Регуляция репликации аденовирусов человека с помощью РНК-интерференции

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Проблема аденовирусных заболеваний глаз относится к числу наиболее актуальных в современной биомедицине в связи с широким распространением и высокой частотой вспышек аденовирусной инфекции. Аденовирусы вызывают инфекционные заболевания дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта человека. К аденовирусной офтальмологической инфекции относятся такие заболевания, как аденовирусный конъюнктивит - воспаление оболочки глаза, и эпидемический кератоконъюнктивит - сочетанное воспаление конъюнктивы и роговицы [1]. В России ежегодно эпидемический кератоконъюнктивит выявляют более чем у 300000 человек [2]. Наиболее тяжелые поражения глаз вызывают аденовирусы человека (HAdV), относящиеся к группе D (типы D8, D19, D36 и D37) [3]. HAdV-инфекциям подвержены все возрастные группы [4]. В России по поводу воспалительных заболеваний глаз к офтальмологу обращается примерно 18 млн человек в год, что составляет до 80% случаев временной нетрудоспособности по причине офтальмологических заболеваний и 10-30% случаев снижения остроты зрения и слепоты [5]. Эпидемический характер распространения, большие потери по временной нетрудоспособности, высокая вероятность развития осложнений - временной или стойкой утраты зрения, многообразие клинических проявлений определяют медико-социальную значимость аденовирусных заболеваний глаз. Аденовирусные инфекции представляют опасность для людей с заболеваниями иммунной системы [6]. Известно, что к развитию ожирения у детей, а также неалкогольной жировой болезни печени у взрослых приводит заражение аденовирусом типа 36 группы D человека (HAdV D36) [7]. Недостаточная эффективность современных методов лечения аденовирусной инфекции [8] обусловливает необходимость поиска и разработки лекарственных средств, избирательно воздействующих на возбудителей данного заболевания. Потенциальными мишенями для терапевтических препаратов могут быть ранние гены аденовирусов человека, такие, как ген ДНК-полимеразы Е2В и ген Е1А, участвующие в репликации вирусной ДНК [9-11]. Продукты гена Е1А стимулируют переход клеток из фазы G0 в фазу S клеточного цикла. Взаимодействие продуктов гена Е1А с белком ретинобластомы (pRb) приводит к активации фактора транскрипции Е2F1, запускающего экспрессию генов, необходимых для прохождения S-фазы клеточного цикла. Это позволяет аденовирусу эффективно использовать аппарат репликации ДНК инфицированной клетки для репликации собственного генома. Одна из функций фактора транскрипции Е2F1 - трансактивация белка р14/ARF, сопровождаемая индукцией р53-зависимого апоптоза. В ходе вирусной инфекции белок E1B 55 кДа инактивирует р53, не давая ему запустить апоптоз в клетке до завершения цикла репликации аденовируса [12, 13]. Использование малых интерферирующих РНК (siРНК) - коротких дуплексов длиной 21-23 п.н. с выступающими 2-3 нуклеотидами на 3’-концах, способных подавлять экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, позволяет изучать функциональную активность генов [14, 15]. Показана возможность использования интерферирующих РНК для подавления экспрессии различных генов-мишеней, в том числе вирусных генов [16-18]. Для доставки интерферирующих РНК в клетки используются рекомбинантные лентивирусные векторы, кодирующие малые шпилечные РНК (shРНК) - предшественники малых интерферирующих РНК [19-21]. Мы считаем, что этот подход можно применить для подавления экспрессии ранних генов Е1А и Е2В [10, 11] HAdV, которые вызывают поражения глаз и дыхательных путей. В представленной работе приведены результаты ингибирования экспрессии гена E1A аденовирусов типов D8, D19, D36 и D37 группы D человека при помощи siРНК и shРНК, а также репликации HAdV D8 и D37 при сочетанном подавлении экспрессии E1A и E2B с использованием shРНК. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культуры клеток В работе использовали перевиваемые клетки эмбриона почки человека HEK293 [22], перевиваемые клетки аденокарциномы легкого человека А549 (DSMZ ACC107; Brauschweig, Germany), перевиваемые клетки немелкоклеточного рака легкого человека Н1299 [23], а также первичные клетки лимба человека (Limb) [24, 25]. Клетки линий НЕК293, А549 и Н1299, а также клетки модельных линий А549 Е1А и Н1299 Е1А выращивали на среде DMEM (Life Technologies, Великобритания), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Life Technologies), 4 мM L-глутамина, 1 мM пирувата натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед./мл соответственно при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2. Первичные клетки лимба человека культивировали на среде DMEM/F12 (Life Technologies), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Life Technologies), 4 мM L-глутамина, 1 мM пирувата натрия, 10 мМ HEPES, 0.4 мкМ инсулина, 10 нМ дексаметазона, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед./мл соответственно при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2. Лентивирусные векторы Рекомбинантные лентивирусные векторы были сконструированы с помощью стандартных методов генной инженерии [26, 27]. Для получения лентивирусных вирионов ДНК рекомбинантных векторов котрансфицировали в клетки линии HEK293 методом Са-фосфатной трансфекции совместно с плазмидами, направляющими синтез всех лентивирусных белков, необходимых для создания инфекционных лентивирусных частиц. Сбор инфекционных псевдолентивирусных частиц проводили в течение 2 дней с интервалом 12 ч. Титрование проводили на клетках линий А549 и Н1299. Вирусные стоки с титрами 5 × 105-5 × 106 использовали для проведения дальнейших исследований. Модельные линии клеток Модельные клетки, в которых экспрессируется ген Е1А аденовируса типа 36 человека (Е1А-D36), получены с помощью трансдукции клеток линий А549 и Н1299 псевдолентивирусными частицами Е1АLeGO-iGT на основе LeGO-iGT-Puro-opt, несущими экспрессирующую кассету «промотор - ген Е1А аденовируса типа 36 человека - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину. Для получения клеток модельной линии Н1299 shЕ1А клетки исходной линии Н1299 трансдуцировали лентивирусными частицами, содержащими последовательность, кодирующую shЕ1А, маркерный ген Cerulean и ген устойчивости к антибиотику бластицидину (BSD). Через 48 ч после трансдукции клетки помещали в селективную среду с антибиотиком бластицидином (5 мкг/мл). Селекцию продолжали в течение 10 дней. Затем клетки Н1299 shЕ1А анализировали на проточном цитофлуориметре. Модельные линии Limb shE2B, Limb shE1A и Limb shE2B/shE1A получали, трансдуцируя первичные клетки лимба человека псевдолентивирусными частицами, кодирующими shE2B [10, 11] или shE1A. siРНК Для подавления экспрессии гена E1А HAdV 8, 19, 36 и 37 в компании «СИНТОЛ» (Россия) были синтезированы siРНК, направленные против разных районов мРНК целевого гена. Были синтезированы siРНК длиной 21 п.н.: siE1A-1 (смысловая цепь 5’-GGAGGACUUUGUGAAUACAUU-3’, антисмысловая цепь 5’-UGUAUUCACAAAGUCCUCCUU-3’); s i Е 1 А - 2 ( с м ы с л о в а я ц е п ь 5 ’ - G A G GCUGUGAAUUUAAUAUUU3’, антисмысловая цепь 5’-AUAUUAAAUUCACAGCCUCUU-3’) и siЕ1А-3 (смысловая цепь 5’-GCUCUGUGUUACAUGAAAUUU3’, антисмысловая цепь 5’-AUUUCAUGUAACACAGAGCUU-3’). Эти siРНК гомологичны последовательностям гена Е1А HAdV типов D8, D19, D36 и D37. В качестве контроля использовали siScr, не имеющие гомологии с известными вирусными мРНК, а также мРНК человека, мыши и крысы (смысловая цепь 5’-CAAGUCUCGUAUGUAGUGGUU-3’, антисмысловая цепь 5’-CCACUACAUACGAGACUUGUU-3’). siРНК конструировали с помощью программы Whitehead Institute siRNA Selection Program [28]. Трансфекция siРНК Клетки в фазе экспоненциального роста высевали на 24-луночные планшеты по 3 × 104 клеток/лунку за 1 сутки до эксперимента и трансфицировали siРНК в концентрации 200 нM с помощью Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent (Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. shРНК Нами были сконструированы лентивирусные векторы shE1A-LeGO-Cer/BSD и shScr-LeGO-Cer/BSD, кодирующие shРНК: shE1A, которая соответствует siE1А-1 (смысловая цепь 5’-p-aacgATATTAAATTCACAGCCTCcttcctgcaaGAGGCTGTGAATTTAATATtttttc3’, антисмысловая цепь 5’-p-tcgagaaaaaATATTAAATTCACAGCCTCttgcaggaagGAGGCTGTGAATTTAATATcgtt3’), и контрольную shScr (смысловая цепь 5’-p-gatccgCCACTACATACGAGACTTcttcctgtcaCAAGTCTCGTATGTAGTGGtttttg3’, антисмысловая цепь 5’-p-aattcaaaaaCCACTACATACGAGACTTGtgacaggaagCAAGTCTCGTATGTAGTGGcg3’). В настоящей работе мы использовали также лентивирусные векторы shE2B-LeGO-G, кодирующие shРНК, направленную против мРНК гена ДНК-полимеразы Е2В HAdV D8, D19, D36 и D37, и shScr-LeGO-G, описанные ранее [10, 11]. Проточная цитофлуориметрия Уровень флуоресценции клеток измеряли на проточном цитофлуориметре Epics 4XL (Beckman Coulter, США). Сбор и учет данных производили с помощью программного обеспечения WinMDI, версия 2.8. ПЦР в реальном времени Суммарную РНК из клеточных культур выделяли с помощью TRIzol® reagent (Life Technologies) согласно протоколу производителя. Полученную мРНК использовали для построения первых цепей кДНК c помощью набора ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). Для идентификации в полученной суммарной кДНК нуклеотидных последовательностей E1A-D36 проводили ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к данному гену: смысловая последовательность 5’-GCATCCAGAGCCATTTGAGC-3’; антисмысловая последовательность 5’-TTAGGGTCGTCATCATGGGC3’. Значения, полученные для каждого образца, нормировали на экспрессию гена «домашнего хозяйства» β-актина. Уровень экспрессии гена β-актина определяли с использованием праймеров: смыслового - 5’-ATGGATGATGATATCGCCGC-3’ и антисмыслового - 5’-CTTCTGACCCATGCCCAC-3’. ПЦР в реальном времени проводили в 96-луночных планшетах на приборе MiniOpticon (Bio-Rad, США) с использованием реагента iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Продукты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения прибора MiniOpticon (Bio-Rad). Определение количества копий генома аденовируса человека HAdV D8 (ATCC® VR-1085AS/RB™ATCC® VR1085AS/RB™) и HAdV D37 (ATCC® VR-929™) были приобретены в American-Type-Culture-Collection (ATCC). Для оценки репликации аденовирусов группы D человека через 6 дней после инфекции клетки, зараженные HAdV D8 и D37, собирали, выделяли суммарную ДНК с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Количественную ПЦР проводили согласно [29] на приборе Rotor Gene Q cycler (QIAGEN) с использованием реагента TaqMan® Universal PCR Master Mix (Life Technologies). Продукты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения прибора Rotor Gene Q cycler (QIAGEN). Статистическая обработка данных Все данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (СО). Статистическую значимость определяли с использованием непарного двустороннего t-теста и программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США). Значение p < 0.05 считали статистически значимым. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение линий модельных клеток, экспрессирующих ген Е1А HAdV D36 Для определения функциональной активности синтетических siРНК и лентивирусных векторов, направляющих в трансдуцированных клетках синтез shРНК, необходимо было получить модельные линии клеток А549 Е1А и Н1299 Е1А, в которых экспрессируется ген Е1А аденовируса типа 36 человека (E1A-D36). Известно, что экспрессия Е1А в клетках вызывает индукцию р53-зависимого апоптоза [30]. Продукты экспрессии Е1А способствуют переходу покоящейся клетки в S-фазу и нарушению механизмов, контролирующих синтез ДНК. Это увеличивает вероятность возникновения повреждений ДНК в процессе репликации. В ответ на сильное повреждение ДНК белок р53 запускает каскад реакций, приводящих к апоптозу. Поэтому сначала клетки А549 и Н1299 трансфицировали siРНК, комплементарными различным участкам мРНК гена Е1А, а также контрольной siScr. Через 24 ч проводили трансдукцию этих клеток псевдолентивирусными частицами (рис. 1А), содержащими экспрессирующую кассету «промотор - целевой ген Е1А-D36 - IRES - ген флуоресцентного белка dTomato - ген устойчивости к пуромицину». Маркерный ген, кодирующий флуоресцентный белок dTomato, и целевой ген Е1А разделены последовательностью IRES (внутренний сайт посадки рибосомы). IRES позволяет синтезировать несколько белков с одной мРНК в эукариотических клетках. Таким образом, целевой и маркерный гены экспрессируются с сопоставимой эффективностью [31]. Это позволяет косвенно оценить уровень экспрессии гена Е1А, измеряя флуоресценцию белка dTomato с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Эффективность экспрессии внесенных генов оцени вали методами проточной цитофлуориметрии (по флуоресценции маркерного белка Tomato), а также ПЦР в реальном времени. Результаты оценки эффективности трансдукции и последующей экспрессии трансгенов с помощью проточной цитофлуориметрии приведены на рис. 1Б,В. Количество клеток модельных линий А549 Е1А и Н1299 Е1А, в которых регистрировали флуоресценцию белка dTomato, составляло 44 и 85% всей популяции клеток соответственно по сравнению с контролем - нетрансдуцированными клетками линий А549 и Н1299. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в полученных модельных трансгенных клетках А549 Е1А и Н1299 Е1А с высокой эффективностью экспрессируются внесенный целевой ген и маркерный ген dTomato в составе кассеты «промотор - ген Е1А-D36 - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину». Согласно полученным данным, в модельных линиях А549 Е1А и Н1299 Е1А количество флуоресцирующих клеток значительно различается. Причины гетерогенности линий клеток А549 Е1А и Н1299 Е1А по уровню экспрессии dTomato могут быть связаны с индивидуальными свойствами клеток. В геном трансгенных клеток интегрируется разное количество молекул лентивирусного провируса. Вирусная ДНК встраивается в разные участки генома, что может обеспечивать различную эффективность экспрессии трансгенов. Несмотря на сходство морфологии и происхождения клеток А549 и Н1299, одной из причин могут быть различия этих двух линий. Как известно, экспрессия гена Е1А приводит к р53-зависимому апоптозу. Клетки линии Н1299 дефицитны по белку р53. Следовательно, вероятность развития апоптоза в клетках Н1299 Е1А гораздо ниже, чем в клетках А549 Е1А. Можно предположить, что клетки линии А549 трансдуцируются с той же эффективностью, что и клетки Н1299, но в большинстве трансдуцированных клеток А549 Е1А происходит р53-зависимый апоптоз, что позволяет регистрировать флуоресценцию dTomato в меньшем количестве клеток А549 Е1А, чем в клетках модельной линии Н1299 Е1А. Подавление экспрессии гена Е1А-D36 под действием siРНК Структура экспрессирующей кассеты «промотор - ген E1A-D36 - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину» позволяет быстро оценить ингибирующую активность siРНК и лентивирусных векторов, направляющих синтез shРНК - предшественников соответствующих siРНК. Деградация общей для обоих генов мРНК под действием интерферирующих РНК, комплементарных мРНК E1A-D36, приводит к прекращению образования в клетке как продуктов этого гена, так и флуоресцентного белка dTomato, что количественно можно оценить методом проточной цитофлуориметрии. Поскольку экспрессия гена Е1А приводит к индукции апоптоза, эксперимент выполняли следующим образом: siРНК, комплементарные различным районам мРНК Е1А-D36, трансфицировали в клетки линий А549 и Н1299; через 24 ч проводили трансдукцию этих клеток псевдолентивирусными частицами, содержащими экспрессирующую кассету «промотор SFFV - ген Е1А-D36 - IRES - ген флуоресцентного белка dTomato - ген устойчивости к пуромицину». Через 48 и 96 ч после трансдукции эффективность действия siРНК оценивали методами проточной цитофлуориметрии и ПЦР в реальном времени. В результате действия siРНК, комплементарных мРНК Е1А-D36, значительно снижался уровень экспреcсии dTomato (рис. 2). В популяции клеток А549 Е1А, трансфицированных siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3, средняя интенсивность флуоресценции (MFI) dTomato через 48 ч снизилась на 25, 49 и 53% соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 55, 61 и 58%. В качестве контроля использовали клетки линии А549 Е1А, трансфицированные siScr. Определение биологической активности siРНК показало, что уже через 48 ч MFI репортерного белка dTomato в популяции модельных клеток Н1299 Е1А сократилась на 18, 60 и 17% под действием siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3 соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 18, 44 и 56%. Контролем служили клетки линии Н1299 Е1А, трансфицированные siScr. Все представленные результаты получены в ходе трех независимых экспериментов (p < 0.05). Результаты, полученные методом проточной цитофлуориметрии, хорошо согласуются с данными ПЦР в реальном времени. Влияние siРНК на уровень экспрессии мРНК Е1А-D36 в клетках модельных линий оценивали через 48 и 96 ч после трансдукции псевдолентивирусными частицами, кодирующими целевой ген (рис. 3). В клетках линии А549 Е1А через 48 ч после трансдукции под действием siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3 регистрировали снижение уровня экспрессии мРНК Е1А-D36 на 58, 83 и 63% соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 69, 88 и 72%. В клетках модельной линии Н1299 Е1А через 48 ч после трансдукции уровень мРНК Е1А-D36 уменьшался на 28, 71 и 46% при использовании siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3 соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 50, 69 и 47%. Снижение средней интенсивности флуоресценции маркерного белка dTomato происходит медленнее и менее эффективно, чем подавление экспрессии целевого гена на уровне мРНК. Эти данные можно объяснить тем, что флуоресцентный белок достаточно стабилен, и время его полужизни составляет около 72 ч. Согласно данным проточной цитофлуориметрии и ПЦР в реальном времени, наиболее эффективно на экспрессию гена Е1А-D36 действует siЕ1А-2. Ингибирующая активность siРНК определяется группой факторов. К ним относятся вторичная структура мРНК-мишени, уникальность последовательности siРНК, стабильность и термодинамическая асимметрия дуплексов siРНК. Известно, что вторичная структура мРНК-мишени или связанные с ней белки могут затруднять доступ siРНК [15, 32]. Подавление экспрессии гена E1A-D36 с помощью лентивирусного вектора, кодирующего shРНК Нами сконструированы лентивирусные векторы, кодирующие shРНК, соответствующие siE1A-2 (с самым высоким уровнем подавления экспрессии E1A-D36) и контрольной siScr. Лентивирусные векторы могут обеспечить интеграцию последовательности, кодирующей shРНК, в геном клетки, в результате чего будет достигнуто долговременное подавление экспрессии гена-мишени. Основой для таких генетических конструкций послужил лентивирусный вектор LeGO-Cerulean/BSD (рис. 4А), несущий ген маркерного белка Cerulean и ген устойчивости к антибиотику бластицидину. В качестве контроля, иллюстрирующего отсутствие неспецифического действия shРНК, использовали вектор shScr-LeGOCerulean/BSD, несущий шпилечную структуру, не имеющую гомологии с известными вирусными мРНК, а также мРНК крысы, мыши и человека. Такие лентивирусные векторы были введены в геном клеток Н1299 с помощью трансдукции. Через 10 дней селекции клеток Н1299 shЕ1А и Н1299 shScr на бластицидине эффективность трансдукции оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии по флуоресценции репортерного белка Cerulean. Количество флуоресцирующих клеток составило 92-98% от общего числа клеток в популяции по сравнению с контролем (нетрансдуцированные клетки линии Н1299). Затем клетки модельной линии Н1299 shE1A трансдуцировали псевдолентивирусными частицами Е1А-LeGO-iGT. Биологическую активность shE1A оценивали через 3, 6 и 10 дней после трансдукции с помощью ПЦР в реальном времени в ходе трех независимых экспериментов (p < 0.05). Уровень экспрессии целевого гена Е1А под действием shE1A снизился на 57, 77 и 80% через 3, 6 и 10 дней соответственно по сравнению с контролем (рис. 4В). Нами показано, что лентивирусные векторы, кодирующие shРНК, существенно подавляют экспрессию целевого гена Е1А-D36. Необходимо добавить, что в модельных клетках в течение 10 дней сохраняется стабильное блокирование экспрессии Е1А-D36, опосредованное экспрессирующими shРНК лентивирусными частицами. Это свидетельствует о высокой эффективности сконструированных нами лентивирусных векторов. Подавление репликации аденовирусов группы D человека с помощью shРНК в первичных клетках лимба роговицы глаза человека Мы оценили способность shРНК, направленных против мРНК ранних генов Е1А и Е2В HAdV, подавлять репликацию вирусов. Первичные клетки лимба человека (Limb) трансдуцировали лентивирусными векторами shE2B-LeGO-G (рис. 4Б) и shE1A-LeGOCerulean/BSD, кодирующими shE2B и shE1A соответственно. В качестве контроля использовали клетки Limb, трансдуцированные псевдолентивирусными частицами, несущими shScr, последовательность которой не имеет гомологии с известными вирусными мРНК и мРНК мыши, крысы и человека. Клетки полученных линий заражали HAdV D8 и HAdV D37, вызывающими эпидемический кератоконъюнктивит, с множественностью инфекции 20 ФОЕ/клетку. Клетки культивировали в течение 6 дней после заражения: этого времени достаточно для завершения полного цикла репликации аденовируса человека. Через 6 дней после инфекции эффективность действия shРНК оценивали методом количественной ПЦР по количеству копий генома HAdV D8 и HAdV D37. Мы наблюдали значительное подавление репликации аденовирусов человека в первичных клетках Limb. Количество копий генома HAdV D8 и HAdV D37 снижалось на 59 и 58% под действием shE2В, на 37 и 30% под действием shЕ1А, а также на 73 и 60% под действием одновременно shE2B и shE1A соответственно по сравнению с контролем (рис. 4Г). Мы предполагаем, что в результате подавления экспрессии ранних генов аденовируса группы D человека цикл репликации аденовируса останавливается на ранней стадии. Это объясняет существенное снижение количества копий генома аденовирусов. Тем не менее нам не удалось добиться полного подавления вирусной репликации. Это можно связать с высоким значением множественности инфекции (20 ФОЕ/клетку), временем анализа образцов - 6 дней после инфекции, тогда как максимальный эффект подавления экспрессии целевых генов с помощью shРНК наблюдается на 9-10 день (рис. 4В) [10, 11], а также невысокой эффективностью трансдукции первичных клеток лимба человека (50-70% флуоресцирующих клеток в популяции по данным флуоресцентной микроскопии). В ходе эксперимента мы использовали первичные клетки лимба человека, входящие в состав роговицы глаза человека, которая поражается при эпидемическом кератоконъюнктивите. Также мы использовали HAdV D8 и D37, основных возбудителей данного заболевания. Таким образом, нам удалось разработать модельную систему аденовирусной офтальмологической инфекции in vitro, и с высокой эффективностью применить shРНК, направленные против ранних генов аденовирусов группы D человека, в качестве предполагаемых терапевтических агентов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами разработан подход к эффективному подавлению репликации аденовирусов группы D человека с помощью РНК-интерференции. С целью оценки ингибирующей активности siРНК, специфичных в отношении гена E1A HAdV D8, D19, D36 и D37, а также лентивирусных векторов, направляющих в клетках синтез аналогичной shРНК, мы получили модельные линии клеток, геном которых содержит экспрессирующую кассету «промотор - ген Е1А-D36 - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину». Такие модельные линии клеток позволяют быстро определять эффективность действия интерферирующих РНК, комплементарных различным участкам мРНК целевого гена. Показана высокая эффективность таких векторов при подавлении репликации аденовирусов типов 8 и 37 группы D человека в первичных клетках лимба человека. Сочетанное действие shЕ1А и shE2B приводило к снижению числа копий генома аденовирусов в среднем на 70%. Мы надеемся, что результаты нашего исследования будут полезны для разработки и создания современных лекарственных средств, высокоэффективных при заболеваниях человека, вызываемых аденовирусами.

Об авторах

Н. A. Никитенко

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: prassolov45@mail.ru
Россия

T. Speiseder

Heinrich Pette Institute - Leibniz Institute for Experimental Virology

Email: prassolov45@mail.ru
Германия

E. Lam

Heinrich Pette Institute - Leibniz Institute for Experimental Virology

Email: prassolov45@mail.ru
Германия

П. M. Рубцов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: prassolov45@mail.ru
Россия

Х. Д. Тонаева

МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава РФ

Email: prassolov45@mail.ru
Россия

С. A. Борзенок

МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава РФ

Email: prassolov45@mail.ru
Россия

T. Dobner

Heinrich Pette Institute - Leibniz Institute for Experimental Virology

Email: prassolov45@mail.ru
Германия

В. С. Прасолов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: prassolov45@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы