Микоплазмы и их устойчивость к антибиотикам: проблемы и перспективы контроля микоплазменных инфекций и контаминаций клеточных культур

Полный текст

Большой интерес к микоплазмам (класс Mollicutes) обусловлен не только уникально стью организации этих мельчайших бакте рий, лишенных клеточной стенки, но и практической необходимостью. Микоплазмы - паразиты высших эукариот, являются возбудителями социально зна чимых инфекций, основными контаминантами кле точных культур и вакцинных препаратов. Контроль микоплазменных инфекций представляет серьезную проблему [1-3]. На протяжении нескольких десятилетий разраба тывали различные методы подавления микоплазм, но эффективные средства пока не найдены [4, 5]. Основной способ подавления микоплазменных ин фекций и контаминаций основан на использовании антибактериальных препаратов [2-4]. Существенную проблему представляет быстрое развитие устойчи вости микоплазм к антимикробным препаратам, ме ханизмы которого не вполне ясны. Предполагается, что решить проблему контроля микоплазменных инфекций и контаминаций можно будет, изучив молекулярно-генетические механизмы адаптации микоплазм к стрессовым условиям, определяющие выживание бактерий в различных условиях [1-5]. Очевидно, что проведение таких исследований пред полагает использование комплексного подхода с при влечением как классических методов, так и совре менных способов анализа биологического материала. В нашем обзоре обобщены и проанализирова ны данные о механизмах, определяющих устой чивость микоплазм к антимикробным препаратам. Представления об этих механизмах в значительной мере сложились в период, предшествовавший пост геномной эпохе. Между тем, успешная реализация геномных проектов и возникновение омиксных тех нологий привели к разработке новых подходов к из учению молекулярно-генетических основ адаптации бактерий к стрессовым условиям и выявлению ре зистомов - совокупности всех генов и их продуктов, принимающих участие в формировании устойчи вости микроорганизмов к антимикробным препара там [6-13]. В результате использования комплекс ного подхода получены данные, указывающие на то, что устойчивость бактерий к антимикробным препа ратам может обеспечиваться более сложными про цессами, чем это предполагалось ранее. Поскольку у представителей класса Mollicutes от сутствует клеточная стенка, основные классы анти микробных препаратов, такие, как бета-лактамные антибиотики, гликопептиды и фосфомицин, на них не влияют. Присущие микоплазмам биологические особенности определяют также неэффективность ряда других веществ (сульфонамидов, триметопри ма, рифампина, полимиксинов, налидиксовой кис лоты, линезолида и некоторых других). Среди пре паратов, проявляющих активность в отношении микоплазм, наиболее эффективны тетрациклины, фторхинолоны и макролиды. Именно они широ ко используются для подавления микоплазменных инфекций и контаминаций клеточных культур [4]. Правда, в самое последнее время появились сообще ния о новом классе бактериостатиков - ингибиторов деформилаз, активных в отношении урогенитальных микоплазмозов [5]. Однако для оценки перспектив ности этих антибиотиков потребуются длительные клинические испытания в разных регионах мира. Применение антимикробных пептидов (мелитти на, выделенного из яда пчелы, глобомицина, грами цидина С, сурфактина и валиномицина, продуци руемого бактериями, аламетицина, обнаруженного у грибов, цекропинов А и Р1, а также магаинина 2, полученного из тканей животных) для подавления микоплазм [14-20] пока не получило широкого рас пространения. Оказалось, что микоплазмы успешно развивают устойчивость и к этим препаратам [19, 21]. Поскольку данные о механизмах резистентности микоплазм к антимикробным пептидам пока отсут ствуют, изучение адаптации представителей класса Mollicutes к антибактериальным препаратам сосре доточено главным образом на процессах формирова ния устойчивости к тетрациклинам, фторхинолонам и макролидам. Представления о механизмах возникновения устойчивости микроорганизмов к препаратам этих групп основаны в значительной мере на результа тах исследования классических бактерий. Отчасти это связано с особенностями биологии Mollicutes, определяющими сложность их выделения в искус ственных средах и проведение клонального анализа аксеничных культур. Данные же биоинформацион ного анализа [22-24] не всегда согласуются с экспе риментальными результатами. Так, согласно анализу in silico пяти эффлюксных систем, вносящих суще ственный вклад в адаптацию классических бактерий к антибиотикам - MATE (Multidrug and toxic compound extrusion family), MFS (major facilitator superfamily), SMR (small multidrug resistance family), RND (resistance-nodulation-cell division superfamily) и ABC (ATP-binding cassette superfamily) [25, 26], в геномах ряда Mollicutes присутствуют гены MATE, MFS и ABC. Однако экспериментально подтвердить вклад эффлюкса в устойчивость микоплазм к анти микробным препаратам смогли пока только в отно шении систем АВС-транспортеров [24, 27, 28]. Так или иначе, способы развития устойчивости к тетрациклинам, фторхинолонам и макролидам, обнаруженные у классических бактерий, в значи тельной мере характерны и для Mollicutes. Однако у разных видов микоплазм формирование резистент ности к антибактериальным препаратам имеет свои особенности, и даже при совпадении механизмов уровень чувствительности штаммов к препарату мо жет существенно различаться (табл. 1). При этом механизмы, определяющие резистентность к анти бактериальным препаратам, у некоторых видов ми коплазм установить не удается [5]. Это может указы вать на существование у Mollicutes еще неописанных путей развития устойчивости и/или более сложных, чем считалось, механизмов адаптации микроорга низмов к антибактериальным препаратам. Антибиотики тетрациклиновой группы наиболее широко используются для подавления микоплаз менных инфекций урогенитального и респиратор ного трактов у взрослых [30, 31]. Вместе с тем, они часто применяются и при микоплазменных ин фекциях у сельскохозяйственных животных [5]. Бактериостатическая активность тетрациклинов ос нована на способности этих антибиотиков обратимо связываться с 30S субъединицей бактериальной ри босомы, препятствовать взаимодействию аминоацил тРНК с акцепторным участком и предотвращать таким образом синтез белка [32]. Основными меха низмами развития резистентности к тетраци клинам у классических бактерий считают актив ное выведение антибиотика из клетки, продукцию белков, защищающих рибосомы (Tet(M), Tet(O), Tet(S), Tet(W), Tet(32), Tet(36), TetB(P), Otr(A), Tet, Tet(Q) и Tet(T)), подавление проникновения препа рата в клетку, модификацию мишеней, а также де градацию антибиотика при помощи ферментов [33, 34]. Интенсивный рост устойчивости бактерий к те трациклинам связывают с активным обменом генов ключевых факторов, вовлеченных в соответствую щие процессы в бактериальных популяциях [35-38]. Основными посредниками горизонтального переноса генетического материала считают плазмиды и мо бильные генетические элементы. Развитие устойчивости к тетрациклинам у ми коплазм в ряде случаев связано с приобретением детерминант tet(M), локализованных на транспозо не Tn916 [39]. Транспозон кодирует белок TetM, за щищающий рибосомы от действия тетрациклинов. Этот белок гомологичен факторам элонгации eF-Tu, а также eF-G, он может вызывать конформационные изменения в 30S субъединице рибосомы, предотвра щающие связывание с ней тетрациклина. Высокий уровень устойчивости к тетрациклину (МИК ≥ 8 мкг/мл), ассоциированный с присутствием tet(M) детерминант, вызывает перекрестную устойчивость микоплазм к другим антибиотикам тетрациклиновой группы [5, 40]. Кроме того, не исключено, что устой чивость микоплазм к этим препаратам может быть связана с мутациями в тетрациклинсвязывающем блоке 16S рРНК [41, 42]. Штаммы микоплазм, про являющие повышенную устойчивость к тетрацикли нам, получены также in vitro в результате пошаговой селекции на средах с последовательным повышением концентрации антибиотика [5, 42]. Однако механизмы развития антибиотикоустойчивости в этих случаях определить не удалось. Макролидные антибиотики широко применяются при микоплазменных инфекциях у детей (главным образом инфекций дыхательных путей, вызванных Mycoplasma pneumonia, и неонатальных инфекций, ассоциированных с Ureaplasma spp.), а также для по давления микоплазмозов у животных [5, 43-47]. Эти антибиотики часто применяют, когда нельзя исполь зовать тетрациклины и фторхинолоны. Антибактериальная активность макролидов ос нована на способности этих антибиотиков обратимо связываться с 50S субъединицей рибосомы (включая 23S рРНК и некоторые рибосомные белки - L4, L22), индуцировать отделение пептидил-тРНК от рибо сомы и блокировать таким образом синтез пептид ной цепи [48]. Известны три способа развития устойчивости классических бактерий к макроли дам: модификация мишени (в частности, изменения структуры рибосомной 50S субъединицы), изменение выведения препарата и ферментативная инактива ция антибиотика [48, 49]. Развитие устойчивости к макролидам у ми коплазм связывают с подавлением проникновения антибиотика в клетку, а также со структурными изменениями 50S субъединицы рибосом [5]. В ряде случаев резистентность к макролидам у микоплазм связана с изменениями в центральной петле доме на V в 23S рРНК [5, 50]. При этом мутации в соответ ствующей зоне гена приводят к повышению устой чивости некоторых видов микоплазм к нескольким антибиотикам этой группы и снижению или потере устойчивости к другим. Фторхинолоны - самая популярная группа препа ратов, используемых для подавления микоплазмен ных инфекций и контаминаций клеточных культур [4, 5, 28]. Это обусловлено тем, что микоплазменные инфекции часто развиваются при иммунодефицит ных состояниях и, как правило, являются сочетан ными. В таких случаях рекомендуют применять бактерицидные препараты, среди которых широко используется ципрофлоксацин - препарат фторхи нолоновой группы [51-53]. Молекулярные механизмы бактерицидного дей ствия фторхинолонов основаны на связывании ДНК гиразы и/или ДНК-топоизомеразы IV, что приводит к подавлению репликации бактериальной ДНК [49, 54]. Основные механизмы резистентности класси ческих бактерий к фторхинолонам связывают с мо дификациями мишени в результате мутаций в обла сти QRDR (Quinolone Resistance-Determing Region) генов-мишеней - gyrA (субъединица А ДНК-гиразы), gyrB (субъединица В ДНК-гиразы), parC (субъеди ница А топоизомеразы IV), parE (субъединица В то поизомеразы IV), а также со снижением накопления препаратов в клетке (в результате активного оттока или подавления проникновения) и приобретением детерминант устойчивости путем горизонтального переноса генов [55]. Развитие устойчивости микоплазм к фторхино лонам обычно ассоциировано с мутациями в области QRDR генов-мишеней (ДНК-гиразы и топоизомеразы IV). В зависимости от антибиотика значимые мута ции могут находиться в генах определенного фермен та [5]. Например, развитие устойчивости Mycoplasma hominis к перфлоксацину, офлоксацину, ципроф локсацину и тровафлоксацину in vitro связано с му тациями в гене топоизомеразы IV, а к спарфлокса цину - в гене ДНК-гиразы [5, 41, 56]. Устойчивые к фторхинолонам клинические изоляты микоплазм обычно проявляют перекрестную устойчивость ко всем препаратам этой группы. При этом уровень устойчивости часто коррелирует с количеством му таций и их локализацией [5, 57]. Вместе с тем, в се рии длительных наблюдений адаптации микоплазм к фторхинолонам было показано, что вытеснение из культуры клеток, не мутантных по QRDR-локусу, происходит только при культивировании бактерий на средах с высокими концентрациями ципрофлок сацина [58]. При низких концентрациях ципроф локсацина ключевую роль, по-видимому, играют другие механизмы, например, выведение из клетки. Этот способ адаптации к фторхинолонам, описанный у ряда бактерий, осуществляется с помощью эндо генных насосов типа АВС, ассоциированных с мно жественной лекарственной устойчивостью (MDR). Увеличение экспрессии соответствующих генов мо жет определять MDR-фенотип. В геномах некоторых микоплазм обнаружены гены АВС-типа, аннотиро ванные как «предположительно гены MDR» [22-24]. Согласно данным количественной конкурентной ОТ- ПЦР, в исходных штаммах эти гены экспрессируют ся конститутивно, а в штаммах с MDR-фенотипом уровень их экспрессии повышен [18]. Однако объяс нить этим быструю адаптацию разных микоплазм к фторхинолонам все-таки не удается. Попытки выяснить причины роста устойчиво сти микроорганизмов к фторхинолонам, регистри руемого в последнее время во всех регионах мира [56, 59, 60], привели к предположению, что, помимо перечисленных механизмов, существуют и другие способы, определяющие возможность быстрой адап тации бактерий к антибактериальным препаратам в микробных сообществах [55]. Это предположение основано как на результатах экспериментальных ис следований, так и на данных мониторинга в разных странах - очень быстрое повышение устойчивости к фторхинолонам наблюдается у сельскохозяйствен ных животных, хотя в ветеринарную практику эти препараты были введены лишь два десятилетия на зад [5, 61-63]. Поскольку представителей класса Mollicutes счи тают тахителичными организмами, предполагается, что их быстрая адаптация к антимикробным препа ратам обусловлена частыми мутационными события ми, существенными из которых являются изменения в генах целевых белков [19, 64, 65]. Однако согласно результатам анализа полных нуклеотидных последо вательностей генов gyrA, gyrB, parC и parE штаммов Ureaplasma parvum и U. urealyticum значительная часть нуклеотидных замен в этих генах микоплазм представляет собой видовой полиморфизм и никак не влияет на чувствительность к антибиотику [66]. Это заключение ставит под сомнение правильность представлений о мутационных механизмах рези стентности микоплазм (и других бактерий) к анти биотикам, и диктует необходимость проверки этих данных с использованием новых подходов. Между тем, за последнее время опубликованы данные об ак тивной роли внеклеточных везикул в адаптации бак терий к стрессовым условиям, в том числе антибио тикам [3, 67-72]. Продуцируемые клетками везикулы содержат различные соединения и участвуют в меж клеточных взаимодействиях про- и эукариот [69, 73- 75]. Еще в 1996 году установили, что везикулы грамотрицательных бактерий участвуют в транспорте антибиотиков и контроле антибиотикоустойчивости в бактериальной популяции [76]. Однако участие ве зикул в ответе бактерий на антимикробные препара ты начали активно изучать только недавно в связи с «универсальностью» везикулярного транспорта, обнаруженного у всех организмов, включая мельчай ших прокариот, и появлением методов высокого раз решения для их анализа [3, 6-9, 69-71, 73, 74, 76-80]. Активное участие внеклеточных везикул в раз витии устойчивости бактерий к фторхинолонам впервые показали на примере Acholeplasma laidlawii - микоплазмы, инфицирующей человека, животных, растения, основного контаминанта кле точных культур [71, 81]. В результате пошаговой селекции получены штаммы A. laidlawii, различа ющиеся чувствительностью к ципрофлоксацину. Оказалось, что везикулы, продуцируемые клетка ми микоплазмы, растущей на среде с ципрофлок сацином, опосредуют выведение этого препара та из клетки, оказывают бактериостатическое действие в отношении чувствительного к антибио тику штамма Staphylococcus aureus и переносят мутантные гены белков - мишеней фторхиноло нов. Дифференциальная экспрессия генов ABC транспортеров, участвующих у ряда бактерий в ак тивном выведении антибиотиков и формировании множественной лекарственной устойчивости, реги стрируемая в ответ на действие ципрофлоксацина, указывает на то, что быстрое выведение ципрофлок сацина из клеток микоплазмы (в том числе посред ством везикул) может быть связано и с модуляцией системы ABC-транспортеров. Обнаружение в составе везикул генетического материала также позволяет предполагать их уча стие в горизонтальном переносе генов [8, 81-83]. Транспорт генов-мишеней фторхинолонов, опосре дуемый везикулами A. laidlawii, может способство вать быстрому распространению мутантных генов в бактериальной популяции [71, 81]. Возможность таких событий показана на примере Acinetobacter baumannii - внеклеточные везикулы этой бактерии обеспечивают перенос гена OXA-24, определяющего устойчивость к карбапенемам [84]. При этом перенос факторов устойчивости к антибиотикам, опосредо ванный везикулами определенной бактерии, может способствовать выживанию различных бактерий в микробном сообществе. Пример такой взаимопо мощи показан на модели S. aureus, когда опосредо ванное везикулами распространение β-лактамазы этой бактерии в популяциях микроорганизмов обе спечило выживание на среде с ампициллином грамотрицательных и грамположительных бактерий, чувствительных к этому антибиотику [78]. К настоя щему времени получены убедительные доказатель ства участия внеклеточных везикул в адаптации бак терий к разнообразным стрессовым условиям, в том числе к антимикробным препаратам. Однако очевид но, что выяснение места везикулярной компоненты в развитии устойчивости бактерий к антибиотикам требует комплексных систематических исследова ний с использованием методов высокого разрешения. Развитие постгеномных технологий открыло прин ципиально новые возможности определения резисто мов - совокупности генов и их продуктов, которые принимают участие в формировании резистентности к антимикробным препаратам. Уже получены сведе ния о резистомах некоторых бактерий в отношении ряда препаратов [85-104]. Недавно такие сведения получены и для представителя класса Mollicutes - A. laidlawii [105]. Они основаны на анализе полных геномов A. laidlawii, а также клеточных и везику лярных протеомов штаммов, различающихся по чув ствительности к ципрофлоксацину - лабораторного штамма PG8 (МИК 0.5 мкг/мл) и полученного от него методом пошаговой селекции устойчивого к ципроф локсацину штамма PG8R10 (МИК 20 мкг/мл). В результате сравнительного анализа нуклео тидных последовательностей A. laidlawii PG8 и A. laidlawii PG8R10 в геноме устойчивого к ципрофлок сацину штамма обнаружены множественные му тации (инсерции, делеции, однонуклеотидные за мены (SNP)), локализованные как в генах мишеней фторхинолонов (ДНК-гираза и ДНК-топоизомераза), так и во многих других генах, продукты которых уча ствуют в различных клеточных процессах и бакте риальной патогенности. Всего в геноме A. laidlawii PG8R10 обнаружено 225 мутаций в 188 генах (рис. 1). Некоторые из этих мутаций были идентифицирова ны ранее у других микроорганизмов в связи с раз витием устойчивости к тем или иным антибиотикам (например, у S. aureus к даптомицину, у A. baumannii при множественной лекарственной устойчиво сти - к ципрофлоксацину, имипенему, амикацину, миноциклину, левофлоксацину, пиперациллину, та зобактаму, цефтазидиму, цефотаксиму, цефепиму, цефоперазону, сульфбактаму и меропенему [95, 102]). В результате протеомного анализа клеток A. laidlawii PG8 и PG8R10 идентифицированы белки, относительное содержание которых в этих штаммах существенно различалось. Всего выявлено 64 таких белка, из них только четыре оказались продуктами мутантных генов (ACL_0380, ACL_0418, ACL_0435, ACL_0436). Многие из этих белков участвуют в фун даментальных клеточных процессах (энергообра зование, трансляция, транскрипция, репликация, биогенез мембран, фолдинг белков, транспорт и ме таболизм аминокислот, нуклеотидов, углеводов, ли пидов, неорганических ионов, трансдукции сигналов, защитные механизмы) и бактериальной патогенно сти; некоторые вовлечены в развитие резистентно сти к антибиотикам у других бактерий (например, у A. baumannii к карбапенему, S. aureus - к оксацил лину [106, 107]). У штаммов, различающихся чувствительностью к ципрофлоксацину, обнаружены существенные от личия в протеомном профиле внеклеточных везикул (табл. 2). Так, в везикулах A. laidlawii PG8 иденти фицированы 97 белков, а в везикулах A. laidlawii PG8R10 - 17, из которых 13 отсутствуют в везику лах исходного штамма [105]. При этом в везикулах A. laidlawii PG8 найден белок семейства металло-β лактамаз, обеспечивающий гидролиз антибиотиков β-лактамного ряда. Поскольку действие антибио тиков β-лактамного ряда направлено на клеточную стенку бактерий, которая отсутствует у представи телей класса Mollicutes, назначение этого фермен та у A. laidlawii PG8 остается загадкой. Не исклю чено, что таким образом A. laidlawii PG8, подобно S. aureus [78], может оказывать помощь в адаптации к антибиотикам β-лактамного ряда другим бактери ям, обладающим клеточной стенкой, и необходимым для выживания этой микоплазмы в микробиоценозе [6]. Вклад каждого реагирующего на стресс белка и гена микоплазмы в развитие резистентности к ци профлоксацину еще предстоит выяснить. Вместе с тем, очевидно, что множественные изменения в геномных профилях, а также в клеточных и вези кулярных протеомах у устойчивого к ципрофлок сацину штамма A. laidlawii могут определять суще ственную перестройку биохимических процессов в клетке микоплазмы (рис. 2). Такие данные получе ны для Pseudomonas aeruginosa в связи с развитием устойчивости к тем или иным антибиотикам, в том числе ципрофлоксацину [87, 96, 109]. Формирование устойчивости у разных видов бактерий к антими кробным препаратам оказалось ассоциированным с изменениями не только мишеней этих препаратов, но также многих генов и белков, вовлеченных в про цессы энергообеспечения, транспорта и защитные механизмы, а также в реализацию вирулентности. Эти результаты требуют особого внимания исследо вателей, занимающихся разработкой средств кон троля патогенных бактерий, поиском новых мишеней антимикробных препаратов, кандидатами на роль которых являются как раз факторы вирулентности. Изучение адаптации микроорганизмов к анти микробным препаратам с использованием омиксных технологий только начинается. Однако полученные результаты позволяют заключить, что формирова ние устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам, по-видимому, обеспечивается более сложными механизмами, чем предполагалось ранее. Развитие резистентности оказалось связанным со значительными изменениями в их геномном, транс криптомном, протеомном и секретомном профилях микроорганизмов, которые могут определять суще ственную перестройку клеточных процессов и па тогенности. Элементы резистомов, общие для раз ных бактерий, могут указывать на существование универсальных модулей регуляции клеточного ре программирования, обеспечивающего выживание в условиях стресса. Идентификация и выяснение закономерности их работы представляют значи тельный интерес для понимания «логики жизни» микоплазм, быстрой адаптации бактерий к стрессу в микробиоценозах и поиска путей решения про блемы контроля микоплазменных инфекций и кон таминаций клеточных культур. Для получения соответствующей информации потребуются круп номасштабные исследования микроорганизмов как в аксеничных культурах, так и в ассоциатах в разных условиях среды, основанные на высокотех нологичных методических платформах с применени ем метаомиксных подходов.

Об авторах

O. A. Чернова

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: chernov@mail.knc.ru
Россия

E. С. Медведева

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: chernov@mail.knc.ru
Россия

A. A. Музыкантов

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: chernov@mail.knc.ru
Россия

Н. Б. Баранова

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: chernov@mail.knc.ru
Россия

В. M. Чернов

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: chernov@mail.knc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы