Моделирование структуры и скрининг ингибиторов тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Для снятия локальных напряжений ДНК-спирали в процессе репликации и транскрипции необходимо внесение одноцепочечных разрывов, которые осу ществляются топоизомеразой I (Top1) [1, 2]. Однако в результате различных повреждений ДНК (раз рывы цепи, повреждения азотистых оснований), а также под действием ингибиторов Top1 могут на капливаться ковалентные комплексы Top1-ДНК, в которых каталитический тирозин связан с 3’-кон цевым фосфатом [3, 4]. Восстановление исходной структуры ДНК и обеспечение репликации проис ходят в результате гидролиза таких комплексов тирозил-ДНК-фосфодиэстеразой 1 (Tdp1) - важным ферментом репарации ДНК, обнаруженным у чело века и других эукариотических организмов [5-8]. Субстратом Tdp1 служит предварительно под вергшийся протеолизу комплекс Top1-ДНК, в кото ром Top1 представлена коротким пептидным фраг ментом [9]. Tdp1 обладает широкой субстратной специфичностью, поскольку Top1 вносит разрывы на различных участках цепи ДНК (хотя предпочте ние отдается 3’-фосфодиэфирной связи тимидина) [10]. Активный центр Tdp1 располагается в цен тральной части субстратсвязывающей бороздки. Узкий участок бороздки с одной стороны от актив ного центра положительно заряжен и участвует в связывании цепи ДНК. Более широкий участок бо роздки с другой стороны связывает пептидный фраг мент субстрата. В активном центре Tdp1 положение 3’-фосфатной группы субстрата стабилизируется водородными связями с остатками Lys265 и Lys495. Предполагается, что карбоксамидные группы Asn283 и Asn516 также вовлечены в связывание фосфата [11, 12]. Расщепление фосфодиэфирной связи между 3’-фосфатом и остатком тирозина осуществляется с участием боковых цепей His263 и His493 по меха низму SN2 (рис. 1) [13, 14]. В результате нуклеофиль ной атаки His263 образуется переходное состояние с фосфатом в конформации тригональной бипирами ды (в апикальных вершинах располагаются Nε2-атом His263 и тирозильный кислород). Остаток His493 выступает в роли донора протона для остатка тиро зина в составе уходящей группы. Протонирование Nδ1-атомов His263 и His493 стабилизируется водород ными связями с боковыми цепями Glu538 и Gln294 соответственно. При этом непротонированное со стояние Nε2-атома His263 может быть обусловлено близким расположением заряженных аминогрупп Lys265 и Lys495, а заряженное состояние His493 - близостью боковой цепи Asp288. Камптотецин и его производные (иринотекан, то потекан) вызывают образование необратимых ко валентных комплексов Top1-ДНК и используют ся для повреждения ДНК опухолевых клеток [3]. Подавление репарации таких комплексов с помощью ингибиторов Tdp1 является перспективным путем усиления противоопухолевой активности кампто тецинов, что подтверждается чувствительностью TDP1-дефицитных клеток к химиотерапии [15-17]. Хотя известно несколько соединений, подавляю щих активность фермента, разработка лекарствен ных средств на основе ингибиторов Tdp1 пока дале ка от доклинической или клинической стадии. Так, ванадат-ион VO4 3-, образующий координационную связь с His263 и имитирующий переходное состоя ние реакции, был использован при изучении меха низма действия фермента и получении кристаллов комплексов Tdp1 с различными олигонуклеотида ми и пептидными фрагментами [10, 13]. Вещества, ингибирующие Tdp1, обнаружены путем in vitro скрининга библиотек низкомолекулярных соедине ний среди стероидных производных [18], инденоизо хинолинов [19, 20], миметиков фосфотирозина [21], тиоксотиазолидинонов [22], бензопентатиепинов [23] и диазаадамантанов [24]. Перечисленные соединения предположительно конкурируют за участок связы вания субстрата, однако структуры фермент-инги биторных комплексов неизвестны и не вполне по нятна природа специфических взаимодействий этих веществ с остатками активного центра. Исследование взаимодействия некоторых ингибиторов с Tdp1 с использованием молекулярного докинга привело к противоречивым результатам, которые плохо со гласуются с экспериментальными данными по инги бирующей активности соединений [25, 26]. Это дает основание предположить, что модели белка, постро енные на основе кристаллических структур, нужда ются в уточнении и дополнительной оптимизации. В нескольких работах при оценке состояния иони зации боковых цепей гистидина [22] и лизина [18, 27] в активном центре не учитывали их молекулярное окружение и механизм реакции, что также ставит под вопрос достоверность моделирования. Очевидно, что для изучения участков связывания потенци альных ингибиторов и адекватного описания взаи модействий необходима качественная модель Tdp1 человека, которая учитывала бы все особенности структурной организации активного центра. Целью настоящей работы было построение молекулярной модели Tdp1 с использованием гибридных методов квантовой и молекулярной механики и ее апробиро вание для компьютерного скрининга конкурентных ингибиторов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Создание модели белка Молекулярную модель Tdp1 человека конструиро вали на основе кристаллической структуры 1nop (цепи А, C, D) [14]. Координаты неразрешенных пе тель в белке восстанавливали с помощью програм мы Swiss-PDBViewer 4.1 (осуществляет наложение структур) [28] и веб-сервера ModLoop (предсказы вает положение недостающих тяжелых атомов) [29]. Координаты петли 425-434 перенесли из структуры 1qzq после ее наложения на 1nop, а координаты пет ли 560-567, которая отсутствует во всех структурах Tdp1, были предсказаны по аминокислотной после довательности. Далее с использованием AmberTools 1.2 (http://ambermd.org) и пакета Amber 12 [30, 31], установленного на суперкомпьютере МГУ [32], мо делировали фермент-субстратный комплекс Tdp1. Молекулу субстрата конструировали на основе структурного аналога из 1nop (ковалентный ком плекс олигонуклеотид-ванадат-пептид), для чего атом ванадия заменили на фосфор. Для молекуляр но-механического описания фосфотирозинового участка в молекуле субстрата использовали пара метры из базы данных AMBER parameter database [33]. Остальные части субстрата и белок описывали с использованием силового поля ff99SB [34]. В струк туру фермент-субстратного комплекса добавля ли атомы водорода и помещали в ячейку воды (мо дель растворителя TIP3P, минимальное расстояние от белка до края ячейки - 12 Å). Для нейтрализации положительного суммарного заряда, обусловленного ионогенными группами белка и субстрата, в ячейку добавляли ионы хлора. Минимизацию энергии полу ченной системы проводили в две стадии. На первой стадии (2500 шагов по методу наискорейшего спу ска, затем 2500 шагов по методу сопряженных гра диентов) координаты белка и субстрата фиксирова ли позиционными ограничениями 2 ккал/(моль∙Å2) на тяжелых атомах. На второй стадии (5000 шагов наискорейшего спуска, 5000 шагов по методу сопря женных градиентов) систему разделяли на квантово-механический (КМ) и молекулярно-механический (ММ) регионы. КМ-регион, включающий фрагмент субстрата и боковые цепи His263 и His493 (см. рис. 1), описывали полуэмпирическим гамильтонианом RM1 [35, 36] c использованием линкерных атомов на гра нице региона. Расчеты проводили с использованием периодических граничных условий и метода PME (Particle Mesh Ewald) для учета дальнодействующих электростатических взаимодействий. Поиск связывающих карманов в полученной структуре Tdp1 осуществляли с помощью программ fpocket 2.0 и pocketZebra [37, 38], полости определяли в виде кластеров альфа-сфер (сферы, контактирую щие с четырьмя атомами и при этом не содержащие внутренних атомов). Для детектирования полостей небольшого размера минимальное число альфа-сфер в полости уменьшали с 35 до 30, а максимальное рас стояние между альфа-сферами на этапе кластери зации уменьшали с 2.5 до 2.4 Å. При поиске полостей не принимали в рассмотрение атомы водорода. Компьютерный скрининг Компьютерный скрининг ингибиторов Tdp1 проводили среди низкомолекулярных соеди нений из коммерческой библиотеки Vitas-M (http://www.vitasmlab.com). Протонирование и оптимизацию структуры соединений проводи ли согласно ранее описанной методике [39]. С ис пользованием программы ACD/Spectrus DB 14.0 (http://www.acdlabs.com) из библиотеки отобрали соединения, содержащие сульфогруппу и удовлет воряющие правилу трех (молекулярная масса < 300, log P ≤ 3, доноры водородной связи ≤ 3, акцеп торы водородной связи ≤ 3, вращаемые связи ≤ 3) [40, 41]. Из модели фермент-субстратного комплек са Tdp1 удаляли субстрат и молекулы воды, с по мощью программы Lead Finder 1.1.15 [42, 43] стро или потенциальную решетку (карту потенциала взаимодействия), охватывающую область актив ного центра. После этого проводили молекулярный докинг соединений в активный центр Tdp1 с ис пользованием генетического алгоритма в режиме extra precision. Полученные структуры комплек сов с ингибиторами оптимизировали по методике, примененной к фермент-субстратному комплексу Tdp1. При этом КМ-регион включал молекулу ин гибитора и боковые цепи His263 и His493, молеку лярно-механические параметры ингибиторов бра ли из силового поля GAFF [44]. Найденные позиции визуализировали с помощью программы VMD 1.9.2 [45]. Измерение ферментативной активности Рекомбинантный белок Tdp1 человека экспрессиро вали в системе Escherichia coli и выделяли соглас но [46]. Плазмида pET 16B Tdp1 была предоставле на д-ром К.У. Кальдекотт (Университет Сассекса, Великобритания). Фермент очищали хроматогра фией на никелевом сорбенте NTA-Ni2+-сефароза CL-6B с последующей доочисткой на фосфоцеллю лозе P-11. Ферментативную активность измеряли с использованием сконструированного ранее био сенсора 5’-(5,6 FAM-aac gtc agg gtc ttc c-BHQ1)-3’, где FAM - флуорофор, BHQ1 - тушитель флуорес ценции [23, 47]. Определение активности Tdp1 по от щеплению 3’-концевого заместителя BHQ1 прово дили в следующих условиях: 50 мM Tрис-HCl, pH 8.0, 50 мM NaCl, 7 мM β-меркаптоэтанол, 50 нM био сенсор, 1.3 нM Tdp1, 26°C. Скорость реакции при раз личных концентрациях ингибиторов STK370528 (Sigma-Aldrich) и STK376552 (Vitas-M Laboratory, Ltd.) измеряли на флуориметре POLARstar OPTIMA (BMG LABTECH, Германия). Измерения проводили в двух независимых экспериментах. Значения IC50 (концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижается на 50% [48]) определяли с по мощью программы MARS Data Analysis 2.0 (BMG LABTECH). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Модель белка При построении молекулярной модели Tdp1 чело века для поиска конкурентных ингибиторов необхо димо было выбрать подходящую кристаллическую структуру фермента, учесть ионизационные свой ства важных для катализа аминокислотных остат ков, а также воспроизвести оптимальную для вза имодействия с субстратом конформацию этих остатков. В базе данных Protein Data Bank представ лены структуры апоформы Tdp1 (PDB ID 1jy1, 1qzq), а также комплексов с различными аналогами пере ходного состояния (1mu7, 1mu9, 1nop, 1rff, 1rfi, 1rg1, 1rg2, 1rh0, 1rgt, 1rgu). В качестве исходной структу ры для моделирования был выбран комплекс с ана логом, наиболее близким по строению к природному субстрату, 1nop, в котором ванадат ковалентно свя зан с каталитическим остатком His263. В результате замены атома ванадия на фосфор получили стар товую структуру субстрата, представляющего оли гонуклеотид 5’-GTT-3’, присоединенный к пептиду KLNYL через боковую цепь тирозина. Важным этапом моделирования было восстанов ление неразрешенных петель 425-434 и 560-567, поскольку для дальнейшей оптимизации структуры необходима белковая цепь без разрывов. К струк туре Tdp1 с достроенными петлями добавили ато мы водорода, при этом в боковой цепи His263 водо род был присоединен к Nδ1-атому, а боковые цепи His493, Lys265 и Lys495 были заряжены. Координаты субстрата и добавленных атомов водорода оптими зировали с помощью двухстадийной минимизации энергии. На первой стадии провели молекулярно механическую минимизацию с целью удаления наи больших напряжений в системе. На второй стадии для более точного описания взаимодействия субстра та с каталитическими остатками His263 и His493 ис пользовали полуэмпирический гамильтониан RM1, эффективность которого была показана при симуля ции биологических молекул [49, 50]. В табл. 1 при ведены наиболее важные межатомные расстояния в активном центре стартовой и оптимизированной модели Tdp1. Исходное положение атомов фосфа та в стартовой модели соответствует координатам ванадата в его комплексе с ферментом, являющем ся аналогом переходного состояния. В результате оптимизации структуры фосфат приобретает те траэдрическую конфигурацию, а расстояние меж ду фосфором и His263 увеличивается с 2.0 до 2.7 Å, что означает переход активного центра в основное состояние. Водородные связи фосфатной группы с другими остатками не претерпевают существенных изменений. Это свидетельствует о том, что как в ос новном, так и в переходном состоянии в связывании субстрата участвуют боковые цепи Asn283 и Asn516, которые вместе с заряженными аминогруппами Lys265 и Lys495 образуют сеть водородных связей с 3’-фосфатной группой. После удаления субстрата из оптимизированной структуры получили модель Tdp1 для докинга низкомолекулярных соединений, в которой ориентация остатков активного центра спо собна обеспечить множественные взаимодействия с конкурентными ингибиторами. Анализ поверхности субстратсвязывающей бо роздки в модели Tdp1 позволил определить важные участки взаимодействия с потенциальными ингиби торами. Можно выделить две полости, обеспечива ющие связывание олигонуклеотида и фосфотиро зина, на границе которых располагаются боковые цепи His263 и Asn516 (рис. 2). Полость связывания олигонуклеотида представляет собой обширный участок, площадь поверхности которого составля ет 666 Å2. Среди аминокислотных остатков на этом участке можно отметить пары Ser400-Ser518 и Ser403-Ala520, которые участвуют в связыва нии второй и третьей фосфатной группы с 3’-конца. Полость связывания фосфотирозина существенно меньше по размеру (206 Å2), но при этом в ее форми ровании принимают участие все ключевые остатки активного центра - Нis263, His493, Lys265, Lys495, Asn283, Asn516, а также остатки Tyr204, Pro461 и Trp590, образующие гидрофобные контакты. Большинство известных ингибиторов Tdp1 лише ны отрицательно заряженных элементов структуры. Поэтому вполне возможно, что полость фосфотиро зина, приспособленная для размещения 3’-концевого фосфата, не вовлечена в связывание этих соедине ний. Данное предположение подтверждается при мо делировании связывания методом молекулярного докинга. Так, производные диазаадамантана, об ин гибиторных свойствах которых сообщено недав но [24], располагаются на участке олигонуклеотида в активном центре модели Tdp1. Трициклический фрагмент занимает место третьего остатка рибозы с 3’-конца, а протяженный гидрофобный заместитель ориентирован в сторону участка связывания фосфо тирозина, однако с ним не взаимодействует (рис. 3А). Скрининг ингибиторов Наличие кластера консервативных остатков Lys265, Lys495, Asn283, Asn516, формирующих участок свя зывания фосфотирозина, приводит к эффективно му электростатическому взаимодействию фермента с субстратом и может быть важным структурным фактором, способным обеспечить связывание кон курентных ингибиторов, содержащих соответству ющие заряженные функциональные группы. Такой функциональной группой могла бы быть сульфо группа SO3 -, являющаяся структурным аналогом фосфатной группы. Для проверки данного предпо ложения из библиотеки низкомолекулярных со единений были отобраны сульфоновые кислоты и их соли (71 соединение), удовлетворяющие правилу трех, которое определяет диапазон физико-хими ческих параметров для молекулярных фрагментов (небольших молекул, используемых для первичного скрининга и последующей оптимизации структуры). Соединения докировали в активный центр модели Tdp1 и проверяли их способность к образованию во дородных связей с Lys265, Lys495, Asn283, Asn516, а также других взаимодействий с участками связы вания ДНК и пептида. В результате проведенного скрининга были выбра ны наиболее перспективные ингибиторы STK370528 и STK376552, в которых сульфогруппа соединена с гетероциклическим фрагментом с помощью тиоэфирного линкера (табл. 2, рис. 3Б). Конформацию аминокислотных остатков, взаимодействующих с STK370528 и STK376552 в полученных фермент ингибиторных комплексах, затем оптимизировали с использованием гамильтониана RM1. Повторный молекулярный докинг с уточненными моделями белка показал, что STK370528 является более эф фективным ингибитором и характеризуется лучшей энергией связывания ΔGrecalc (см. данные в табл. 2). Ингибиторные свойства соединений по отноше нию к рекомбинантной форме Tdp1 человека изучали с использованием биосенсора, позволяющего опреде лять активность фермента в режиме реального времени - олигонуклеотида с флуорофором на 5’-конце и тушителем флуоресценции на 3’-конце. Метод ос нован на способности Tdp1 удалять с 3’-конца ДНК объемные аддукты различного происхождения [17], в том числе тушитель флуоресценции BHQ1 (Black Hole Quencher 1) [51]. После удаления BHQ1 в резуль тате активности фермента происходит разгорание 5’-концевого флуорофора, и интенсивность флуорес ценции зависит от количества расщепленного суб страта. На рис. 4 приведен типичный график зависи мости скорости реакции от концентрации STK370528. Значения IC50 составили 83 мкМ для STK370528 и 686 мкМ для STK376552. Таким образом эксперименталь ное исследование подтвердило выводы молекулярно го моделирования и показало, что выбранные соеди нения являются ингибиторами Tdp1, подавляющими каталитическую активность фермента в микромоляр ном диапазоне концентраций. Сульфогруппа ингибиторов способна занять по ложение 3’-фосфатной группы субстрата и об разовать водородные связи с аминокислотными остатками Lys265, Lys495, Asn283, Asn516 и His493, формирующими участок связывания фосфотиро зина (рис. 5). Расположение гетероциклического фрагмента на участке связывания олигонуклеоти да приводит к дополнительным взаимодействиям. В случае STK370528 бензотиазольная группа обра зует водородную связь с Asn516, а также гидрофобные контакты с боковыми цепями Ala520 и Ala521. Гибкий линкер в структуре ингибиторов обеспечи вает соединение групп, расположенных на различ ных участках активного центра Tdp1. В соединении STK376552 линкер удлинен на одно метиленовое звено, что приводит к нарушению взаимодействия с Asn516 и Ala521 и снижению ингибирующей спо собности STK376552 по сравнению с STK370528. Важную роль в связывании и ориентации ин гибиторов в активном центре Tdp1 играют элек тростатические взаимодействия с заряженными остатками Lys265, Lys495 и His493. В случае неза ряженных сульфонатов (метилового и фенилового эфиров STK370528) эффективность взаимодействия с остатками активного центра снижается, что под тверждается большим числом возможных ориен таций ингибитора в активном центре фермента при молекулярном моделировании. Моделирование связывания инденоизохинолиновых сульфонатов, которые ранее рассматривались в качестве потенци альных ингибиторов, однако не проявили активности в отношении Tdp1 [25], также свидетельствует о том, что этерифицированная сульфогруппа не способна обеспечить взаимодействие с участком связывания фосфотирозина. ВЫВОДЫ Проведенное исследование показало, что созданная молекулярная модель фермента репарации Tdp1, учитывающая особенности структурной организа ции активного центра, адекватно описывает характер связывания низкомолекулярных соединений и позволяет отбирать конкурентные по отношению к субстрату ингибиторы с помощью компьютерно го скрининга. На основе детального анализа меж молекулярных взаимодействий из компьютер ной библиотеки соединений выбраны сульфонаты STK370528 и STK376552, подавляющие активность фермента в микромолярном диапазоне концентра ций. Показано, что структурная организация и ло кализация участков связывания олигонуклеотида и фосфотирозина в субстратсвязывающей бороздке являются важными факторами, которые необходимо учитывать при создании новых ингибиторов Tdp1, а также оптимизации их структуры.

Об авторах

И. В. Гущина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

Д. K. Нилов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

A. Л. Захаренко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

O. И. Лаврик

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Алтайский государственный университет

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

В. К. Швядас

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы