Новое бисульфитное производное окисленного β-циклодекстрина эффективно ингибирует инфекцию, вызванную вирусом гриппа А in vitro и in vivo

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа (ВГ) вызывает развитие респираторных заболеваний, в результате которых ежегодно умирает до 500 000 человек [1]. Возникновение новых лекарственно устойчивых штаммов вируса гриппа и недостаточная эффективность существующих вакцин делают необходимой разработку новых, более эффективных противовирусных соединений для борьбы с этим вирусом. Одними из наиболее перспективных противовирусных соединений являются сульфопроизводные углеводов. Эта группа соединений включает сульфопроизводные олиго- и полисахаридов, содержащих O-сульфатные и/или N-сульфонатные группы. Противовирусные свойства сульфопроизводных углеводов известны давно. Гинзберг и соавт. исследовали антивирусные свойства капсульного полисахарида Klebsiella pneumoniae и показали, что этот полисахарид эффективно подавляет репликацию вируса эпидемического паротита [2]. Сообщалось, что сульфатированные полисахариды, включая β-циклодекстрин, обладают противовирусной активностью в отношении целого ряда вирусов [3-7]. Имеются данные о том, что сульфопроизводные олиго- и полисахаридов, содержащих О-сульфатные группы, обладают высокой противовирусной активностью [8-11]. Показано, что синтетические полимеры N-сульфонатных производных эффективно ингибируют вирус гриппа A in vitro и ex vivo, действуя главным образом на поздних стадиях развития инфекции [12]. Примечательно, что йота-каррагинан - сульфатированный полисахарид, протестирован клинически, разрешен к выпуску и продается в некоторых странах для интраназального применения при гриппозной инфекции [13]. Однако данные об антивирусной активности сульфопроизводных углеводов, содержащих сульфонатные группировки (С-сульфаты), отсутствуют. Нами изучены противовирусные свойства сульфонированного (C-сульфат) олигосахарида - бисульфитного производного окисленного β-циклодекстрина KS-6469 в отношении вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1) (ВГ) in vitro и in vivo. Показано, что KS-6469 эффективно ингибирует репликацию ВГ в клетках МДСК, действуя на поздних стадиях инфекции, и обладает вирулицидными свойствами. Результаты лечения гриппозной пневмонии у мышей подтвердили высокий антивирусный потенциал этого соединения. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Синтез соединения KS-6469 Соединение KS-6469 было разработано и синтезировано в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (патент РФ 2635765, 2017) на основе коммерчески доступного β-циклодекстрина (KLEPTOSE®, Бельгия). Подробное описание процедуры синтеза и физико-химических свойств KS-6469 будет опубликовано отдельно. Коммерчески доступный осельтамивир (Тамифлю®, Швейцария) готовили в виде раствора в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) для перорального введения. Цитотоксическое действие KS-6469 в культуре клеток МДСК МТТ-анализ. Цитотоксичность KS-6469 оценивали с использованием теста 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест) как описано ранее [14]. Клетки МДСК получены из коллекции клеточных культур Института цитологии (Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде Искова МДМ (ИМДМ) (Sigma, США) с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma, США), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 0.25 мг/мл амфотерицина (антибиотик-антимикотический раствор, Sigma, США) при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2 (стандартные условия). Клетки МДСК высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в стандартных условиях до формирования полного монослоя. Затем питательную среду заменяли свежей средой, содержащей KS-6469 в различных концентрациях, и клетки инкубировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Аликвоты раствора МТТ добавляли в каждую лунку, инкубировали в течение 3 ч, затем кристаллы формазана солюбилизировали диметилсульфоксидом (ДМСО) и измеряли оптическую плотность при 570 нм с использованием ридера MultiskanTM FC (Thermo LabSystems, Финляндия). Концентрацию соединения, приводящую к гибели 50% клеток (IC50), определяли как концентрацию, необходимую для снижения значения оптической плотности до 50% от контроля (только ДМСО). Анализ цитотоксичности KS-6469 в реальном времени. Цитотоксическое действие KS-6469 на клетки МДСК измеряли с помощью технологии микроэлектронного биосенсора на приборе xCELLigence Real-Time (ACEA Biosciences Inc., США). Клеточный индекс (CI) рассчитывается автоматически на основании изменения параметров сопротивления при взаимодействии обработанных и необработанных клеток с электродами на микроэлектронных планшетах (E-планшеты). Клетки высевали в E-планшеты (ACEA Bioscience Inc., США) в среде ИМДМ и инкубировали в течение ночи (20 ч) в стандартных условиях. Затем питательную среду удаляли, клетки промывали ФСБ и в каждую лунку добавляли 150 мкл среды ИМДМ, содержащей различные концентрации KS-6469 или среду (контроль). Клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 65 ч, а жизнеспособность клеток контролировали каждые 15 мин с использованием анализатора xCELLigence Real-Time. Эксперименты повторяли 2 раза, а концентрацию соединения, приводящую к гибели 50% клеток (IC50), рассчитывали с использованием программного обеспечения xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. Максимальную концентрацию соединения, при которой график изменения CI совпадал с графиком CI для необработанных клеток, т.е. не оказывающую на клетки токсичного действия, принимали за максимально переносимую концентрацию (МПК). Изучение противовирусной активности KS-6469 в культуре клеток МДСК Штамм вируса гриппа A/WSN/33 (Н1N1) был получен в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского. Клетки МДСК выращивали в стандартных условиях в 24-луночных планшетах до формирования полного монослоя. Затем клетки инфицировали ВГ при множественности заражения (MOI) 0.1 в среде ИМДМ, содержащей KS-6469 (70-600 мкг/мл), и инкубировали при 37°C в течение 24 или 48 ч в стандартных условиях. Через 24 или 48 ч клетки подвергали одному циклу замораживания/оттаивания (-20/20°C), а затем определяли титр вируса с использованием метода оценки титра вируса по количеству фокусобразующих единиц (ФОЕ/мл), описанному ранее [15]. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vitro были следующие показатели: коэффициент ингибирования (Ки, %) и химиотерапевтический индекс (ХТИ). Снижение уровня накопления вируса под влиянием соединения определяли по формуле: Ки = (Тк - То)/Тк × 100%, где Тк - уровень накопления вируса при культивировании без внесения в среду изучаемого соединения (ФОЕ/мл); То - уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого соединения (ФОЕ/мл) [16]. За величину ХТИ препарата принимали соотношение ХТИ = МПК/МЭК, где МЭК - минимально эффективная концентрация соединения, снижающая титр вируса не менее чем на 2 lg ФОЕ/мл [17]. Метод Time-of-addition Для более точной оценки влияния KS-6469 на различные стадии жизненного цикла ВГ клетки МДСК выращивали до формирования полного монослоя в 24-луночных планшетах в стандартных условиях и инфицировали ВГ (MOI 0.1) в течение 1 ч. После каждого периода инкубации с ВГ клетки промывали ФСБ и добавляли соединение KS-6469 в концентрации 5 мг/мл в разные промежутки времени до или после инфицирования клеток ВГ. Через 48 ч клетки подвергали одному циклу замораживания/оттаивания и определяли титр вируса. Анализ активности нейраминидазы ВГ Активность нейраминидазы ВГ (NА) измеряли с использованием набора для анализа функциональной активности нейраминидазы гриппа NA-Fluor™ (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя. Анализ основан на измерении активности NА, расщепляющей субстрат 2’-(4-метилумбеллиферил)-α-D-N-ацетилнейраминовой кислоты (MUNANA) с высвобождением флуоресцентного продукта 4-метилумбеллиферона. Флуоресцентный сигнал измеряли с использованием флуоресцентного ридера CLARIOstar® (BMG LABTECH, Германия). Эксперименты выполняли в трех повторах. Анализ гемагглютинирующей активности вируса Противовирусную активность соединения KS-6469 исследовали по ингибированию инфекционного титра вируса в реакции гемагглютинации (РГА). Результаты оценивали, сравнивая значения титра вируса после инкубации ВГ с KS-6469 в различных концентрациях. В РГА использовали 0.5% взвесь эритроцитов цыпленка. За титр вируса принимали величину, противоположную значению наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную РГА. Анализ содержания холестерина Концентрацию холестерина в вирусных оболочках определяли с использованием набора Amplex Red Cholesterol (Molecular Probes, США) в соответствии с инструкциями производителя. ВГ инкубировали с KS-6469 в различных концентрациях в течение 6 ч при 37°С, затем осаждали и ресуспендировали в реакционном буфере Amplex Red. Метил-β-циклодекстрин (МβЦД) использовали в качестве положительного контроля. Затем уровень флуоресценции анализировали на ридере CLARIOstar®, используя длину волны возбуждения 550 нм и длину волны излучения 590 нм. Эксперименты были выполнены в трех повторах. Изучение вирулицидной активности KS-6469 ВГ инкубировали с равным объемом среды, содержащей различные концентрации KS-6469, в течение 3 или 6 ч при 4, 20 или 37°С. В качестве контроля ВГ инкубировали с равным объемом среды, не содержащей KS-6469. Титр вируса оценивали методом ФОЕ. Эксперименты выполняли в трех повторах Иммуноферментный анализ Иммуноферментный анализ проводили с использованием коммерчески доступных моноклональных антител, связывающихся с гемагглютинином ВГ (H1N1) [IVC102], [1.B.408] и [B219M] (Abcam), как описано ранее [18]. Изучение эффективности применения KS-6469 на модели гриппозной пневмонии мышей Лабораторные животные. Самки мышей BALB/c в возрасте от 4 до 6 недель приобретены в Государственном научно-исследовательском центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Российская Федерация). Животных содержали в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН с режимом естественного освещения на стандартном рационе для лабораторных животных (ГОСТ Р 5025892) в соответствии с международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях [19], а также правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в российских государственных стандартах (Р 51000.3-96 и 51000.4-96). Протоколы экспериментов утверждены Межведомственной комиссией по биоэтике СО РАН (22.11 от 30.05.2014 г.). Токсичность KS-6469 для мышей. Токсичность KS-6469 для мышей оценивали при внутрибрюшинном и интраназальном введении соединения. Каждая из экспериментальных групп содержала шесть мышей BALB/c. Две группы мышей получали KS-6469 внутрибрюшинно однократно в дозе 250 или 500 мг/кг в 0.2 мл ФСБ. Две другие группы животных получали KS-6469 интраназально, однократно или двукратно с интервалом в 1 день, в дозе 250 мг/кг в объеме 40 мкл. Мыши контрольных групп получали ФСБ по аналогичной схеме. После инъекции или интраназального введения признаки интоксикации, такие, как общее состояние, вес и депрессия центральной нервной системы, оценивали ежедневно в течение 14 дней. Протективная активность соединения KS-6469. Протективное действие соединения KS-6469 оценивали по динамике падения массы тела, выживаемости мышей после заражения и репродукции вируса в легких. Мыши BALB/c были разделены на группы по шесть животных. Мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции трибромэтанола (Avertin®). Мышей инфицировали интраназально вирусом в дозе 3 ЛД50, эквивалентной 1.2 ×104 ± 0.7 ×104 ФОЕ (р < 0.05), в объеме 30 мкл сразу после интраназального введения KS-6469 в дозе 250 мг/кг в объеме 30 мкл. На следующий день мыши получали интраназально такую же дозу KS-6469. В качестве положительного контроля группа мышей получала перорально осельтамивир ежедневно (7.5 мг/кг) в течение 5 дней после заражения. Мыши из контрольной группы без лечения получали ФСБ по аналогичной схеме (отрицательный контроль). Животных осматривали и взвешивали ежедневно в течение 14 дней после заражения. Для оценки репродукция ВГ в легких мышам BALB/c (n = 6) интраназально вводили KS-6469 в различных дозах и инфицировали дозой вируса 3 ЛД50. На следующий день мыши получали такую же дозу KS-6469 интраназально. Мыши из контрольной группы получали ФСБ по аналогичной схеме. Мышей в каждой группе подвергали эвтаназии через 72 ч после заражения и извлекали легкие. Легкие гомогенизировали с использованием ультразвукового гомогенизатора Sonopuls HD 2070 (Bandelin, Германия). Титр вируса в гомогенатах легких определяли методом ФОЕ. Статистический анализ Данные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Значения p менее 0.05 считали статистически значимыми. РЕЗУЛЬТАТЫ Характеристика KS-6469 KS-6469 представляет собой бисульфитное производное окисленного олигосахарида (β-циклодекстрина), имеющее в своем составе сульфонатные группировки, связанные непосредственно с атомом углерода (С-сульфаты), общей формулой [(Gluox)7-Сх]-(SO3Na)х, где [(Gluox)7-Сх] - окисленный β-циклодекстрин, х - количество сульфированных атомов углерода, SO3R - бисульфитная (сульфонатная) группировка. Структура и физико-химические свойства KS-6469 являются предметом дальнейших исследований и будут опубликованы позже. Изучение цитотоксического действия KS-6469 Цитотоксические свойства KS-6469 в отношении клеток линии МДСК изучали с помощью МТТ-теста и анализа состояния клеток в реальном времени, позволяющего регистрировать токсическое действие соединений в динамике. По данным МТТ-теста концентрация KS-6469, при которой выживает 50% клеток в популяции, через 24 ч экспозиции = 15 ± 3.3 мг/мл (рис. 1А). Исследование цитотоксического действия изучаемого соединения при более длительном его воздействии на клетки (в течение 65 ч) с использованием анализатора клеток xCELLigence показало, что в этом случае IC50 равно 8.9 ± 1.3 мг/мл (рис. 1Б). Концентрация, не оказывающая на клетки токсичного действия (МПК), составила 2.5 мг/мл. Другими словами, соединение KS-6469 обладает низкой токсичностью в отношении культуры клеток МДСК. Изучение противовирусной активности KS-6469 в культуре клеток Противовирусную активность KS-6469 оценивали, используя модель вирус гриппа A/WSN/33/ - клетки МДСК. Клетки МДСК одновременно инкубировали в присутствии различных концентраций KS-6469 и инфицировали вирусом при MOI 0.1. Количественная оценка титра вируса после его инкубации с соединением (рис. 2) в течение 24 ч выявила зависимое от концентрации снижение репликации вируса в диапазоне концентраций KS-6469 70-600 мкг/мл. При концентрации KS-6469 600 мкг/мл через 24 ч после заражения титр вируса был ниже порога чувствительности метода. При инкубации инфицированных ВГ клеток с соединением KS-6469 в концентрации 70 мкг/мл наблюдалось значительное снижение титра вируса Ки = 75% (60.0-80.2%) (р < 0.05). Следует отметить, что при концентрации KS-6469 600 мкг/мл наблюдалось полное подавление вирусной инфекции, так как мы не выявили репродукции вируса через 48 ч после заражения клеток. Таким образом, KS-6469, бисульфитное производное окисленного β-циклодекстрина, в концентрации выше 70 мкг/мл значительно снижает титр вируса при экспозиции и полностью подавляет развитие инфекционного процесса при концентрации 600 мкг/мл. Результаты, полученные на модели in vitro, продемонстрировали высокую ингибирующую активность соединения KS-6469 в отношении ВГ. Необходимо отметить, что высокий химиотерапевтический индекс KS-6469, равный 8.3, свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения противовирусной активности этого соединения in vivo. Для определения механизма ингибирования репродукции ВГ при инкубации с KS-6469 необходимо было установить, на какой стадии жизненного цикла вируса происходит подавление его репродукции. С этой целью был проведен эксперимент Time-of-addition, когда KS-6469 добавляли к клеткам на разных этапах развития вирусной инфекции. Во-первых, мы оценили, может ли KS-6469 при добавлении к клеткам до инфицирования вирусом защитить их от последующей инфекции. Клетки МДСК обрабатывали KS-6469 за 2 ч до заражения ВГ (от (-3) до (-1) ч) (рис. 3). Мы не обнаружили снижения титра вируса после предварительной инкубации клеток с KS-6469. Также не обнаружено снижения титра вируса при использовании KS-6469 на начальных стадиях инфекционного процесса в клетке ((-1)-0 ч) и на ранних стадиях репродукции вируса ((-1)-6 ч). Таким образом, показано, что соединение KS-6469 не влияет на ранние стадии репликации вируса, такие, как прикрепление вириона к клетке, проникновение в клетки-мишени. Ингибирование репродукции вируса наблюдалось только тогда, когда KS-6469 постоянно присутствовал в среде, начиная с момента заражения клеток (0-48 ч) или при добавлении соединения через 6 ч после заражения клеток (6-48 ч) (рис. 3). Влияние KS-6469 на функциональную активность поверхностных белков оболочки ВГ Проникновение вирусных частиц в клетку обеспечивается согласованной работой основных поверхностных белков оболочки вириона, гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Изменения функциональной активности НА оценивали с использованием модельной системы связывания вирусных частиц с эритроцитами. Вирус гриппа инкубировали с KS-6469 (5 мг/мл) в течение 1 или 6 ч при 37 или 4°С, а затем титр вируса оценивали в РГА (табл. 1). Инкубация вируса с KS-6469 в течение 1 ч при 37°С приводила к снижению титра вируса в 4 раза, а после 6 ч инкубации титр вируса снижался в 16 раз (табл. 1). Интересно, что титр вируса снизился только в 2 раза после инкубации в течение 6 ч при 4°С в присутствии KS-6469 в той же концентрации. Снижение связывания гемагглютинина вируса с эритроцитами предполагает возможное изменение конформации поверхностных эпитопов этого белка. Способность KS-6469 влиять на структуру поверхностных эпитопов гемагглютинина была проанализирована с использованием набора коммерчески доступных моноклональных антител к гемагглютинину ВГ. Обработка вирионов ВГ KS-6469 (5 мг/мл) в течение 6 ч при 37°C, которая привела к 16-кратному снижению титра HA, не влияла на эффективность связывания НА с моноклональными антителами к НА вируса гриппа (рис. 4). Следует отметить, что процесс ингибирования функциональной активности НА вириона требует достаточно продолжительной инкубации с KS-6469 при температуре не менее 37°С, и мы наблюдали только частичную потерю функциональной активности НА после часовой экспозиции с KS-6469, что свидетельствует о сохранении инфекционных свойств вируса. Далее мы изучили возможное ингибирование активности вирусной нейраминидазы при инкубации с KS-6469. Нейраминидаза препятствует агрегации вирусных частиц и обеспечивает их высвобождение из зараженной клетки. Полученные результаты (рис. 5) показали, что инкубация ВГ с KS-6469 (5 мг/мл) не меняет активность NA. Это свидетельствует о том, что NA не является мишенью для KS-6469. Учитывая, что механизм противовирусного действия другого производного β-циклодекстрина - метил-β-циклодекстрина (МβЦД), связан с удалением холестерина из липидной оболочки вирионов ВГ [20], мы проанализировали возможное изменение уровня холестерина в вирусной оболочке после обработки KS-6469. ВГ предварительно обрабатывали KS-6469 и МβЦД (положительный контроль) в различных концентрациях или оставляли без обработки (рис. 6). Снижение содержания холестерина в вирусной оболочке наблюдали только после инкубации ВГ с МβЦД, но не KS-6469. Следовательно, противовирусный эффект KS-6469 не связан с изменением содержания холестерина в вирусной оболочке. Таким образом, мы показали, что KS-6469 частично снижает гемагглютинирующую активность вируса, но не влияет на функциональную активность вирусной NA и не уменьшает содержания холестерина в вирусной оболочке. Вирулицидные свойства KS-6469 Ранее было показано, что сульфатированные полисахариды обладают вирулицидной активностью [21, 22]. Нами изучена способность KS-6469 непосредственно инактивировать вирус гриппа. Инкубация ВГ с KS-6469 в концентрации 2.5 или 5 мг/мл в течение 3 ч при 37°С привела к полной потере инфекционных свойств вирусных частиц. Снижение концентрации KS-6469 до 1.25 мг/мл с последующей инкубацией вируса в тех же условиях (3 ч, 37°С) привело к снижению титра вируса на 2 lg ФОЕ/мл, а после инкубации в течение 6 ч инфекционные вирионы не были обнаружены (табл. 2). Инкубация вируса в присутствии 0.3 мг/мл KS-6469 при 37°С в течение 6 ч не влияла на его инфекционность. Снижение температуры инкубации привело к значительному снижению вирулицидных свойств KS-6469: при инкубации вируса с соединением при 4 или 20°С, снижения инфекционности вируса не наблюдалось. Мы предполагаем, что вирулицидный эффект KS-6469 может быть опосредован образованием агрегатов вирусных частиц и соединения, а снижение температуры инкубации может резко уменьшить эффективность образования таких агрегатов. Изучение противовирусной эффективности KS-6469 на модели гриппозной пневмонии мышей Токсичность соединения KS-6469 для мышей. Мышам линии BALB/c однократно внутрибрюшинно вводили KS-6469 (250 или 500 мг/кг) в 0.2 мл ФСБ. Физические параметры и вес животных контролировали ежедневно (рис. 7). Однократное введение соединения в максимальной дозе 500 мг/кг не приводило к снижению веса и изменению общего состояния животных, что указывает на низкую токсичность KS-6469. Мыши, которым двукратно с интервалом 24 ч интраназально вводили KS-6469 (250 мг/кг), теряли вес минимально в течение 2 дней после введения, далее токсических побочных эффектов не наблюдали в течение всего периода наблюдения (рис. 7А и 7Б). Протективное действие KS-6469. Эффективность KS-6469 против летального заражения ВГ протестировали на модели гриппозной пневмонии мышей. Для оценки репродукции ВГ в легких мышам интраназально вводили KS-6469 в различных дозах и заражали вирусом в дозе, соответствующей 3 ЛД50. На следующий день мыши интраназально получали вторую дозу KS-6469. Мыши группы положительного контроля ежедневно перорально получали осельтамивир (7.5 мг/кг); мыши контрольной группы без лечения получали ФСБ по аналогичной схеме (отрицательный контроль). Через 3 сут в гомогенатах легких с помощью метода ФОЕ определяли титр вируса (рис. 8А). Из представленных данных видно, что в легких мышей, получавших KS-6469, титр вируса значительно ниже, чем в контрольной группе, что свидетельствует об эффективном подавлении репродукции вируса гриппа в легких мышей после интраназального введения KS-6469 (рис. 8А). На 3-й день в легких мышей, не получавших лечения, титры вируса были на ~ 2.5 lg выше, чем у мышей, получавших KS-6469 и осельтамивир (р < 0.05). Необходимо отметить отсутствие дозозависимого снижения титра вируса в легких мышей, получавших разные дозы KS-6469, что, возможно, связано с механизмом действия этого соединения. Для сравнения протективных свойств KS-6469 использовали две схемы введения препарата: 1) мышам первой группы однократно интраназально вводили KS-6469 в дозе 250 мг/кг с последующим заражением вирусом (3 ЛД50); 2) вторая группа мышей получала KS-6469 в тех же дозах 2 раза с интервалом в 1 день. В качестве положительного контроля мыши ежедневно перорально получали осельтамивир (7.5 мг/кг), мышам из группы без лечения по аналогичной схеме вводили ФСБ. В течение 14 дней после заражения ежедневно оценивали падение массы тела (количественный клинический признак гриппозной пневмонии) и выживаемость. Показано (рис. 8Б, 8В), что двукратное интраназальное введение KS-6469 приводило к минимальной потере массы тела и обеспечивало полную защиту мышей от заражения, как и введение осельтамивира (100% выживаемость). В группе мышей, получавших KS-6469 однократно, показатель выживаемости достигал 66%, и потеря массы тела была минимальной. Значительное падение массы тела у мышей без лечения (до 20%) свидетельствует о развитии тяжелой гриппозной пневмонии, которая привела к гибели 84% мышей. Таким образом, полученные нами данные показывают, что лечебно-профилактическое применение соединения КS-6469 в модели гриппозной пневмонии эффективно защищает мышей от летальной гриппозной инфекции. ОБСУЖДЕНИЕ Грипп остается одним из самых опасных вирусных заболеваний. На сегодняшний день одобрены только два класса препаратов для лечения гриппа - блокаторы ионных каналов белка M2 и ингибиторы NA [23, 24]. Вакцинация является надежным способом борьбы с гриппозной инфекцией [25], но вирусы гриппа постоянно меняются как в результате случайного накопления мутаций в генах поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы, так и в результате реассортации сегментов вирусного генома различных штаммов вируса гриппа, что приводит к снижению эффективности противогриппозных вакцин и терапевтических препаратов. Таким образом, существует острая необходимость в разработке новых подходов к борьбе с гриппом. Одно из возможных решений - разработка противовирусных соединений на основе сульфопроизводных олиго- и полисахаридов, полученных из синтетических или натуральных продуктов. Такие соединения эффективно инактивируют более восприимчивые к ним оболочечные вирусы [3-7]. Ранее было показано, что сульфатированные полисахариды из морских микроводорослей обладают активностью против вирусов без оболочки [26]. Считается, что сульфатированные полисахариды влияют на такие стадии цикла репликации гриппа, как связывание вирусных частиц с рецепторами клеточной поверхности [27], интернализация вирионов [28] и высвобождение вируса из клетки [12, 29]. Однако для выяснения механизмов их противовирусного действия требуются дополнительные исследования. Нами исследованы противовирусные свойства нового сульфированного производного β-циклодекстрина KS-6469. Обнаружено полное подавление репродукции вируса после инкубации инфицированных клеток в течение 24 ч с KS-6469 в концентрации 600 мкг/мл, что указывает на высокий противовирусный потенциал соединения. Для определения механизма противовирусной активности KS-6469 мы оценили эффективность ингибирования на разных стадиях жизненного цикла вируса (рис. 3). Оказалось, что KS-6469 не влияет на ранние стадии репликации вируса, однако значительное снижение титра вируса происходило при инкубации инфицированных клеток с KS-6469 в течение длительного времени. Таким образом, мы можем предположить, что KS-6469 влияет на поздние стадии развития гриппозной инфекции. Ингибирующий эффект KS-6469 на поздних стадиях инфекции может быть связан с подавлением активности NA, однако мы не обнаружили каких-либо изменений в активности NA после инкубации с KS-6469 (рис. 5). Функциональная активность другого белка вирусной оболочки - гемагглютинина, после инкубации вирусных частиц с KS-6469 в течение 1 ч при 37°С была снижена в 4 раза по сравнению с гемагглютинином необработанного вируса (табл. 1), что не повлияло на эффективность связывания вирионов с рецепторами клеток и не привело к снижению эффективности репродукции вируса. Следует отметить, что инкубация ВГ с KS-6469 не снижала способность НА взаимодействовать с определенными моноклональными антителами к этому белку, что свидетельствует о сохранности антигенных детерминант, к которым направлены эти антитела (рис. 4). Нами показано, что KS-6469 обладает выраженной вирулицидной активностью, способной вызывать полную потерю инфекционности вируса после инкубации с KS-6469 (табл. 2). Вирулицидная активность соединения была максимальной при 37°С, но требовала длительной инкубации, что, в свою очередь, объясняет отсутствие эффекта ингибирования ранних этапов репликации вируса при инкубации клеток с KS-6469 (рис. 3). Экспозиция клеток с KS-6469 в течение первых часов развития инфекционного процесса приводила лишь к частичному снижению инфекционности вируса, явно недостаточной для инактивации всего пула вирусных частиц и, как следствие, полной остановки репликации вируса. Детальный механизм действия KS-6469 находится в процессе изучения, тем не менее, полученные результаты позволяют предположить, что при взаимодействии KS-6469 с вирусными частицами in vitro образуются агломераты, что приводит к значительному снижению инфекционности вируса. Однако этот процесс требует достаточно длительного времени, более 6 ч. Ранее было высказано предположение [21], что именно вирулицидная активность противовирусных препаратов связана с их высокой терапевтической активностью в экспериментах in vivo. Наши данные полностью подтверждают это предположение. Мы показали, что KS-6469 обладает выраженной противовирусной активностью при гриппозной пневмонии у мышей (рис. 8). Интраназальное введение соединения одновременно с заражением мышей летальной дозой ВГ приводило к снижению смертности животных. При однократном введении соединения KS-6469 выжило 66% животных, тогда как его двукратное введение обеспечивало полную защиту от заражения вирусом гриппа. В контрольной группе выжило только 16% мышей, не получавших препарата. Интраназальное применение KS-6469 для лечения зараженных гриппом мышей заметно снижало титр вируса в легких даже при введении низкой дозы KS-6469 (62.5 мг/кг (рис. 8)). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные эксперименты показывают, что KS-6469 - это препарат с низкой токсичностью, который эффективно ингибирует развитие гриппозной пневмонии. Интраназальное применение KS-6469 оказывало противовирусное действие, сопоставимое с действием осельтамивиром. Таким образом, KS-6469 представляется перспективным кандидатом для разработки противовирусного препарата, эффективного для профилактики и лечения гриппозных инфекций.

Об авторах

Е. П. Гончарова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: egn@niboch.nsc.ru
Россия

Я. А. Костыро

Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН

Email: egn@niboch.nsc.ru
Россия

А. В. Иванов

Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН

Email: egn@niboch.nsc.ru
Россия

М. А. Зенкова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: egn@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы