Белки с цинковыми пальцами типа С2Н2 - самый многочисленный и наименее изученный класс транскрипционных факторов высших эукариот

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В результате проведенных за последние годы полно геномных исследований внутри- и межхромосомных взаимодействий установлено, что хромосомы чело века, мыши и дрозофилы организованы в большие топологические домены (ТАД) [1-4]. Внутри тополо гических доменов могут происходить дистанционные взаимодействия между промоторами, энхансерами и сайленсерами, что определяет регуляцию экспрес сии генов [5, 6]. Однако механизмы, обеспечивающие организацию и поддержание архитектуры хромосом, остаются почти неизученными [7]. Предполагается, что существует особый класс архитектурных белков, инактивация которых значительно влияет на распре деление меж- и внутрихромосомных контактов [8, 9]. У позвоночных описан высококонсервативный транскрипционный фактор (ТФ) CTCF, который считается основным архитектурным белком хромо сом [10, 11]. Вместе с когезиновым комплексом CTCF участвует в организации границ топологических до менов, а также поддерживает дистанционные взаи модействия между регуляторными элементами вну три доменов [12-14]. Белок CTCF содержит кластер доменов цинковых пальцев C2H2-типа, часть из ко торых определяет высокоспецифичное связывание белка с ДНК. Белки с цинковыми пальцами C2H2 типа (С2Н2-белки) появились рано в процессе эволю ции и найдены у многих эукариотических организмов [15, 16]. Многие из них структурно сходны с CTCF. С2Н2-белки можно разделить на три группы [17]: 1) белки, имеющие один-два или много С2Н2-доменов, распределенных неупорядоченно, 2) белки, содер жащие три С2Н2-домена, организованные в кла стер на С-конце, 3) белки, содержащие более трех С2Н2-доменов в одном или нескольких кластерах. Наиболее хорошо описана группа консервативных ТФ с тремя С2Н2-доменами, многие из которых игра ют ключевую роль в регуляции экспрессии генов у всех высших эукариот [18, 19]. Настоящий обзор посвящен намного хуже исследованной группе ТФ, содержащих более трех C2Н2-доменов. СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ДОМЕНА С2Н2-ТИПА Цинковые пальцы типа C2H2 (Cys2-His2) - одни из наиболее часто встречаемых доменов в составе ТФ высших эукариот. Классический C2H2-домен длиной 28-30 а.о. состоит из β-шпильки (антипарал лельный β-лист, состоящий из двух β-тяжей) и сле дующей за ней α-спирали, которые формируют лево закрученную ββα-структуру (рис. 1А). Стабилизация структуры цинкового пальца достигается с помощью координационной связи атома цинка с двумя кон сервативными остатками цистеина с одного конца β-листа и двумя консервативными остатками гисти дина с С-концевой части α-спирали. Пары цистеи нов и гистидинов являются консервативными, так же как гидрофобное ядро, формирующее α-спираль. Остальные аминокислотные остатки в составе C2H2 доменов отличаются значительной вариабельностью. Одной из первых была расшифрована структура комплекса из трех тандемно расположенных С2Н2 доменов белка Zif268 млекопитающих [20]. Показано, что три цинковых пальца образуют полукруг, распо лагаясь в большой бороздке ДНК (рис. 1А). Каждый из трех С2Н2-доменов связывается с тремя-четырь мя нуклеотидами ДНК, используя аминокислоты в одних и тех же позициях α-спирали (рис. 1Б) - ар гинин в позиции -1, а также аминокислотные остат ки в позициях 2, 3 и 6. Биохимическое и структур ное изучение C2H2-доменов подтвердило ключевую роль аминокислот в этих позициях для специфич ного связывания с ДНК. Согласно канонической мо дели, аминокислоты в положении 6, 3 и -1 отвечают за узнавание первого, второго и третьего нуклеотида с 5’-конца соответственно, а аминокислота в позиции 2 узнает четвертый нуклеотид, который находится на комплементарной цепи (рис. 1Б). Структурные исследования C2H2-доменов по зволили описать новый принцип распознавания ДНК. Отличительной особенностью белков с C2H2 доменами является их специфическое связывание с длинными последовательностями ДНК (20-40 п.н.), что отличает этот класс белков от всех других ТФ, которые обычно узнают сравнительно короткие вы рожденные ДНК. Обычно тандемные С2Н2-домены, участвующие в узнавании ДНК, разделены кон сервативными участками, состоящими из 5 а.о. [21]. Разработаны алгоритмы, которые позволяют с высо кой степенью вероятности предсказывать последо вательность, с которой может связываться кластер С2Н2-доменов, и, наоборот, подбирать комбинации С2Н2-доменов, узнающих целевые последовательно сти ДНК [22, 23]. Однако в больших кластерах (более трех С2Н2-доменов) интерференция между соседни ми С2Н2-доменами усложняет точное предсказание сайта связывания [24]. В отличие от универсального механизма взаимо действия С2Н2-доменов с ДНК, контакты с белками и РНК могут осуществляться с помощью разных комбинаций аминокислот, что описано в других обзорах [25, 26]. Обычно С2Н2-кластеры находятся в центре или на С-конце белка. Большая часть белков, содер жащих С2Н2-кластер в центральном положении, не имеют других консервативных доменов. В то же время белки с кластером на С-конце часто содержат дополнительные N-концевые домены (рис. 2). У по звоночных можно выделить KRAB- и SCAN-домены, а у насекомых - ZAD-домен [27, 28]. Небольшая группа С2Н2-белков имеет на N-конце консерва тивный ВТВ/POZ-домен. Этот домен часто встре чается в составе разных классов белков, поэтому мы исключили описание этой группы С2Н2-белков из настоящего обзора. Обобщенную информацию по ВТВ-содержащим белкам можно найти в подроб ных обзорах [29, 30]. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ТОЛЬКО КЛАСТЕР С2Н2-ДОМЕНОВ Группа ТФ, которые содержат только кла стер С2Н2-доменов, включает наиболее из ученный и консервативный белок CTCF (CCCTC связывающий фактор) [31], впервые описанный как негативный регулятор экспрессии гена myc [32]. Позже сайт связывания CTCF был найден в составе инсулятора, находящегося на границе β-глобинового локуса курицы [33]. Сайты связывания CTCF часто расположены на границах хромосомных районов с разным эпигенетическим статусом и транскрип ционной активностью, а также на границах топо логически ассоциированных доменов (ТАД), про странственно разделяющих хромосомы на районы, внутри которых происходит взаимодействие регу ляторных элементов [34-37]. Белок CTCF - один из немногих консервативных белков, содержащих кластер C2H2-доменов. Гомолог CTCF у дрозофилы (dCTCF) также часто находит ся на границах ТАД и в составе инсуляторов [38, 39]. В модельных трансгенных системах dCTCF поддер живает дистанционные взаимодействия между про мотором репортерного гена и активатором GAL4 [40, 41]. На N-конце белка dCTCF обнаружен домен, спо собный к гомодимеризации (рис. 3А), который, веро ятно, нужен для поддержания дистанционных взаи модействий между удаленными друг от друга сайтами связывания белка dCTCF [42]. Попытки найти анало гичный димеризующийся домен в белках CTCF по звоночных пока не привели к результату. В in vitro экспериментах показано, что C-концевой домен CTCF связывается с кластером С2Н2-доменов [43]. Однако специфичность такого взаимодействия не доказана. Согласно общепринятой модели, когезиновый ком плекс, необходимый для спаривания гомологичных хромосом в процессе клеточного деления [44], свя зывается с белком СТСF и участвует в поддержании специфичных дистанционных взаимодействий меж ду его сайтами в интерфазных хромосомах (рис. 3Б). В C-концевом домене СTCF человека картирован участок, который взаимодействует с одним из белков когезинового комплекса [44]. Связывание CTCF с ДНК, консервативное даже между насекомыми и млекопитающими, подробно изучено у многих высших эукариот [15, 45]. С2Н2 домены 4-7 белка СTCF (рис. 3А) участвуют в свяПримерно 20% сайтов содержат второй мотив из 10 п.н., для связывания с которым нужны С2Н2 домены 9-11 [47, 48]. Предполагается, что второй мо тив, расположенный на расстоянии 5-6 п.н., увеличи вает стабильность связывания CTCF с ДНК. Транскрипционный фактор CTCF вовлечен во мно гие процессы, такие, как эмбриональное развитие, инактивация Х-хромосомы у самок, регуляция ре комбинации между генными кластерами при сбор ке зрелых генов иммуноглобулинов, регуляция аль тернативного сплайсинга [34-37, 49-51]. Показано, что CTCF взаимодействует с большим количеством белков (рис. 3А), таких, как Smad [52], факторы ос новного комплекса транскрипции TFII-I [53] и TAF- 3 [54], хеликаза р68, содержащая домен с DEAD боксом [55], нуклеофосмин, Kaiso [56], ТФ YB-1, YY1 и Oct4 [57-59], хеликаза СHD8 [60], Su(z)12 - компо нент Polycomb-комплекса 2 (РRC2) [61], компонент Sin3A деацетилазного комплекса [62], CENP-E [48] и многие другие белки [49]. В большинстве случаев в белок-белковых взаимодействиях участвуют от дельные С2Н2-домены белка CTCF [49]. Вероятно, участие CTCF в различных процессах (активация и репрессия транскрипции, организация дистанцион ных взаимодействий, формирование ТАД) во многом определяется формированием альтернативных ком плексов с белками-партнерами. Получены экспериментальные данные, показы вающие, что с СTCF связывается большое коли чество РНК, модулирующих его активность. РНК связывающий домен CTCF представляет собой комбинацию участка С-концевого домена и двух С2Н2-доменов (10 и 11), которые in vitro неспеци фично узнают РНК [63, 64]. Предполагается, что вза имодействие с некоторыми РНК может увеличивать способность CTCF формировать мультимерные ком плексы [63] или снижать стабильность взаимодей ствия CTCF с ДНК [11]. Активность CTCF также регулируется различными посттрансляционными модификациями: поли(ADP)-рибозилированием [65], фосфорилированием [66] и сумоилированием [67]. Белок СТСF достаточно хорошо изучен и служит примером ТФ, включающего кластер С2Н2-доменов и неструктурированные N- и C-концевые участки. Большая часть других С2Н2-белков имеет анало гичную структуру, но при этом их функции и свой ства пока не исследованы. Можно предположить, что некоторые С2Н2-белки могут выполнять функ ции, сходные с CTCF. Интересно, что у дрозофилы мутанты по гену ctcf доживают до взрослой стадии, что предполагает присутствие в геномах насекомых других транскрипционных факторов, замещающих функции СTCF [42]. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ С КЛАСТЕРОМ С2Н2-ДОМЕНОВ И N-КОНЦЕВЫМ KRAB-ДОМЕНОМ Около одной трети белков человека с кластером C2H2-доменов содержат на N-конце KRAB-домен (Krüppel-associated box) (рис. 4А) [68]. В общей слож ности у человека найдено 742 разных С2Н2-белка с KRAB-доменом, которые кодируются 423 генами [69]. При этом 384 гена сгруппированы в 25 хромо сомных кластеров, и только 39 KRAB-С2H2-белков кодируются одиночно расположенными генами. Белки с KRAB-доменами обнаружены только у чет вероногих животных. Кластеризация на хромосомах и распространение в пределах крупных таксонов по зволяют предположить, что данное семейство генов произошло в результате дупликаций, которые закре пились в процессе эволюционного отбора [70]. KRAB домен состоит приблизительно из 75 а.о. и структур но может быть разделен на два субдомена - A и B, которые, как предсказано, сворачиваются в две амфипатические α-спирали (рис. 4Б). Субдомены KRAB-A и KRAB-B всегда кодируются отдельны ми экзонами. В результате альтернативного сплай синга образуются мРНК, кодирующие либо только субдомен KRAB-A, либо одновременно оба субдоме на - KRAB-A и KRAB-B, разделенные спейсером вариабельной длины. У человека белки KRAB могут содержать от 2 до 40 С2Н2-доменов. В отличие от ге нов других семейств, С2Н2-домены KRAB-белков чаще всего кодируются одним экзоном [71]. Белки KRAB-C2H2 широко представлены в гено мах четвероногих и многие из них участвуют в ре прессии транскрипции [70]. Универсальный и хорошо изученный механизм репрессии связан с привле чением белка КАР-1 (KRAB-Associated Protein-1), единственного описанного кофактора всех иссле дованных KRAB-белков, репрессирующих транс крипцию. KRAB-А-домен непосредственно вза имодействует с КАР-1, который, в свою очередь, служит платформой для привлечения репрессорных комплексов (рис. 4В). Пять аминокислот (рис. 4Б), консервативных во всех KRAB-A-доменах млеко питающих (DV в положении 6,7 и MLE в положе ниях 36-38), нужны для связывания KAP-1 [72, 73]. Функциональная роль KRAB-B-субдомена оста ется неизученной. Предполагается, что этот домен увеличивает эффективность привлечения КАР-1 зависимого репрессорного комплекса [74]. На N-конце белка КАР-1 находится домен RBCC (Ring Finger/B box/Coiled-Coil), который обеспечивает связыва ние KAP-1 с KRAB-доменом. Центральная часть КАР-1 содержит гидрофобный пентапептид, вза имодействующий с Сhromo-Shadow (СS)-доменом белка НР1. На С-конце белка расположены два PHD домена, которые рекрутируют комплексы, участву ющие в деацетилировании (NURD) и метилировании (SETDB1) гистонов [70, 75-77]. Репрессия, иниции руемая в районе связывания КRAB-C2H2-белков, может распространяться в окружающие участки ге нома на десятки тысяч нуклеотидов в результате по следовательного внесения метки Н3К9me3 и связы вания с ней репрессора НР1 [78-80]. Пик экспрессии белка КАР-1 приходится на ранние эмбриональные стадии, и репрессия транскрипции, осуществляемая KRAB-С2H2-белками, критична для раннего эм брионального развития. На более поздних стадиях репрессия может поддерживаться в соматических клетках с помощью эпигенетических механизмов без непосредственного участия KRAB-C2H2-белков [81, 82]. Большая часть KRAB-С2Н2-белков видо и родоcпецифичны. У некоторых позвоночных, птиц, ящериц и лягушек KRAB-А-домен имеет множественные замены аминокислот, необходимых для взаимодействия с KAP-1 [31, 72]. Это можно объ яснить либо тем, что KRAB-домен у них выполняет другие функции, либо эти классы позвоночных име ют измененный KAP-1, который сохраняет способ ность взаимодействовать с KRAB-доменом. В целом, эволюционный анализ консервативности KRAB- С2Н2-белков показал, что у позвоночных каждого класса происходило независимое формирование се мейства генов KRAB-С2Н2, что подтверждает высо кую эволюционную скорость появления новых генов этого класса. Известны только три гена KRAB-С2Н2, входящих в один кластер и общих для всех исследованных ви дов позвоночных. Эти гены кодируют С2Н2-белки, содержащие KRAB-домен с измененной структу рой, который перестает связывать репрессор KAP- 1 и участвует в стимуляции транскрипции [31, 83, 84]. Наиболее интересен высококонсервативный ген Meisetz (PRDM9), который имеет не только мо дифицированный KRAB-домен, но и домен SET [85, 86]. С помощью совместного действия SET и KRAB-доменов происходит рекрутирование Н3К4 метилтрансферазы, отвечающей за триметилирова ние гистона Н3 по лизину 4 (Н3К4me3). Модификация Н3К4me3 в области промоторов обычно коррелирует с активной транскрипцией. Биоинформатический анализ показал, что часть KRAB-домена, кодируе мого геном Meisetz, имеет гомологию с KRI-мотивом, присутствующим в геномах всех хорошо изученных эукариот, включая арабидопсис, рис, грибы и дрож жи [31, 86]. Широкое распространение мотива KRI предполагает, что KRAB-домен белка Meisetz мог произойти из этого мотива в результате присоеди нения дополнительных аминокислотных остатков. Приобрести функции репрессора KRAB-домен мог в результате случайных мутаций, которые позволи ли репрессору связываться с КАР-1, что закрепи лось в процессе эволюции. Экспериментально показано, что у позвоночных ТФ класса KRAB-С2Н2 играют важную роль во мно гих процессах эмбрионального развития, клеточ ной дифференцировки и пролиферации, регуляции клеточного цикла и апоптоза [70, 73]. Сайты связы вания KRAB-С2Н2-белков коррелируют с участка ми открытого (свободного от нуклеосом) хроматина, что объясняется связыванием с активными регуля торными районами генов [87]. Полногеномные иссле дования показывают, что белки KRAB-С2Н2 связы ваются с энхансерами и промоторами генов и могут в некоторых случаях активировать транскрипцию [88-90]. Способность KRAB-C2H2-белков активиро вать транскрипцию должна коррелировать с супрес сией взаимодействия KRAB-домена с белком КАР-1. Механизм такой супрессии пока остается неисследо ванным, но, вероятно, связан с обратимыми модифи кациями аминокислотных остатков KRAB-домена. Важную роль могут играть и С2Н2-домены, которые потенциально способны рекрутировать отдельные ТФ и целые комплексы, позитивно/негативно регу лирующие транскрипцию. Интересной функцией обладает уже описанный выше белок Meisetz (PRDM9), который экспрес сируется только в гонадах млекопитающих [91]. Оказалось, что большая часть горячих точек ре комбинации у млекопитающих содержит вероят ный сайт связывания белка PRDM9 [92]. Быстрые эволюционные изменения в первичной структу ре С2Н2-доменов и их количестве привели к тому, что у разных млекопитающих PRDM9 связывает ся с разными нуклеотидными последовательностя ми ДНК [91, 93-96]. Связывание PRDM9 приводит к формированию свободного от нуклеосом района и модификации Н3К4me3 окружающих нуклеосом [97]. Предполагается, что комплекс SPO11, индуци рующий двухцепочечные разрывы, одновременно узнает гистоновую метку Н3К4me3 и непосредствен но связывается с белком PRDM9 [98]. Недавно была открыта новая функциональная роль KRAB-C2H2-белков в репрессии транскрипции чужеродной ДНК, прежде всего эндогенных ретро вирусов, мобильных элементов LINE и SINE [79, 87, 99, 100]. Мобильные элементы составляют значитель ную часть генома млекопитающих, и репрессия их транскрипции жизненно необходима [101]. Разные KRAB-С2Н2-белки связываются с регуляторными областями мобильных элементов и ретровирусов определенного типа и индуцируют их эпигенети ческую репрессию. Существует гипотеза, согласно которой вновь возникшие белки KRAB-С2Н2 закре пляются эволюционным отбором, так как играют критическую роль в подавлении экспрессии новых мобильных элементов, в то время как более консер вативные KRAB-С2Н2 участвуют в регуляции экс прессии клеточных генов [79]. Другим объяснением быстрой эволюции генов, кодирующих KRAB-С2Н2-белки, может быть их ключевая роль в контроле экспрессии генов, опреде ляющих развитие нервной [102] и кровеносной [103] систем у млекопитающих. Например, многие гены, кодирующие KRAB-С2H2-белки, специфичные для человека и приматов, активно транскрибируются в мозге [102]. Однако не существует прямой корре ляции между количеством генов KRAB-С2Н2 и ус ложнением организма. Так, например, опоссум имеет в 2 раза больше генов KRAB-С2Н2, чем человек [31]. Можно надеяться, что появление новых технологий получения специфичных антител, полногеномного анализа и мутаций отдельных генов с помощью си стемы CRISPR/Cas9 позволит в ближайшем буду щем прояснить функциональную роль KRAB-С2Н2 белков. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ С КЛАСТЕРОМ С2Н2-ДОМЕНОВ И N-КОНЦЕВЫМ SCAN-ДОМЕНОМ SCAN-домен был впервые описан в составе ТФ ZNF174 человека [114] (рис. 5А). В дальнейшем белки с доменами такого типа обнаружили и у представи телей ряда других классов позвоночных [104]. У че ловека, мыши и коровы найдено 71, 38 и 28 SCAN- С2Н2-белков соответственно [94]. Гены, кодирующие SCAN-белки, обычно располагаются в геноме неболь шими кластерами (по два-семь) [104]. Находящиеся в кластерах SCAN-домены имеют более высокую степень гомологии между собой, что предполагает их появление в результате дупликации генов и последу ющей адаптивной эволюции. Примерно половина ге нов кодирует одновременно SCAN- и KRAB-домены и обычно находится в больших кластерах вместе с генами, кодирующими только KRAB-C2H2-белки (рис. 5А) [27, 94]. Структура SCAN-домена имеет высокую степень сходства с С-концевыми доменами белка капсида вируса иммунодефицита человека [105] и белка Gag ретротранспозонов семейства gypsy/Ty3 [27]. На ос нове этих данных предположили, что исходно SCAN домены возникли из капсидных белков ретровирусов у низших позвоночных, далее в процессе эволюции этот домен приобрел новую функцию в составе ТФ, содержащих кластеры С2Н2-доменов [106]. KRAB домен в комбинации со SCAN-доменом присутству ет у млекопитающих и ящериц, но его нет у курицы и лягушки. На сегодняшний день описаны пространствен ные структуры SCAN-доменов белков Zfp206 [107], PEG3 [108], ZNF24, ZNF174 [105] и MZF-1 [109], ко торые имеют высокую степень сходства (рис. 5Б). Особенности пространственной структуры можно рассмотреть на примере SCAN-домена белка Zfp206 [107], который формирует антипараллельный гомо димер. Каждый мономер в составе гомодимера состо ит из пяти α-спиралей. Ядро внутренней поверхности гомодимера образуется упаковкой второй α-спирали одного мономера вокруг третьей и пятой α-спиралей противоположного мономера и наоборот. N-Концевая первая α-спираль обеспечивает дополнительные контакты одного мономера с третьей α-спиралью противоположного мономера (рис. 5Б). Все SCAN домены могут гомодимеризоваться, но только не которые SCAN-домены способны образовывать гетеродимеры [104, 111-113]. Первая α-спираль SCAN-домена отличается наибольшей вариабель ностью последовательности гидрофобных аминокис лотных остатков и рассматривается как возможный кандидат, детерминирующий образование гетеро димеров между различными SCAN-доменами. Так, показана способность SCAN-домена белка Zfp206 к гетеродимеризации с аналогичным доменом Zfp110 [107]. Замена первой α-спирали на α-спираль гете рологичного SCAN-домена ZNF174 или ее удаление приводят к потере способности этих SCAN-доменов к гетеродимеризации. Известно, что КRAB-A-домен рекрутирует ре прессорный комплекс, тогда как данные о влия нии SCAN-домена на транскрипцию отсутствуют [104, 111]. Существуют только отрывочные све дения о функциональной роли ТФ SCAN-C2H2. Например, ТФ ZNF263 человека, содержащий SCAN- и KRAB-домены и 9 С2Н2-доменов, преиму щественно связывается с промоторными областями и способен участвовать как в активации, так и в ре прессии транскрипции [89]. Другой представи тель семейства - белок ZNF658, также содержит SCAN- и KRAB-домены и участвует в активации экспрессии генов рРНК, которые транскрибируют ся РНК-полимеразой I [115]. Можно предположить, что основная функция SCAN-белков связана со спо собностью к формированию гомо- и гетеродимеров между SCAN-доменами. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ С КЛАСТЕРОМ С2Н2-ДОМЕНОВ И N-КОНЦЕВЫМ ZAD-ДОМЕНОМ ZAD (zinc-finger-associated domain)-домен (рис. 6А) обнаружен на N-конце С2Н2-белков многих члени стоногих [28]. У позвоночных найден только один бе лок, содержащий на N-конце структуру, имеющую сходство с ZAD-доменом [116]. В геномах Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster и Apis mellifera (медоносная пчела) найдено 147, 98 и 29 ZAD-C2H2 белков соответственно [116], тогда как у ракообраз ных (Daphnia pulex) обнаружено только четыре гена, кодирующих ZAD-подобные домены. Обычно гены, кодирующие ZAD-домены с более высокой гомологи ей, образуют небольшие кластеры. Предполагается, что эти гены возникли в результате множественных дупликаций исходных копий с последующим их за креплением в результате положительного отбора [28, 116]. Вероятно, эволюционный процесс шел очень бы стро, так как только у нескольких белков ZAD-C2H2 найдены очевидные гомологи у удаленных друг от друга видов дрозофилы [116]. Размер ZAD-домена варьирует в пределах 71-97 а.о. Множественное выравнивание последова тельностей 32 членов семейства показало, что этот домен состоит из четырех консервативных блоков, соединенных варьирующими по длине районами [28]. Отличительной особенностью ZAD-доменов является присутствие двух инвариантных пар цистеинов, уча ствующих в координации иона цинка. К настоящему моменту получена кристалличе ская структура только одного ZAD-домена белка Grauzone (Grau) [117], которая может быть прототи пом для всех ZAD-структур (рис. 6Б). N-Концевая часть ZAD-домена представляет собой глобулярную структуру вокруг иона цинка, а C-концевой стебель сформирован длинной α-спиралью 2 (α2), которая составляет почти одну треть от всех аминокислот в ZAD-домене. Сворачивание ZAD-домена в значи тельной степени зависит от координации ионом цин ка двух пар цистеинов, разделенных приблизитель но 50 а.о., что приводит к стягиванию участков β2-α2 и N-конца к центру домена. В кристалле две молекулы ZAD-домена ассоции рованы в виде антипараллельного димера. Большая часть аминокислотных остатков, консерватив ных в ZAD-семействе [28], отвечает за контакты между двумя субъединицами. ZAD-домен Grau имеет отрицательно заряженную поверхность, что указывает на его неспособность связывать ДНК [117]. Предполагается, что основной функци ей ZAD-домена является образование гомодимеров С2Н2-белков [118]. ZAD-домены также участву ют в регуляции ядерной локализации некоторых ZAD-С2Н2-белков [119]. Белки с ZAD-доменами составляют пример но одну треть от общего числа белков с С2Н2 кластерами и одну десятую часть от всех ТФ в ге номе D. melanogaster [28]. К настоящему моменту изучены функции только небольшой части ТФ ZAD- С2Н2. Большинство ZAD-С2Н2-белков экспресси руются в процессе оогенеза и в раннем эмбриогенезе [116]. На важную функциональную роль ZAD-C2H2 белков в процессе развития дрозофилы указывают результаты ряда исследований. Белок, связывающий мотив 1 (Motif 1 Binding Protein, M1BP), экспрессируется на высоком уровне во всех тканях и на всех стадиях развития дрозофи лы и является ключевым в организации архитектуры более 2000 промоторов дрозофилы, имеющих харак терный мотив (T/C)GG(T/C)CACACTG [120]. В трансгенных линиях дрозофилы три ZAD-C2H2 белка - Pita, ZIPIC и Zw5 - проявляют свойства инсуляторных/архитектурных белков: блокируют взаимодействие между энхансером и промотором и поддерживают дистанционные взаимодействия [118, 121-124]. ZAD-домены этих белков формиру ют только стабильные гомодимеры [118]. Интересно, что фрагменты ДНК, содержащие сайты связывания разных ZAD-C2H2-белков не поддерживают дистан ционные взаимодействия, что предполагает ключе вую роль димеризации ZAD-доменов в организации специфичных контактов между удаленными участ ками хроматина. Действительно, ZAD-домен белка ZIPIC нужен для поддержания дистанционных вза имодействий между активатором GAL4 и промото ром репортерного гена в дрожжах Saccharomyces cerevisiae [118]. Как и в случае М1BP, cайты связы вания белков ZIPIC, Pita и Zw5 преимущественно находятся в непосредственной близости от стартов транскрипции [118, 125], что предполагает архитек турную функцию этих белков в организации промо торов. Нуль-мутации в генах, кодирующих белки Pita и Zw5, приводят к поздней эмбриональной - ранней личиночной летальности, что указывает на важную роль этих белков в процессе эмбрионального развития [121, 126]. Белок Grau экспрессируется на всех стадиях раз вития дрозофилы, он обнаруживается в ядрах пита ющих и фолликулярных клеток, окружающих ооцит [127, 128]. Мутации гена этого белка приводят к оста новке оогенеза на стадии II мейоза, что связано с ро лью Grau в активации промотора гена cortex, регули рующего мейоз в ооцитах [127, 128]. Белок Serendipity delta (Sry δ) связывается с промотором ключевого гена раннего эмбриогенеза bicoid и стимулирует его транс крипцию [129]. Нуль-мутации в гене sry δ проявляют ся как эмбриональные летали, что указывает на зна чимость Sry δ в раннем развитии дрозофилы [130]. Белок Trade Embargo (Trem) экспрессируется преимущественно в половых клетках дрозофилы и, вероятно, выполняет сходную функцию с белком PRDM9 у млекопитающих [95, 97, 131]. Белок Trem определяет места посадки белка Mei-P22, который участвует в индукции разрывов на мейотических хромосомах [131]. Белок Mei-P22 вместе со своим партнером, Mei-W68, участвует в образовании двух цепочечных разрывов, инициирующих кроссинговер в процессе мейоза [132-134]. Согласно модели, Trem совместно с партнерами создает области открытого хроматина, которые привлекают с помощью специфичных белок-белковых взаимодействий комплекс Mei-P22/Mei-W68, индуцирующий двухцепочечные разрывы [131]. В целом, имеющиеся данные показывают, что группа ТФ ZAD-C2H2 играет важную роль в организации структуры и функциональной активности промоторов, рекрутировании белковых комплексов и формировании архитектуры хромосом. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время нерешенными остаются многие вопросы, связанные с регуляцией транскрипции ге нов, организацией структуры регуляторных элемен тов и механизмами дистанционных взаимодействий. Также совершенно очевидно, что СTCF позвоночных не может быть единственным и ключевым ДНК связывающим белком, определяющим архитектуру хромосом позвоночных [7]. В отличие от хорошо изученных ТФ других клас сов, белки С2Н2 специфично связываются с длин ными участками ДНК, достигающими нескольких десятков пар нуклеотидов. Белки С2H2 могут эф фективно связываться с ДНК в виде мономеров, в отличие от большинства других ТФ, которые свя зываются с короткими палиндромными последо вательностями как гомо- или гетеродимеры. Часть С2Н2-доменов в комбинации с неструктурирован ными участками С2Н2-белков может обеспечивать многообразные взаимодействия с белковыми ком плексами, отдельными ТФ и РНК. Таким образом, С2Н2-белки можно рассматривать в качестве пер спективных кандидатов на роль организаторов ар хитектуры регуляторных элементов, таких, как про моторы, энхансеры, инсуляторы и сайленсеры. К сожалению, отсутствие достаточного количества экспериментальных данных не позволяет подтвер дить правильность этого предположения для позво ночных. С другой стороны, всесторонне изученный белок СTCF позвоночных обладает рядом свойств (специфичное связывание с сайтом на ДНК, фор мирование открытых участков хроматина, рекру тирование белковых комплексов, организация дистанционных взаимодействий), которые могут быть экстраполированы на другие С2Н2-белки. Наконец, многие С2H2-белки имеют гомодимери зующиеся домены. Интересно, что у членистоногих и позвоночных произошло распространение разных доменов - ZAD и SCAN соответственно. Основное объединяющее свойство ZAD- и SCAN-доменов - их способность к преимущественному формированию гомодимеров. Показано, что гомодимеризующиеся ZAD-домены трех ZAD-C2H2-белков (Pita, ZIPIC, Zw5) определяют специфичность дистанционных взаимодействий [118]. Вероятно, аналогичными свойствами обладают и другие ZAD-C2H2-белки. Пока получены только отдельные данные о роли SCAN-С2Н2-белков в организации активных про моторов позвоночных. Возможно, что, помимо ZAD и SCAN-доменов, С2Н2-белки имеют и другие доме ны, способные к мультимеризации, как, например, N-концевой домен белка dCTCF дрозофилы [42]. Таким образом, имеющиеся фрагментарные дан ные уже сейчас позволяют предложить модель, согласно которой С2Н2-белки играют роль по средников в передаче информации от нуклеотид ной последовательности регуляторных элементов (промоторов, энхансеров, сайленсеров) к белковым комплексам, которые определяют свойства регуля торных элементов. Предполагается, что исследо вание отдельных представителей этого обширного класса ТФ, выяснение функциональной роли ZAD- , SCAN- и KRAB-доменов, идентификация новых белков-партнеров и димеризующихся доменов по зволит оценить реальный вклад C2H2-белков в фор мирование архитектуры хромосом и структуры ре гуляторных элементов.

Об авторах

A. A. Федотова

Email: georgiev_p@mail.ru
Россия

A. Н. Бончук

Email: georgiev_p@mail.ru
Россия

В. А. Могила

Email: georgiev_p@mail.ru
Россия

П. Г. Георгиев

Автор, ответственный за переписку.
Email: georgiev_p@mail.ru

Список литературы

Дополнительные файлы