и для нужд генотерапии. В настоящее время разработке и созданию систем доставки на основе ВВ посвящено множество исследований. Такие препараты специфично загружают белками [25], пептидами [26], РНК [27, 28]. При этом остро стоит вопрос переноса не целевых, балластных молекул различных классов в составе продуцируемых ВВ. Попадание нежелательных компонентов внутрь клетки-мишени может серьезно повлиять на биосовместимость препарата и привести к непредсказуемым побочным эффектам. Одним из путей решения данной проблемы является использование аутологичных клеток для наработки везикул [29]. Безопасность применения таких препаратов ВВ подтверждена клиническими испытаниями [30–32]. Однако при создании потенциальных лекарственных средств следует тщательно оценивать долгосрочный эффект от попадания естественного содержимого ВВ в клетки.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 18-74-10079 «Самособирающиеся генетически кодируемые наноконтейнеры как инструмент лечения рассеянного склероза».

Об авторах

Лейла Александровна Овчинникова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: leyla_ovchinnikova@yahoo.com
Россия, 117997, Москва

Иоанна Никитовна Филимонова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ioannishka@gmail.com
Россия, 117997, Москва

Мария Юрьевна Захарова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Российский национальный исследовательский медицинский университет им Н.И. Пирогова

Email: zakharova@ibch.ru
Россия, 117997, Москва; 119049, Москва

Дмитрий Сергеевич Балабашин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: dbalabashin@gmail.com
Россия, 117997, Москва

Теймур Кантамирович Алиев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ta12345@list.ru

Химический факультет

Россия, 117997, Москва; 119991, Москва

Яков Анатольевич Ломакин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: yasha.l@bk.ru
Россия, 117997, Москва

Александр Габибович Габибов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vera.knorre@gmail.com

Химический факультет

Россия, 117997, Москва; 119991, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы