Влияние различных эффекторов на бактериолитическую активность интерлейкина-2 человека и лизоцима куриного яйца

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Интерлейкин-2 - цитокин, играющий важную роль в регуляции иммунной системы, используется как лекарственное средство при различных онколо гических заболеваниях [1, 2]. Сравнительно недавно было обнаружено, что интерлейкин-2 обладает бак териолитической активностью [3-6], физиологиче ская роль которой еще не установлена. Показано, что субстратная специфичность интерлейкина-2 от личается от специфичности лизоцима куриного яйца [3-6]. Однако известны микроорганизмы, на которые действуют и интерлейкин-2, и лизоцим. С целью бо лее точного выявления потенциальных эффекторов мы сравнили влияние на активность интерлейки на-2 и лизоцима различных веществ - аминокис лот, биогенных аминов, пептидных антибиотиков, EDTA и милдроната. Эти вещества или их аналоги могут присутствовать в биологических системах. В качестве субстрата мы взяли клетки Escherichia coli, которые лизируются как интерлейкином-2, так и лизоцимом [3-5]. Изучение характера влияния различных добавок может в дальнейшем помочь по нять механизм бактериолитического действия ин терлейкина-2. Понимание особенностей влияния различных веществ на активность интерлейкина-2 и лизоцима может дать ключ к повышению эффек тивности медицинских препаратов и позволит раз работать новые лекарственные средства. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использовали: глицин (Fluka, Германия); EDTA (Panreac, Испания); L-лизин (Serva, Германия); тирамин, триптамин, таурин (Acros Organics, США), Трис, MES (Amresco, США); баци трацин (MP Biomedicals, Германия); полимиксин B, L-триптофан, L-тирозин, L-фенилаланин, лизоцим куриного яйца (Sigma Aldrich, США); NaOH (Merck, Германия); уксусную кислоту («Химмед», Россия); соляную кислоту («Лаверна», Россия); милдронат (2-(2-карбоксилатоэтил)-1,1,1-триметилгидразиний) (Cridex, Латвия); L-глутамат натрия (HongMei, КНР); ронколейкин (раствор очищенного интерлейкина-2 для внутривенного и подкожного введения (0.25 мг/мл; «Биотех», Россия)). Штамм Е. coli M109 предоставлен J. Messing (Waksman Institute, New Jersey, США). Клетки выращивали согласно стандартной методике [7]. Суспензию клеток с концентрацией 109 КОЕ/мл в растворе 0.15 M NaCl замораживали порциями по 1 мл в жидком азоте. Препарат клеток хранили при температуре -70°C не более 2-3 недель. Клетки размораживали непосредственно перед эксперимен том. Размороженную суспензию клеток центрифу гировали при 4500 об/мин в течение 5 мин на цен трифуге Minispin (Eppendorf, Германия), затем ресуспендировали в буферном растворе для измере ния активности. Бактериолитическую активность (скорость ли зиса клеток) измеряли турбидиметрическим ме тодом по уменьшению поглощения суспензии (-dA/dt, мин-1) [5, 8] на длине волны 650 нм, в дан ных условиях прямо пропорциональному скорости изменения числа клеток - dKOE/dt. Измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 0.5 мл. Поглощение растворов измеряли с использованием двухлучевого спектрофотометра UV-1800 (Shimadzu, Япония). Раствор лизоцима в буфере для измерения активности готовили непо средственно перед экспериментом. Готовый раствор интерлейкина-2 использовали без дополнитель ной обработки, ампулу вскрывали непосредствен но перед экспериментом. Измерения проводили при температуре 37°С в буферном растворе 10 мМ MES-Tрис-ацетат pH 8.8 для интерлейкина-2 и pH 8.5 для лизоцима. Для удобства сравнения скоростей лизиса клеток во всех экспериментах использовали интерлейкин-2 в конечной концентрации 15 мкг/мл, лизоцим - 0.1 мкг/мл. В спектрофотометрической кювете сначала смешивали буферный раствор и ис ходную суспензию клеток. При определении скоро сти лизиса клеток в присутствии фермента подбира ли такое количество добавляемой суспензии, чтобы поглощение (A650) в кювете в начальный момент вре мени было равно 0.43-0.45. В течение 5 мин измеря ли изменение фонового поглощения, которое может быть связано с самопроизвольным лизисом клеток без фермента или с их оседанием. Затем в кювету до бавляли растворы эффекторов, в течение 5 мин из меряли изменение фонового поглощения, после чего добавляли раствор фермента. В качестве начальной скорости лизиса клеток определяли изменение по глощения в интервале 5-25 с с момента добавления фермента. Значение величины фонового самопроиз вольного лизиса (или осаждения) клеток в отсутствие фермента вычитали из значения скорости лизиса в присутствии фермента. Во всех экспериментах фо новое изменение поглощения не превышало средней величины погрешности измерения скорости лизиса в присутствии фермента. В условиях данной работы все добавки, кроме ферментов, не изменяли величи ну фонового лизиса в пределах погрешности экспе римента. Значение pH растворов всех добавляемых веществ доводили при необходимости до 8.8 (8.5) с по мощью растворов NaOH или HCl. Эффекты добавок не сводились к влиянию на активность за счет изме нения ионной силы при увеличении концентрации эффектора. Не выявлено значимых изменений бак териолитической активности при изменении ионной силы в использованных нами диапазонах [3, 8]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На рис. 1 представлены зависимости активности лизоцима и интерлейкина-2 от концентрации гли цина, лизина, аргинина и глутамата. Из рис. 1А,Б видно, что активность интерлейкина-2 не изменя ется в присутствии глицина, самой простой при родной аминокислоты, и положительно заряженно го лизина, тогда как активность лизоцима зависит от концентрации как глицина, так и лизина. В при сутствии 2 мМ глицина или 15-18 мМ лизина ак тивность лизоцима достигает максимума, при даль нейшем повышении концентрации активность лизоцима снижается и возвращается к исходным значениям. Таким образом, в присутствии этих двух аминокислот лизоцим и интерлейкин-2 ведут себя по-разному, что может указывать на различия в механизме их действия. Эффект повышения ак тивности лизоцима при добавлении глицина ранее не был описан. Однако известно, что глицин может повышать эффективность различных антимикроб ных агентов, а также обладает бактериостатиче ским действием [9]. Различия во влиянии глицина на лизоцим и интерлейкин-2 сложно объяснить. Например, можно предположить, что глицин дей ствует на один из бактериальных поринов, облег чая взаимодействие лизоцима с клеточной стенкой, в то время как в случае интерлейкина-2 данный ме ханизм, по-видимому, не реализуется. На рис. 1В представлены кривые, показывающие как аргинин влияет на бактериолитическое действие лизоцима и интерлейкина-2. Видно, что при кон центрации эффектора 10 мМ и выше скорость ли зиса клеток обоими белками существенно воз растает. Действие аргинина может определяться сложной совокупностью воздействий как на фер мент, так и на клетки. Известно, что аргинин повы шает эффективность фармацевтических препаратов на основе лизоцима, препятствуя его агрегации [10]. Следует также отметить принципиальные различия в характере влияния аргинина и лизина на бактериолитическую активность лизоцима и интерлейкина-2. Вероятно, различий в полярности и геометрии по ложительно заряженных радикалов этих двух ами нокислот достаточно для того, чтобы лизин влиял на лизис клеток лизоцимом и не влиял на лизис кле ток интерлейкином-2. Активность и лизоцима, и интерлейкина-2 изме няется сходным образом в присутствии 15 мМ глу тамата, увеличиваясь в 2 и 3 раза соответственно (рис. 1Г). При дальнейшем повышении концентра ции глутамата активность меняется незначительно. Сходное действие глутамата на активность лизоцима и интерлейкина-2 можно, по-видимому, объяснить тем, что глутамат образует комплекс с положитель но заряженными группами на поверхности белков, предотвращая непродуктивную сорбцию ферментов на клетках, что может существенно изменять эффек тивные значения параметров бактериолитической активности [11, 12]. На рис. 2 представлены зависимости активности лизоцима и интерлейкина-2 от концентрации аро матических аминокислот. Тирозин, учитывая его низкую растворимость в воде, использовали толь ко в концентрации менее 0.6 мМ. Видно, что в при сутствии фенилаланина и триптофана активность лизоцима немного снижается (незначительно пре восходит погрешность измерения). В присутствии тирозина активность лизоцима повышается также практически на уровне средней погрешности изме рений. Активность интерлейкина-2 в присутствии фенилаланина и триптофана не изменяется. На кри вой зависимости активности интерлейкина-2 от концентрации тирозина наблюдается слабо выраженный максимум (увеличение активности на треть от исход ной) при концентрации добавки 0.25-0.3 мМ. В целом, можно утверждать, что ароматические аминокислоты незначительно влияют на активность как лизоцима, так и интерлейкина-2. Иная картина, как будет пока зано далее, прослеживается в действии производных ароматических аминокислот, а именно биогенных ароматических аминов - триптамина и тирамина. На рис. 3 представлены зависимости активно сти интерлейкина-2 и лизоцима от концентрации биогенных аминов тирамина и триптамина, кото рые формально являются производными тирозина и триптофана. Видно, что интерлейкин-2 активиру ется, а лизоцим ингибируется обоими биогенными аминами. Однако эффект влияния тирамина на ли зоцим слабо выражен. Эти результаты также могут свидетельствовать в пользу принципиальных раз личий в механизмах действия интерлейкина-2 и ли зоцима. Для интерлейкина-2 характерно связыва ние с различными лигандами за счет гидрофобных взаимодействий [13], поэтому возможно, что тирамин и триптамин связываются с какими-то гидрофобны ми областями на поверхности интерлейкина-2, пре пятствуя его непродуктивной сорбции на клетках. На рис. 4 приведены кривые зависимости актив ности интерлейкина-2 и лизоцима от концентрации пептидных антибиотиков полимиксина B и баци трацина. Видно, что антибиотики сходным образом действуют на активность обоих бактериолитических факторов с максимумом в области 5-7 мкМ. Впрочем, эти пептидные антибиотики обладают цитотоксическим действием на клетки E. coli [14, 15], поэтому схожесть эффекта может быть связана с неким воз действием на клетки, а не с влиянием на свойства бактериолитических факторов. Сам антибиотик не вызывает лизис бактерий, но каким-то образом делает их более уязвимыми к действию бактериоли тических ферментов, что наблюдали ранее в случае эндолизина из бактериофага SPZ7 [16]. На рис. 5 представлены зависимости активности интерлейкина-2 и лизоцима от концентрации мил дроната, таурина и EDТА. Милдронат не изменяет активность лизоцима, но зависимым от концентрации образом увеличивает активность интерлейки на-2 с максимумом при 3 мМ. Физиологическое дей ствие милдроната обычно объясняют структурным сходством с природными биологически активными соединениями, в том числе с γ-бутиробетаином, его предшественником, из которого синтезируется кар нитин [17, 18]. Наблюдаемая зависимость активно сти интерлейкина-2 от концентрации милдроната свидетельствует о прямом образовании комплекса фермента с эффектором. Таурин не влияет на актив ность ни интерлейкина-2, ни лизоцима. EDТА в кон центрации 0.1 мМ и выше усиливает действие обоих бактериолитических факторов, что, как и в случае с пептидными антибиотиками, можно частично объ яснить действием на клетки. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Как видим, влияние добавок на интерлейкин-2 и ли зоцим зависит от химической природы добавки, что, по-видимому, может указывать принципиально раз ные механизмы действия. Нами выявлены вещества, которые активируют изучаемые бактериолитические факторы, что может иметь практическую значи мость. Эффекторы могут использоваться для повы шения эффективности уже существующих меди цинских препаратов, а также для создания новых лекарственных композиций. Например, впервые по казано, что глицин, лизин и глутамат непосредствен но усиливают бактериолитическую активность лизо цима. И глицин, и лизин, и лизоцим являются широко распространенными лекарственными средствами, но их совместное действие не изучено. Влияние глу тамата и аргинина на активность лизоцима также ранее не изучали. Интерлейкин-2 в настоящее время используют в качестве регулятора иммунной систе мы, но не бактериолитического фактора, так как его бактериолитические свойства ранее не были извест ны. Однако не исключено, что антимикробные свой ства также сыграли свою роль в ряде случаев, когда эффективность интерлейкина-2 была подтверждена. Интерлейкин-2 применяют как при сепсисе, где роль бактерий очевидна, так и в терапии опухолей, где роль бактерий менее очевидна, однако могут иметь место сочетанные с основным заболеванием бакте риальные поражения тканей. Механизм бактерио литического действия интерлейкина-2 пока не уста новлен, механизм воздействия эффекторов на его активность также требует дальнейшего изучения. Однако становится понятно, что следует обратить пристальное внимание на активацию интерлейки на-2 в присутствии добавок, например, мельдония, аргинина и глутамата. Сочетанное использование данных препаратов может открыть новые горизонты в лечении тяжелых заболеваний.

Об авторах

П. A. Левашов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: levashov@yahoo.com
Россия

Д. A. Матолыгина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

E. Д. Овчинникова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

Д. Л. Атрошенко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

С. С. Савин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

Н. Г. Белогурова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

С. A. Смирнов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

В. И. Тишков

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: vitishkov@gmail.com
Россия

A. В. Левашов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: levashov@yahoo.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы