Белки системы врожденного иммунитета растений, осуществляющие транспорт липидов: структура, функции и практическое применение

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Липиды и их производные принимают участие в са мых разнообразных процессах, включая биогенез мембран, дифференцировку клеток, межклеточную и внутриклеточную передачу сигналов, образование водоотталкивающих и термоизоляционных покро вов, защищающих растение от воздействия небла гоприятных факторов окружающей среды, а также выполняют запасающую и энергетическую функ ции. В клетках про- и эукариот важную роль в ме таболизме липидов играют белки, осуществляющие их внутри- и внеклеточный транспорт. В растениях обнаружено несколько классов белков, обладающих способностью связывать и транспортировать липи ды и их производные: ацил-КоА-связывающие бел ки (Acyl-CoA-Binding Proteins), гликолипид-транс портирующие белки (Glycolipid Transfer Proteins), стерин-переносящие белки (Sterol Carrier Proteins), гомологи основного пыльцевого аллергена березы Betula verrucosa, зарегистрированного в базе данных аллергенов IUIS под аббревиатурой Bet v 1, белки, связывающие жирные кислоты (Fatty Acid Binding Proteins), пуроиндолины (Puroindolines) и липид транспортирующие белки (Lipid Transfer Proteins). Сопоставление аминокислотных последовательно стей белков перечисленных классов выявило отсут ствие значительной структурной гомологии между ними. Эти белки имеют внутри- или внеклеточную локализацию, относительно небольшую молекуляр ную массу (7-30 кДа), высокое значение изоэлек трической точки (pI ~9-11) и компактную структу ру, стабилизированную дисульфидными связями. Для пространственной структуры белков, осущест вляющих транспорт липидов, характерно наличие гидрофобной впадины, внутри которой располага ется сайт связывания лигандов. Эти белки обратимо связывают липиды и доставляют их к месту назна чения. Белки некоторых из перечисленных классов имеют высокоспецифичные лиганды, другие белки связывают и переносят широкий спектр липидов. К функционально наиболее значимым классам белков растений, связывающих и переносящих липи ды, относятся ЛТБ. Эти белки были открыты в 1970 г. и первоначально названы фосфолипид-обмениваю щими белками [1], а позднее переименованы в фос фолипид-транспортирующие белки [2]. Дальнейшие исследования показали, что лигандами данных бел ков могут быть не только фосфолипиды, но и другие гидрофобные молекулы, в связи с чем ЛТБ получили свое нынешнее название - неспецифические липид транспортирующие белки [3]. СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛТБ РАСТЕНИЙ На основании особенностей структурной организации растительные ЛТБ подразделяются на два подкласса: ЛТБ1 с молекулярной массой 9-10 кДа и ЛТБ2 с мо лекулярной массой около 7 кДа (таблица). Гомология аминокислотных последовательностей у предста вителей двух подклассов не превышает 30% (рис. 1). Все ЛТБ являются основными белками (pI ~9-10). Подавляющее большинство ЛТБ содержат восемь консервативных остатков цистеина (..CI…CII…CIIICIV…CVXCVI…CVII…CVIII..), образующих четыре дисульфид ные связи, которые стабилизируют структуру и тем самым обуславливают устойчивость ЛТБ к действию высоких температур и протеолитических ферментов. Некоторые представители белков этого класса со храняют нативную конформацию и биологическую активность даже после прогревания при температу ре около 100°С [4]. Пространственная структура ЛТБ представлена в основном α-спиральными участками. Гидрофобные аминокислотные остатки ЛТБ обраще ны внутрь молекулы и не вступают в близкий контакт, формируя внутри белка впадину, содержащую по тенциальный сайт связывания гидрофобных и амфи фильных молекул, таких, как липиды. ЛТБ1 состоят из 90-95 аминокислотных остатков и имеют следующий порядок образования дисульфид ных связей: СI-СVI, СII-СIII, СIV-СVII, СV-СVIII (рис. 1А, 2А). Фрагмент -СVХСVI- в структуре ЛТБ1 содержит гидрофильную аминокислоту (чаще всего аспара гин), боковая группа которой экспонирована на по верхности молекулы. Пространственная структура этих белков сформирована четырьмя α-спиралями, фрагментом 310-спирали и протяженным неструк турированным С-концевым участком (рис. 2А) [5, 6]. В структуре некоторых ЛТБ1, например, выделенных из кукурузы (Zea mays) и табака (Nicotiana tabacum), спирали Н1 и Н4 разделены остатками пролина на два фрагмента (Н1а и Н1b, Н4a и Н4b соответственно). Гидрофобная впадина ЛТБ1 имеет форму вытяну того туннеля, в формировании которого принимают участие спирали Н1, Н2 и Н3, расположенные парал лельно друг другу. Гидрофобный характер поверх ности туннеля обусловлен боковыми радикалами та ких аминокислотных остатков, как Ile, Val, Leu, Ala, но наряду с этим в формировании впадины участвуют гидрофильные остатки Arg, Lys, Ser [7]. Туннель в мо лекулах белков ЛТБ1 имеет два входа, различающих ся по размеру. У большинства ЛТБ1 около большого входа располагается основный остаток Arg44 (нуме рация относительно ЛТБ1 риса Oryza sativa), который взаимодействует с полярными головками липидов [8]. У ЛТБ1 риса в этом взаимодействии принимает участие еще один основный остаток - Lys35. Кроме остатков цистеина в молекуле большинства ЛТБ1 присутствуют консервативные остатки глицина и про лина, обеспечивающие повороты между спиралями; два остатка тирозина, один из которых находится в N-концевой области на внешней стороне α-спирали, а второй расположен в С-концевой области у большого входа в гидрофобный туннель и участвует во взаимо действии с лигандами [7, 9]. ЛТБ2, состоящие из 65-70 аминокислотных остат ков, изучены в меньшей степени, чем ЛТБ1. ЛТБ2 во фрагменте -СVХСVI- в качестве центрального остатка чаще всего содержат фенилаланин, обра щенный внутрь молекулы, и имеют иную организа цию дисульфидных связей: СI-СV, СII-СIII, СIV-СVII, СVI-СVIII (рис. 1Б, 2Б) [10]. Пространственная струк тура белков этого подкласса включает три α-спирали и область, содержащую одиночные витки спирали (рис. 2Б). В структуре ЛТБ2 спирали H1 и H2 рас полагаются параллельно друг другу, а спираль H3 направлена под углом 90° относительно H2. Гидрофобная впадина ЛТБ2 по форме напоминает трехгранный полый бокс с расположенными внутри боковыми радикалами остатков Ala, Ile, Leu, Phe и Val. Трехгранный бокс ЛТБ2 по объему меньше ги дрофобной полости ЛТБ1, однако его более выражен ная пластичность позволяет белкам этого подкласса связывать крупные лиганды с жесткой структурой, например стерины [10-12]. Боковые радикалы Phe39, Tyr45 и Tyr48 (нумерация относительно ЛТБ2 риса) повернуты внутрь полости и контактируют с ли пидным лигандом [13]. Помимо остатков цистеина в структуре ЛТБ2 присутствуют консервативные остатки Gln, Tyr и Pro. Объем гидрофобной впадины у ЛТБ обоих подклас сов может значительно изменяться. Например, размер гидрофобной впадины у ЛТБ1 риса равен 249 Å3, одна ко при связывании белка с пальмитиновой кислотой ее объем увеличивается до 1354 Å3. Такая пластичность молекул ЛТБ может быть причиной их низкой специфичности к липидному лиганду. СВЯЗЫВАНИЕ И ТРАНСПОРТ ЛИПИДОВ Наличие в структуре молекул ЛТБ гидрофобной впа дины позволяет этим белкам связывать и переносить различные лиганды. Образование комплексов ЛТБ с лигандами in vitro зависит от размера гидрофобной полости и формирующих ее аминокислотных остат ков, пространственной структуры лиганда, а также от условий эксперимента (рН, состав буфера, темпе ратура). Показано, что ЛТБ, выделенные из различ ных растительных источников, способны связывать липиды. Однако стоит отметить, что существуют и исключения из этого правила. Так, белок из семян лука (Allium cepa), названный Ace-AMP1, облада ет выраженной гомологией с растительными ЛТБ, но не взаимодействует с липидами, возможно, из-за отсутствия единой полости внутри молекулы белка [14]. Различные ЛТБ связывают широкий спектр лигандов, включая жирные кислоты (ЖК) с дли ной цепи С10-С18, ацильные производные коэнзима СВЯЗЫВАНИЕ И ТРАНСПОРТ ЛИПИДОВ Наличие в структуре молекул ЛТБ гидрофобной впа дины позволяет этим белкам связывать и переносить различные лиганды. Образование комплексов ЛТБ с лигандами in vitro зависит от размера гидрофобной полости и формирующих ее аминокислотных остат ков, пространственной структуры лиганда, а также от условий эксперимента (рН, состав буфера, темпе ратура). Показано, что ЛТБ, выделенные из различ ных растительных источников, способны связывать липиды. Однако стоит отметить, что существуют и исключения из этого правила. Так, белок из семян лука (Allium cepa), названный Ace-AMP1, облада ет выраженной гомологией с растительными ЛТБ, но не взаимодействует с липидами, возможно, из-за отсутствия единой полости внутри молекулы белка [14]. Различные ЛТБ связывают широкий спектр лигандов, включая жирные кислоты (ЖК) с дли ной цепи С10-С18, ацильные производные коэнзима А (КоА), фосфо- и галактолипиды, простагландин В2, стерины, молекулы органических растворителей и некоторые лекарственные вещества [15, 16]. Хотя выраженной специфичности в отношении лигандов у ЛТБ нет, наиболее прочные комплексы эти бел ки образуют с ЖК, содержащими от 16 до 18 угле родных атомов. С молекулами, длина цепи которых превышает С20, ЛТБ не образуют устойчивых ком плексов из-за пространственных ограничений, нала гаемых размерами гидрофобной впадины [17]. Кроме того, показано, что на прочность комплекса влияет количество двойных связей в молекулах ЖК и их конфигурация. Наиболее прочные комплексы ЛТБ образуют с различными непредельными ЖК с одной или двумя двойными связями в цис-конфигурации [18], две из которых - линолевая и олеиновая кисло ты - являются предшественниками мономеров кути на и суберина. ЛТБ1, в отличие от ЛТБ2, не связывают стерины. Установлено, что в зависимости от пространствен ной организации молекул ЛТБ1 и лиганда ориента ция последнего в гидрофобной впадине может быть различной. Например, в комплексах ЛТБ1 кукурузы с 1-пальмитоиллизофосфатидилхолином [9] и ЛТБ1 пшеницы (Triticum aestivum) с димиристоилфосфа тидилглицерином [18] лиганды размещаются в по лости белка в «прямой» ориентации, т.е. полярные го ловки липидов расположены вблизи большого входа в гидрофобную впадину. В то же время в комплексе ЛТБ1 ячменя (Hordeum vulgare) с пальмитоил-КоА лиганд имеет «обратную» ориентацию, его алифа тические цепи сильно изогнуты и полярная головка направлена в сторону меньшего входа впадины [19]. ЛТБ1 растений могут связывать одну или две молекулы лизофосфолипида [20]. Предполагается, что ЛТБ этого подкласса взаимодействуют с лиган дами согласно кооперативной модели связывания. Если в гидрофобной полости находятся две молеку лы лиганда, то их ориентация и прочность связыва ния с белком не одинаковы. Так, в комплексе ЛТБ1 пшеницы с изомиристоилфосфатидилхолином две молекулы этого лиганда ориентированы в гидро фобной полости по принципу «голова к хвосту» [19, 21]. Высказывается предположение, что второй сайт связывания в ЛТБ активируется только тогда, когда первый уже занят лигандом. Показано, что в регуляции связывания липи дов растительными ЛТБ принимает участие каль ций-кальмодулиновая система. Растительные ЛТБ связываются с кальмодулином вне зависимости от присутствия ионов кальция. Потенциальный сайт связывания кальмодулина с Zm-LTP куку рузы и Ace-AMP1 лука лежит в средней части по липептидной цепи ЛТБ (аминокислотные остатки 46-60) и имеет структуру, сходную с ВАА-доменом (Basic Amphiphilic α-helix) кальмодулин-связыва ющих белков [22]. Отличительной особенностью ВАА-подобного домена у растительных ЛТБ явля ется отсутствие Trp, имеющего решающее значение для кальций-зависимого связывания кальмодулина. В присутствии кальмодулина у Zm-LTP кукурузы снижается способность связывать липиды, что объ ясняется локализацией в кальмодулин-связываю щем центре этого белка остатка Arg46, участвующего в связывании липидов. В то же время сайт связыва ния кальмодулина у белка репы (Brassica rapa), на званного BP-10, и ЛТБ1 арабидопсиса (Аrabidopsis thaliana) находится в С-концевой области (аминокис лотные остатки 69-81) и не имеет структурного сход ства ни с одним из известных кальмодулин-связы вающих центров [23]. Образование комплекса BP-10 с кальмодулином приводит к повышению эффектив ности связывания липидов. Причиной этого эффекта считается расположение в кальмодулин-связываю щем центре данного ЛТБ остатка Tyr81, играющего важную роль во взаимодействии с липидным лиган дом. ЛТБ растений не только связывают липиды, но и осуществляют их перенос между мембранами в опытах in vitro. Они переносят фосфолипиды, на пример, фосфатидилхолины (ФХ), фосфатидилино зиты (ФИ), фосфатидилглицерины (ФГ) и их произ водные, а также ацил-КоА [24-26]. На примере ЛТБ пшеницы показано, что липид-транспортирующая ак тивность ЛТБ2 в несколько раз выше, чем у ЛТБ1 [27]. Механизм транспортировки липидов с участи ем ЛТБ до сих пор неизвестен. Предполагается, что растительные ЛТБ, так же как и фосфатидил холин-специфичные ЛТБ млекопитающих, пере носят липиды по челночному механизму. Комплекс ЛТБ-фосфолипид взаимодействует с мембраной, в результате чего происходит обмен фосфолипидами между комплексом и мембраной [3]. Прямые доказательства участия ЛТБ растений в связывании и переносе липидов in vivo до сих пор отсутствуют. Единственным комплексом ЛТБ c ли гандом, обнаруженным в растительных клетках, является ковалентный аддукт LTP1 ячменя с окси липином, образующийся при взаимодействии кар боксильной группы Asp7 с оксидом аллена в моле куле 9(S),10-эпокси-10,12(Z)-октадекадиеновой кислоты [28, 29]. В результате реакции образуется α-кетол - 9-гидрокси-10-оксо-12(Z)-октадеценовая кислота. Необходимо отметить, что образование это го ковалентного комплекса, получившего название LTP1b, приводит к увеличению пластичности гидро фобной впадины белка и его способности переносить липиды. Некоторые ЛТБ способны не только связывать и переносить липиды, но и разрушать модельные мембраны. В качестве примера можно привести бе лок подсолнечника (Helianthus annuus), названный Ha-AP10, который разрушает липосомы, состо ящие из ФХ и ФГ [30]. Интересно отметить отсут ствие корреляции между липид-связывающей и ли пид-переносящей активностью и способностью ЛТБ разрушать мембраны. Например, ЛТБ ячменя свя зывает широкий спектр липидов, однако слабо вли яет на свойства модельных мембран [31]. Ace-AMP1 лука не связывает липиды, но нарушает целостность двухслойных везикул, состоящих из анионных ли пидов [14]. БИОСИНТЕЗ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ Класс ЛТБ относится к большому семейству бел ков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins, или PRP). Индукция синтеза данных белков происходит при воздействии на растение абиотиче ских и биотических стрессорных факторов и лежит в основе одного из ключевых защитных механизмов, имеющихся в арсенале растений. PRP присутствуют во всех органах растений, накапливаются в вакуо лях и апопласте, а также в первичной и вторичной клеточной стенке. Такая локализация согласуется с защитной функцией PRP, которые, наряду с анти микробными пептидами (AMP), создают своеобраз ный барьер на пути проникновения патогена [32]. Семейство белков, связанных с патогенезом, по мимо ЛТБ (PRP-14), включает белки еще 16 клас сов: глюканазы (PRP-2), хитиназы (PRP-3,4,8), ин гибиторы протеиназ (PRP-6), гомологи основного пыльцевого аллергена березы Bet v 1 (PRP-10), дефенсины (PRP-12), тионины (PRP-13) и др. [33]. Абиотическими индукторами синтеза PRP являются УФ-излучение, осмотический шок, дефицит влаги, низкие температуры, засоление почвы. Синтез PRP при инфицировании растения индуцируется как пер вичными, так и вторичными элиситорами - неспецифичными патоген-ассоциированными молекуляр ными структурами (Pathogen Associated Molecular Patterns, или PAMP), и структурами, ассоциирован ными с повреждением (Damage-Associated Molecular Patterns, или DAMP), а также специфичными эф фекторными белками патогенов. Индукторами син теза PRP являются такие фитогормоны, как этилен, ауксины, абсцизовая, жасмоновая и салициловая кислоты. На определенных стадиях онтогенеза ак тивация синтеза и тканеспецифичная аккумуляция PRP происходят также в отсутствие факторов стрес са [34]. ЛТБ обнаружены в различных органах растений - семенах, листьях, стеблях, корнях, цветках и плодах. Чаще всего ЛТБ локализуются в покрытых кутику лой клетках эпидермиса, но обнаруживаются также в эмбриональных и сосудистых тканях. ЛТБ синте зируются в растительных клетках в виде пребелков, содержащих гидрофобную сигнальную последова тельность (21-27 или 27-35 аминокислотных остат ков у ЛТБ1 или ЛТБ2 соответственно), и являются секреторными белками с преимущественно внекле точной локализацией [35, 36]. Некоторые ЛТБ име ют нехарактерную внутриклеточную локализацию. Так, ЛТБ из семян клещевины (Ricinus communis) обнаружен в глиоксисомах [37], ЛТБ из семян виг ны (Vigna unguiculata) - в вакуолях [38], Ca-LTP(1) из семян перца (Capsicum annuum) - в везикулах [39]. Особый интерес представляет вопрос о том, ка ким образом ЛТБ, синтезируемые в виде пребелков и не имеющие соответствующих сигнальных после довательностей, попадают в эти клеточные органел лы. Установлено, что ЛТБ подсолнечника Ha-AP10 изменяет свою локализацию. В покоящихся семенах Ha-AP10 находится в апопласте, но при набухании и прорастании семени, возможно, с помощью эндо цитоза, поступает внутрь клеток и переходит в ор ганеллы, участвующие в метаболизме липидов [40]. В некоторых растениях обнаружены ЛТБ, назван ные LTPG (GPI-anchored Lipid Transfer Proteins), которые синтезируются в виде предшественников, содержащих помимо N-концевого сигнального пеп тида С-концевую сигнальную последовательность. Эта последовательность обеспечивает посттрансля ционное присоединение к белку гликозилфосфатиди линозитного якоря (ГФИ), благодаря которому LTPG могут локализоваться на внешней стороне плазма тической мембраны или секретироваться в апопласт после отщепления ГФИ-якоря [41]. Еще одну груп пу необычных ЛТБ, имеющих внеклеточную лока лизацию, составляют ксилоген из циннии (Zinnia elegans) и ксилоген-подобные белки других растений [42]. В структуре генов ксилоген-подобных белков, которые относятся к большому семейству арабинога лактановых белков (АГБ), присутствует сигнальный пептид, домен ЛТБ, несколько доменов АГБ и ГФИ якорь. В процессе созревания эти белки претерпева ют ряд посттрансляционных превращений, включая удаление N-концевого сигнального пептида, присо единение ГФИ-якоря, гидроксилирование остатков пролина и О-гликозилирование [42]. ЛТБ растений кодируются мультигенными се мействами и в геноме растений, как правило, пред ставлены набором генов, кодирующих различные изоформы. Экспрессия генов различных изоформ ЛТБ отличается ярко выраженной тканевой специфичностью и происходит на определенных стади ях онтогенеза [36]. Предполагается, что это связано с тем, что разные изоформы ЛТБ выполняют раз личные функции [43]. Дифференциальная экспрес сия генов множественных изоформ ЛТБ происхо дит также при воздействии на растение различных абиотических и биотических факторов окружающей среды и может рассматриваться как один из эле ментов защитной стратегии в условиях стресса [44]. Дифференциальная экспрессия генов изоформ пока зана на примерах ЛТБ кунжута (Sesamum indicum) [45], арабидопсиса [43, 46], перца [47], клещевины [37], винограда (Vitis vinifera) [48], тамарикса жестковоло систого (Tamarix hispida) [49] и томата (Lycopersicon pennellii) [50]. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛТБ, как уже упоминалось, составляют один из клас сов защитных PRP, многие из которых обладают антимикробной и ферментативной активностями или являются ингибиторами ферментов. Различные представители класса ЛТБ проявляют антибакте риальную, противогрибковую, противовирусную, антипролиферативную активности, обладают спо собностью влиять на активность разнообразных фер ментов [36]. Антимикробная активность Многие ЛТБ обладают антимикробной активностью и ингибируют рост таких фитопатогенных бактерий и грибов, как Clavibacter michiganensis, Pseudomonas solanacearum, P. syringae, Alternaria brassicola, Ascochyta pisi, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium solani, F. graminearum, F. culmorum, F. oxysporum, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae и др. ЛТБ из перца и кофе (Coffea canephora) активны также в отноше нии патогенных для человека штаммов грибков рода Candida [39, 51]. Антимикробное действие большин ства растительных ЛТБ характеризуется специфич ностью и проявляется в отношении определенного спектра микроорганизмов. Выраженной антимикроб ной активностью в микромолярных концентрациях обладают ЛТБ из лука [52], редиса (Raphanus sativus) [52] и арабидопсиса [53]. Основная же масса ЛТБ уме ренно или слабо влияет на рост микроорганизмов, в некоторых случаях это влияние вообще отсутству ет [54]. Антимикробная активность ЛТБ растений снижается в растворах с высокой концентрацией соли и в присутствии ионов кальция, что сближа ет данные белки с другими классами растительных AMP и PRP [52]. Как и растительные дефенсины, ЛТБ обладают способностью действовать в синергиз ме с тионинами [55], не оказывают токсического дей ствия на растительные клетки и клетки млекопита ющих, включая фибробласты и эритроциты [30, 52]. Разрушение дисульфидных связей, стабилизи рующих структуру растительных ЛТБ, приводит к тому, что эти белки теряют способность ингиби ровать рост микроорганизмов и связывать липиды [56]. В то же время другие аминокислотные остатки, необходимые для проявления антимикробной актив ности, остаются неизвестными. Для LTP110 из риса показано, что для проявления антимикробной ак тивности этого белка важны консервативные остат ки Tyr17, Arg46 и Pro72, которые у большинства ЛТБ1 играют существенную роль в стабилизации структуры белка [57]. При изучении изоформ ЛТБ пшеницы показано, что отличие всего в один амино кислотный остаток (Pro3Ser в изоформах TaLt10B6 и TaLt710H24, Asn24Ser в TaLt10F9 и TaBs116G9) существенно влияет на антимикробную активность белков. Предполагается, что замена даже одного ами нокислотного остатка может приводить к изменению пространственной структуры ЛТБ и влиять на рас пределение положительного заряда на поверхности его молекулы [56]. На сегодняшний день установлено, что антими кробная активность растительных ЛТБ не связана с их способностью взаимодействовать с липидами. Так, на примере восьми изоформ ЛТБ пшеницы по казано отсутствие корреляции между способностью этих белков ингибировать рост патогенных микроор ганизмов и связывать липиды [56]. На примере Ace-AMP1 лука [52] и мутантной изоформы ЛТБ риса [57] также показано, что белки данного класса могут об ладать антимикробной активностью, но не связывать при этом молекулы липидов и наоборот. Растительные ЛТБ оказывают не только фунги статическое, но и фунгицидное действие и подобно другим AMP вызывают нарушение проницаемости модельных мембран [30] и цитоплазматических мем бран фитопатогенных грибов [30, 56]. Так, ЛТБ лука [14], подсолнечника [30] и в меньшей степени ячменя [31] обладают способностью нарушать проницаемость липосом, состоящих только из анионных фосфоли пидов или из смеси анионных и нейтральных фосфо липидов, вызывая утечку из них флуоресцентного красителя. Однако стоит отметить, что этот эффект выражен гораздо слабее, чем у других AMP расте ний, и наблюдается только в растворах с низкой ион ной силой. Механизм антимикробного действия представи телей класса ЛТБ до сих пор неизвестен. Тем не ме нее возможной мишенью антимикробного действия ЛТБ считается цитоплазматическая мембрана. Предполагается, что растительные ЛТБ, как и дру гие катионные мембранотропные AMP, связываются посредством электростатических взаимодействий с цитоплазматической мембраной фитопатогена, вызывая ее дестабилизацию и нарушение прони цаемости. Ослаблением электростатического вза имодействия с клеточной мембраной фитопатоге на объясняется менее выраженная антимикробная активность изоформ ЛТБ, содержащих меньше ос новных аминокислотных остатков [56]. Считается, что возможной причиной избирательной токсично сти ЛТБ растений могут быть различия в липидном составе мембран клеток бактерий, грибов, растений и млекопитающих. Противовирусная, антипролиферативная активность Показано, что ЛТБ нарцисса (Narcissus tazetta) и ка пусты полевой (Brassica campestris), называемой так же сурепицей, обладают противовирусной активно стью и способностью ингибировать пролиферацию опухолевых клеток человека. ЛТБ нарцисса, обозна ченный как NTP, в экспериментах in vitro значитель но ингибировал образование бляшек респираторно го синцитиального вируса (RSV) и цитопатический эффект вируса гриппа A (H1N1), а также пролифе рацию линии клеток промиелоцитарного лейкоза человека (HL-60). ЛТБ капусты полевой подавлял активность обратной транскриптазы вируса имму нодефицита человека типа 1 (HIV-1), а также проли ферацию клеток злокачественной гепатомы HepG2 и рака молочной железы MCF7. Механизм противо опухолевой активности ЛТБ пока не установлен [58, 59]. Ингибирование активности ферментов Отдельные представители класса ЛТБ, как и ингиби торы протеаз (PRP-6), и некоторые дефенсины (PRP- 12) [60, 61], обладают способностью подавлять актив ность протеолитических ферментов и α-амилаз. Так, обнаружено, что ЛТБ обоих подклассов из семян яч меня ингибируют активность цистеиновых эндопро теаз [62]. Также показано, что ЛТБ1 из семян гинкго двулопастного (Ginkgo biloba) подавляет активность цистеиновой (папаин), аспартатной (пепсин) и сери новой (трипсин) протеаз [63]. ЛТБ1 из семян кофе и перца ингибируют активность α-амилазы человека [39, 51]. Как полагают, ЛТБ, способные ингибировать активность собственных и чужеродных ферментов, могут принимать участие как в развитии и прорас тании семян, так и в защите растения от насекомых и травоядных животных. ВОЗМОЖНЫЕ ФУНКЦИИ ЛТБ Известно, что ЛТБ играют важную роль в растениях. Выключение генов, кодирующих данные белки, при водит к нарушению вегетативного и репродуктив ного развития растений, снижению их устойчивости к инфекциям [43, 64, 65]. На основании результатов исследований по подавлению экспрессии генов ЛТБ высказан ряд предположений о возможном участии представителей данного класса белков в адаптации растений к стрессу, метаболизме липидов, эмбри огенезе, росте и размножении растений, симбиозе и других процессах. Считается, что многие из этих функций обусловлены способностью ЛТБ связывать и переносить молекулы липидов (рис. 3). Участие в метаболизме липидов В связи с тем, что растительные ЛТБ обладают спо собностью связывать и переносить молекулы липи дов, считается, что эти белки принимают участие в целом ряде процессов, сопровождающихся из менениями липидного состава. Для ЛТБ, имеющих внеклеточную локализацию, предполагается уча стие в формировании защитного слоя кутикулы, мономерные компоненты которой образуются в эпи дермальных клетках и доставляются к месту био синтеза. Активация биосинтеза кутикулы, которая играет важную роль в поддержании водного баланса и защите растений от проникновения патогенов, про исходит в условиях действия разнообразных стрес сорных факторов и является одним из защитных механизмов растений. Прямых доказательств при частности ЛТБ к этому процессу пока не найдено, од нако показано, что растительные ЛТБ присутствуют в высоких концентрациях в эпидермальных тканях и способны связывать жирные кислоты, необходи мые для синтеза кутина и суберина. Кроме того, ин дукция синтеза ЛТБ сопровождается утолщением слоя кутикулы [66], а выключение генов ЛТБ при водит к изменению липидного состава и плотности кутикулярного слоя [67]. Предложено два возможных механизма доставки компонентов кутикулы с уча стием ЛТБ. В соответствии с первым из них ЛТБ поступают в клетку посредством рецептор-опосре дованного эндоцитоза, осуществляемого при слия нии везикул, содержащих ЛТБ и мономеры кутина. Второй механизм предполагает функционирование ЛТБ между плазматической мембраной и клеточ ной стенкой растения и существование молекулы переносчика, действующего с внутренней стороны плазматической мембраны [68]. Интересен тот факт, что ЛТБ1 присутствуют в органах, покрытых слоем кутина (листья, стебли, цветки), в то время как ЛТБ2 обнаруживаются в покрытых суберином подземных органах. Это свидетельствует в пользу дифферен циального участия белков первого и второго под классов в формировании кутинового и субериново го слоев [35]. Показано также, что LTPG, имеющие ГФИ-якорь, возможно, принимают участие в биосин тезе и накоплении суберина [41]. ЛТБ, обнаруженные в различных внутрикле точных органеллах, предположительно участвуют в мобилизации липидов, осуществляя их транспорт, например при прорастании семени. Так, ЛТБ клеще вины, обнаруженный в глиоксисомах, связывает ЖК как в свободной форме, так и в виде ацил-КоА. Этот белок увеличивает также активность ацил-КоА-ок сидазы, которая участвует в реакции β-окисления ЖК [37]. Предполагается, что ЛТБ подсолнечника Ha-AP10, поступающий в клетки при прорастании семян, переносит в глиоксисомы ЖК, высвободив шиеся при расщеплении триацилглицеринов, для их дальнейшего β-окисления [40]. Показано, что индукция экспрессии генов, коди рующих ЛТБ моркови (Daucus carota), наблюдает ся на ранних стадиях эмбриогенеза, когда происхо дит разрушение одних и биосинтез других липидов, а также формирование защитного липидного слоя вокруг зародыша [69]. Роль этого белка в процессе эмбриогенеза предположительно заключается в уча стии в этих процессах посредством переноса соответ ствующих липидных молекул. Участие в оплодотворении цветковых растений Считается, что растительные ЛТБ играют важную роль в репродукции цветковых растений. Так, ЛТБ1 лилии (Lilium longiflorum) является компонентом, необходимым для адгезии пыльцы, формирования и роста пыльцевой трубки [70]. Предполагается, что ЛТБ1 может действовать непосредственно как адгезивный компонент либо как переносчик ги дрофобного адгезивного компонента. Показано так же, что одна из изоформ липид-транспортирующего белка арабидопсиса, LTP5, участвует в росте пыль цевой трубки и формировании семян [64]. Выявлена роль ЛТБ риса OsC6 в постмейотиче ском развитии пыльцы. Установлено, что данный белок присутствует в тканях пыльника и обладает способностью связывать ЖК. Полагают, что OsC6 участвует в формировании липидных орбикул и пыльцевой экзины, осуществляя перенос необходи мых липидов из клеток тапетума к микроспорам [65]. Участие в защите и адаптации растений в условиях стресса Утверждение, что ЛТБ участвуют в защите и адап тации растений к воздействию стрессорных фак торов, основано, в основном, на повышении уровня синтеза этих белков. Так, синтез ЛТБ, как и других PRP, индуцируется при механическом повреждении, дефиците влаги, низких температурах, засолении почвы, инфицировании, а также при обработке рас тения химическими агентами [43, 45, 47, 50, 71, 72]. Индукция экспрессии генов ЛТБ в условиях стресса, возможно, связана с наличием в их промоторной об ласти регуляторных элементов, характерных также для генов других PRP. В регуляции экспрессии генов ЛТБ участвуют такие фитогормоны, как абсцизовая и салициловая кислоты, этилен и метилжасмонат [36]. Считается, что одной из возможных причин ин дукции экспрессии генов ЛТБ в условиях стресса является вовлеченность этих белков в биосинтез ку тикулярного слоя [50]. Защитная функция ЛТБ в рас тениях обусловлена их антимикробной активностью, криопротекторным действием и свойствами ингиби торов экзогенных ферментов, а также возможным участием в секреции других компонентов иммунной системы растений. Железистые волоски (трихомы) растений выраба тывают эфирные масла, которые принимают участие в обмене веществ, защищают растение от вредите лей, оказывают ранозаживляющее действие, слу жат для привлечения насекомых и предохраняют от перегревания. Обнаружено, что NtLTP1 табака (N. tabacum) специфически экспрессируется в длинных железистых волосках и участвует в секреции из го ловок трихом компонентов эфирных масел (дитерпе нов, алифатических углеводородов и ароматических кислот), которые являются защитными факторами растений [73]. Транскрипты генов ЛТБ обнаруже ны в железистых волосках и других растений, на пример, мяты (Mentha piperita), люцерны (Medicago sativa), полыни (Artemisia annua), хмеля (Humulus lupulus), шалфея (Salvia fruticosa) и томата [73]. Известно, что устойчивость растений к холо ду связана со стабилизацией клеточных мембран и предотвращением снижения растворимости белков при понижении температуры. В листьях акклима тизированной к холоду капусты (Brassica oleracea) обнаружены белки класса WAX9, имеющие вы сокую степень гомологии аминокислотных после довательностей с ЛТБ. Данные белки не обладают способностью связывать липиды, но подобно β-1,3 глюканазам, осмотинам и лектинам, способны в усло виях холода стабилизировать мембраны тилакоидов [72]. Предполагается, что механизм криопротектор ного действия этих белков связан с уменьшением подвижности мембранных липидов и проницаемости бислоя при взаимодействии ЛТБ с мембраной тила коидов [74]. Участие в активации и регуляции сигнальных каскадов Предполагается, что ЛТБ, образуя комплексы с раз личными молекулами липидов, могут принимать уча стие в активации и регуляции различных сигнальных каскадов в растениях. Одним из классов сигнальных медиаторов растений являются оксилипины, кото рые образуются из ненасыщенных ЖК под действи ем активных форм кислорода (АФК) или ферментов и участвуют в регуляции роста и развития растения, а также в запуске ответных защитных реакций в ус ловиях стресса. Помимо этого, оксилипины регули руют процессы обезвреживания токсичных компо нентов, образующихся во время стресса. Как уже упоминалось, ЛТБ1 ячменя в процессе прорастания семян формирует ковалентные комплексы с оксили пином - 9(S),10-эпокси-10,12(Z)-октадекадиеновой кислотой, содержащей нестабильный алленоксид, образующийся в результате последовательного дей ствия липоксигеназы и алленоксидсинтазы [28, 29]. Такое взаимодействие может свидетельствовать о совместном участии ЛТБ и оксилипинов в регуля ции сигнальных путей, запускающих механизм пре дотвращения повреждения клеток растения в усло виях стресса [29]. ЛТБ в комплексе с молекулами липидов действу ют как эндогенные элиситоры, взаимодействующие со специфическими рецепторами на цитоплазма тической мембране растительных клеток и обеспе чивающие развитие иммунного ответа в условиях инфицирования (рис. 4). Так, показано, что ЛТБ риса и табака обладают способностью взаимодей ствовать с элиситиновыми рецепторами [21, 75, 76]. Элиситины - хорошо изученные PAMP расте ний, которые имеют молекулярную массу около 10 кДа и продуцируются фитопатогенными оомице тами (Phytophthora и Pythium), паразитирующими на высших растениях. Данные белки, благодаря на личию в их структуре гидрофобной впадины, обла дают способностью связывать стерины и обеспечива ют фитопатогенные микроорганизмы необходимыми для их жизнедеятельности липидами, источником которых служат растения. Все элиcитины имеют α-спиральную структуру, стабилизированную тре мя дисульфидными связями, и в комплексе со стерином распознаются растением посредством рецептор-подобных киназ, расположенных на цито плазматической мембране. В результате распозна вания происходит активация в растениях защитных механизмов, таких, как образование фитоалексинов и АФК, развитие гиперчувствительного ответа (HR) и системной приобретенной резистентности (SAR) [77, 78]. Аминокислотные последовательности ЛТБ и элиcитинов имеют низкую степень гомологии, тог да как пространственные структуры этих белков об ладают выраженным сходством [79]. Растительные ЛТБ в комплексе с молекулой липида выступают в роли агонистов элиситинов и DAMP, связывают ся с рецепторами элиситинов и вызывают развитие иммунного ответа. Интересным фактом, говорящим о возможности существования различных путей ак тивации защитного ответа в растениях с участием представителей двух подклассов ЛТБ, является от личие в структуре гидрофобного лиганда, в роли ко торого для ЛТБ2 выступают молекулы стеринов [75], а для обладающих менее гибкой гидрофобной впади ной ЛТБ1 - жасмоновая кислота [21, 76]. Показано также, что необычный представитель ЛТБ2 из арабидопсиса, имеющий изоэлектрическую точку в кислой области pH и названный DIR1, играет ключевую роль в развитии SAR [80]. Предполагается, что данный белок в процессе инфицирования рас тения связывается с молекулами липидов (оксили пинами, жирными кислотами или моноацильными фосфолипидами), которые образуются в результате работы секретируемых патогеном липаз, после чего образованный комплекс взаимодействует с гипоте тическим рецептором, запуская сигнальный каскад, приводящий к развитию SAR [81]. Установлено, что ксилоген из циннии, содержащий ГФИ-якорь и связывающий растительные стерины, стимулирует превращение недифференцированных клеток в элементы трахеи и, возможно, участвует в межклеточных взаимодействиях и передаче сиг нала. Предполагается, что ксилогено-подобные бел ки других растений, ЛТБ-домены которых имеют большее сходство с ЛТБ2, также могут участвовать в межклеточных взаимодействиях и передаче сиг нала, функционируя в комплексе с липидной моле кулой [42]. Участие в апоптозе Предположение о возможном участии ЛТБ в апоп тозе выдвинуто на основании сходства между ЛТБ кукурузы и проапоптотическим белком Bid млеко питающих, который тоже имеет в своей структуре внутреннюю впадину, связывает и переносит липиды [82]. Bid находится в цитозоле и в присутствии лизо фосфолипидов, образующихся в процессе програм мируемой клеточной смерти, действует на митохон дрии, вызывая высвобождение факторов индукции апоптоза, в том числе цитохрома с. ЛТБ кукурузы в присутствии лизофосфолипидов также вызывает высвобождение цитохрома с из митохондрий. В ка честве возможного механизма дестабилизирующего действия обоих белков рассматривают перенос лизо фосфолипидов на наружную мембрану митохондрий, которые изменяют ее свойства, облегчая тем самым действие других проапоптотических белков [83]. Участие в симбиозе Известно, что симбиотические ризобактерии стиму лируют рост растений и защищают их от почвенных фитопатогенов, вызывая развитие так называемой индуцированной системной резистентности, кото рая фенотипически и функционально сходна с SAR [84]. Показано, что ЛТБ MtN5 люцерны играет важ ную роль в развитии симбиотических отношений между растением и клубеньковыми бактериями, а именно, вовлечен в процессы проникновения бак терий в ткани корня и формирования клубеньков [85]. Предполагается, что функция MtN5 заключается в поддержании баланса между бактериальной ин вазией и предотвращением развития инфекции [86]. Участие в созревании плодов Показано, что ЛТБ томата способен образовы вать комплексы с полигалактуроназой - фер ментом, катализирующим расщепление пектина. Предполагается, что ЛТБ томата при образовании комплекса повышает гидролитическую активность этого фермента и может участвовать в регуляции скорости размягчения и созревания плодов [87].

Об авторах

E. И. Финкина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ovch@ibch.ru
Россия

Д. Н. Мельникова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ovch@ibch.ru
Россия

И. В. Богданов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ovch@ibch.ru
Россия

T. В. Овчинникова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ovch@ibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы