Влияние рекомбинантного адресного токсина DARPin-PE40 на динамику роста HER2-положительных опухолей

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Рак молочной железы согласно статистическим данным МНИОИ им. П.А. Герцена Минздрава России за 2015 год является ведущим по часто те встречаемости злокачественных заболеваний у женщин и составляет 20.9% от общего количества ежегодно выявляемых новообразований [1]. Рак мо лочной железы также занимает печально лидиру ющее место по смертности от онкологических забо леваний среди женского населения России, и в 2015 году этот показатель составлял 17%. Что касается мировой статистики, то ежегодно в мире пример но у 1.6 млн женщин диагностируют рак молочной железы, и примерно 500000 умирают от этого за болевания. C учетом этих цифр, разработка новых противо опухолевых агентов и новых подходов к терапии онкологических заболеваний является актуальной задачей. Большое развитие в последнее время полу чила таргетная, или адресная, терапия. Этот подход предполагает нацеленное воздействие на опухоле вые клетки за счет использования специфических бифункциональных терапевтических агентов, спо собных, с одной стороны, избирательно связываться с опухолевыми клетками, а с другой - эффективно элиминировать их [2]. Одна из наиболее изученных терапевтических мишеней - рецептор HER2 семейства рецепто ра эпидермального фактора роста человека [3, 4]. Тирозинкиназный рецептор HER2 в норме при сутствует во всех типах эпителиальных тканей че ловека, и его плотность составляет несколько ты сяч молекул на клетку. Амплификация гена HER2 при злокачественной трансформации клетки приво дит к сверхэкспрессии кодируемого им рецептора, при этом рецептор HER2 обретает способность к кон ститутивной гетеродимеризации c другими рецепто рами семейства (HER1, HER3, HER4). Непрерывная передача сигнала от мембраны к ядру приводит к по вышению клеточной пролиферации, ингибированию апоптоза и, в конечном итоге, к формированию опу холи и метастазированию. Известно, что в 15-20% опухолей молочной железы и рака яичника человека повышен уровень экспрессии гена HER2 [3, 5]. Одним из наиболее эффективных белковых токсинов, используемых в адресной терапии, яв ляется экзотоксин Pseudomonas aeruginosa [6]. Псевдомонадный экзотоксин представляет собой трехдоменный белок, состоящий из 613 а.о. Мы заме нили первый домен экзотоксина (1-252 а.о.), отвечаю щий за связывание токсина с природным рецептором, на HER2-специфичный неиммуноглобулиновый мо дуль DARPin [7], превратив таким образом экзотоксин в токсин направленного действия. Новый класс адрес ных молекул неиммуноглобулиновой природы на ос нове искусственных белков с анкириновыми повто рами - DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins), все шире и шире используется в молекулярно-био логических исследованиях в качестве адресных моду лей [8-10]. DARPins не содержат остатков цистеина, что позволяет продуцировать эти белки непосред ственно в цитоплазме Escherichia coli, отличаются высоким уровнем экспрессии в бактериальной систе ме, представлены мономерами в растворе, не склонны к агрегации и характеризуются высокой устойчиво стью к протеазам [11]. Перечисленные особенности дают каркасным белкам значительные преимущества перед иммуноглобулинами в качестве альтернатив ных адресных компонентов в составе мультифункци ональных соединений, предназначенных для диагно стики и терапии различных заболеваний. Нами проведен анализ динамики противоопухо левого эффекта адресного токсина на основе фраг мента псевдомонадного экзотоксина А и HER2 специфичного каркасного белка DARPin in vivo на ксенографтной модели аденокарциномы молочной железы человека с высокой экспрессией рецептора мишени HER2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение высокоочищенного препарата адресного токсина DARPin-PE40 для in vivo исследований Ген DARPin-PE40 экспрессировали в клет ках штамма E. coli BL21(DE3) как описано в [12]. Свежевыращенные трансформанты (из расчета 1 ко лония на 1 мл среды) вносили в 25 мл автоиндукцион ной среды TBP-5052 [13], содержащей 2 мM MgSO4, 25 мM Na2HPO4, 25 мM KH2PO4, 50 мМ NH4Cl, 0.5% глицерина, 0.05% глюкозы, 0.2% лактозы, 0.5% дрож жевого экстракта, 1% триптона, 0.1 г/л ампицилли на, и растили в 250-мл колбе в течение 24 ч при 25°С до достижения культурой оптической плотности OD600 = 20-25. Клетки осаждали центрифугирова нием на охлажденной центрифуге при 6000 g в тече ние 10 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфе ра для лизиса (200 мМ Tрис-НСl, 500 мМ сахароза, 1 мМ EDTA, рН 8.0, 60 мкг/мл лизоцима). Полученную суспензию разбавляли стерильной водой, инкубиро вали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем клетки помещали на ледяную баню и разру шали с использованием звукового дезинтегратора Vibra Cell (Sonics, США) в режиме - 10 с обработ ка ультразвуком, 10 с охлаждение, всего 30 циклов. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин на охлажденной цен трифуге. К осветленному супернатанту добавля ли ингибитор протеаз PMSF (1 мМ) и 100 мМ NaCl. Для удаления нуклеиновых кислот к лизату при по стоянном помешивании добавляли по каплям поли этиленимин до конечной концентрации 0.03%. После добавления полиэтиленимина лизат перемешивали в течение 15 мин при 4°С, центрифугировали в те чение 20 мин при 15000 g. Полученный лизат филь тровали через фильтр 0.22 мкм, добавляли имидазол (до конечной концентрации 30 мМ) и NaCl (500 мМ) и наносили на колонку Ni2+-NTA (GE Healthcare, США), предварительно уравновешенную буфером: 20 мM Na-Pi, pH 7.5, 500 мM NaCl, 30 мM имидазол. Целевой белок DARPin-PE40 элюировали, используя линейный градиент имидазола (30-500 мМ). Пик, со шедший с колонки при ~150 мМ имидазола, исполь зовали для очистки с использованием ионообменной хроматографии. Белок переводили в буфер, содер жащий 20 мM Tрис-HCl, pH 8.0, 150 мM NaCl, с ис пользованием колонки PD10 (GE Healthcare, США). Раствор белка разбавляли в 3 раза буфером 20 мM Tрис-HCl, pH 8.0 и наносили на колонку MonoQ5/50 GL (GE Healthcare, США), уравновешенную буфером 20 мM Tрис-HCl, pH 8.0. Для элюции белка использо вали линейный градиент NaCl (0-1 М). DARPin-PE40 элюировался с колонки при концентрации NaCl, равной примерно 500 мМ. Выход целевого белка соста вил 140 мг на 1 л культуры. Оценка противоопухолевой эффективности DARPin-PE40 in vivo Противоопухолевую активность определяли на ксе нографтной опухоли человека. Бестимусным мы шам линии BALB/c nude в возрасте 6-8 нед. вводи ли подкожно 107 клеток аденокарциномы молочной железы человека линии SK-BR-3 в 200 мкл фосфат но-солевого буфера. Сверхэкспрессию HER2 в опу холевой ткани подтверждали ex vivo методом им муногистохимического анализа с использованием набора HercepTest (Dako, США). Мониторинг роста опухоли проводили, используя стандартную ме тодику определения размеров опухоли с помощью штангенциркуля, измеряя два диаметра. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V = a × b2/2, где a - больший диаметр, b - меньший диаметр [14]. Начиная с 9 дня после инъекции опухолевых кле ток, когда средний объем опухоли составлял ~100 мм3, животных произвольным образом разделили на опытные и контрольную группы (по пять в каж дой группе). Животным опытных групп через день вводили в хвостовую вену по 200 мкл DARPin-PE40 в фосфатно-солевом буфере в общей дозе 25 мкг/ животное (пять инъекций по 5 мкг белка на 9, 11, 13, 15 и 17 дни), 50 мкг/животное (пять инъекций по 10 мкг белка на 9, 11, 13, 15 и 17 дни) или 80 мкг/жи вотное (четыре инъекции по 20 мкг белка на 9, 11, 13 и 15 дни). Животным контрольной группы вводи ли по 200 мкл фосфатно-солевого буфера на 9, 11, 13, 15 и 17 дни после инъекции опухолевых клеток. При достижении опухолевым узлом объема ~2500 мм3 животных подвергали процедуре эвтаназии. Для построения кривых роста опухолей использо вали рассчитанные значения объема опухоли, вы раженные в процентах от значений на начальный момент времени (в день начала терапии). Данные представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего в каждой временной точке. Для количественной оценки противоопухоле вого эффекта начальную стадию кривой опухоле вого роста у животных каждой группы описывали уравнением V = V0 × ekt, где V0 - значение объема опухолевого узла в начальный момент времени, со ответствующий началу терапии, k - коэффициент скорости роста опухоли. Значения k определяли путем линеаризации экспоненциальной фазы ро ста опухоли (логарифмирования значений объема опухоли) с последующей линейной аппроксимацией. Период удвоения опухоли рассчитывали по форму ле ln2/k. Данные представляли с помощью диаграмм размаха, отражающих значения медианы, 25-го и 75 го процентилей и разброса значений в каждой группе животных. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На предыдущих этапах работы нами был создан и детально охарактеризован in vitro агент направ ленного действия для высокоэффективной таргетной терапии HER2-положительных опухолей - реком бинантный адресный токсин DARPin-PE40. Данный агент обладает противоопухолевым эффектом, ко торый выражается в торможении роста ксенографт ных опухолей in vivo [15]. Адресный модуль в данной конструкции представлен молекулой неиммуногло булиновой природы на основе искусственного бел ка с анкириновыми повторами - DARPin, способной узнавать рецептор HER2 с высокой аффинностью (KD = 3.8 нM) [7]. В качестве цитотоксического моду ля в конструкции использовали фрагмент PE40 (мол. масса 40 кДа) псевдомонадного экзотоксина А, кото рый лишен природного рецепторузнающего домена [16]. Генетическую конструкцию, кодирующую этот гибридный белок, экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3). Гибридный белок DARPin-PE40 очища ли с помощью металл-хелатной и анионообменной хроматографии. В данной работе проведен углубленный анализ влияния DARPin-PE40 на динамику роста экспери ментальных опухолей in vivo. Использовали бести мусных мышей линии BALB/c nude (6-8 нед.) с под кожно привитой аденокарциномой молочной железы человека SK-BR-3 (см. «Экспериментальную часть»), которым повторно внутривенно вводили DARPin- PE40 в общей дозе 25, 50 или 80 мкг на животное (1.25, 2.5 или 4 мг/кг соответственно). Определение динамики роста опухолей выявило выраженный противоопухолевый эффект рекомби нантного адресного токсина DARPin-PE40: были об наружены статистически значимые различия в объ еме опухолей у мышей опытных групп по сравнению с контрольной (p < 0.05) (рис. 1). У опухолей как контрольной, так и опытных групп животных, получивших DARPin-PE40 в до зах 25 и 50 мкг, наблюдался экспоненциальный ха рактер начальной стадии роста (рис. 2А). При этом на фоне воздействия DARPin-PE40 опухоли росли существенно медленнее: показано статистически значимое снижение коэффициента скорости роста опухоли (рис. 2Б) и соответственно увеличение пе риода удвоения опухоли (рис. 2В) в опытных груп пах по сравнению с контрольной. Этот эффект может объясняться сокращением доли делящихся клеток в растущем опухолевом узле в результате цитоток сического действия адресного токсина. Развитие экс периментальных опухолей при действии DARPin- PE40 в максимальной использованной дозе (80 мкг) характеризовалось наличием двух этапов. На первом этапе во время инъекций DARPin-PE40 наблюда лось экспоненциальное сокращение объема опухо лей в среднем на 60% относительно объема к моменту начала терапии. На втором этапе после окончания инъекций DARPin-PE40 опухоли возобновили экс поненциальный рост (рис. 2). Принимая во внимание гетерогенность опухоли и высокую генетическую нестабильность опухолевых клеток [17], одной из причин недостаточной эффек тивности DARPin-PE40 может быть наличие или по явление устойчивой популяции опухолевых клеток, которая приводит к дальнейшей прогрессии опухоли по окончании терапевтического воздействия. Кроме того, поскольку условия эксперимента моделирова ли ситуацию терапевтического воздействия на уже сформировавшийся опухолевый узел, ограничения в эффективности адресного токсина можно связать и с его недостаточным проникновением вглубь опухо левой ткани. Это, в свою очередь, обусловлено рядом особенностей строения опухоли in vivo, включающих многочисленные межклеточные контакты, давление интерстициальной жидкости, а также присутствие внеклеточного матрикса. Таким образом, наряду с увеличением дозировки и/или продолжительности терапии, перспективным подходом к усилению про тивоопухолевого эффекта рекомбинантного адрес ного токсина DARPin-PE40 может стать сочетание его действия с направленным повышением проника ющей способности и накопления в опухоли. Подходы к решению данной проблемы довольно разнообраз ны и включают, в частности, контроль образования компонентов внеклеточного матрикса и/или их де градацию [18-20], а также временное нарушение межклеточных контактов в опухоли [21]. Последний подход показал свою эффективность при использо вании HER2-специфичных полноразмерных тера певтических антител [22] и, по-видимому, является одним из перспективных путей развития таргетной противоопухолевой терапии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование каркасных белков неиммуногло булиновой природы, в частности, DARPins, в ка честве адресных (направляющих) молекул акту ально для разработки новых агентов для таргетной противоопухолевой терапии. В работе исследована динамика противоопухолевой активности адрес ного токсина DARPin-PE40, в составе которого HER2-специфичный DARPin объединен в единую полипептидную цепь с токсическим фрагментом псевдомонадного экзотоксина А. Эффективность и достоверность противоопухолевого действия DARPin-PE40 свидетельствуют о перспективности его дальнейшего исследования как агента для таргет ной терапии опухолей с высокой экспрессией рецеп тора-онкомаркера HER2.

Об авторах

E. A. Соколова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Автор, ответственный за переписку.
Email: malehanova@mail.ru
Россия

Г. M. Прошкина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: gmb@ibch.ru
Россия

O. M. Кутова

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: malehanova@mail.ru
Россия

И. В. Балалаева

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: malehanova@mail.ru
Россия

С. M. Деев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: malehanova@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы