Специфическая активность амидной формы пептида HLDF-6: изучение на трансгенной модели болезни Альцгеймера

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ К числу важнейших медико-социальных проблем современности относятся цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания, являющиеся основной причиной смертности и инвалидизации населения России и зарубежных стран. К нейроде генеративным заболеваниям относится наиболее распространенная болезнь Альцгеймера (БА), диа гностированная почти у 44 млн человек [1]. БА про грессирует медленно, но неотвратимо и ведет к «от ключению» важнейшего органа - головного мозга и расстройству ряда функций организма человека. В последнее десятилетие болезнь Альцгеймера при знана одной из четырех главных медико-социальных проблем современного общества. Одним из серьезнейших цереброваскулярных заболеваний является ишемический инсульт (ИИ). Ежегодно в мире регистрируется более 15 млн слу чаев инсульта [2], в том числе более 450000 в России. К существенным недостаткам лекарственных средств, используемых при БА и ИИ и резко ограни чивающих область их применения, относятся неже лательные побочные эффекты, а также привыкание либо недостаточная эффективность. Все это требует принятия неотложных мер для создания и внедре ния в медицинскую практику новых эффективных препаратов для профилактики и лечения этих за болеваний. Фактор дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) был обнаружен и выделен нами в 1994 году из среды культивирова ния клеток линии HL-60, обработанных ретиноевой кислотой [3]. При изучении фактора HLDF был иден тифицирован его шестичленный фрагмент TGENHR (пептид HLDF-6), полностью воспроизводящий диф ференцирующую активность полноразмерного фак тора и обладающий широким спектром ноотропной и нейропротекторной активностей. На первичной культуре нейрональных клеток гиппокампа, моз жечка, а также иммунокомпетентных клеток полу чены прямые доказательства нейропротекторного эффекта пептида HLDF-6. Этот пептид проявляет антиапоптотическую активность, защищая клет ки от действия пептида бета-амилоида (βА), азида натрия, церамида, этанола, а также от холодового стресса и гипоксии. Пептид HLDF-6 повышает жиз неспособность ранних зародышей мышей в условиях in vitro [4-7]. Изучение действия пептида HLDF-6 на разных видах животных, проведенное с использованием различных экспериментальных моделей (водный лабиринт Морриса, модели пассивного избегания, отсроченного выбора положения, зоосоциального узнавания), показало, что центральное и системное введение пептида здоровым животным приводит к улучшению формирования и сохранения долговре менной памяти. На экспериментальных моделях кли нической патологии (БА и ИИ) показано, что пептид снижает выраженный когнитивный дефицит и спо собствует восстановлению нарушенной памяти [8, 9]. Введение HLDF-6 животным с хронической ишеми ей головного мозга обеспечивает достоверный ней ропротекторный эффект, защищая нейроны мозга от гибели в условиях ишемии [10]. Изучение фармакокинетики пептида HLDF-6 по казало, что пептид обладает чрезвычайно низкой устойчивостью в организме животных - период по лудеградации пептида в плазме крови крысы ра вен 2 мин. Гидролиз HLDF-6 происходит с С-конца, и основной вклад в него вносят дикарбоксипепти дазы [11]. Для защиты пептида от дикарбоксипеп тидаз использовали амидирование его С-концевой карбоксильной группы. Показано, что период полу деградации амидной формы (АФ) пептида HLDF-6 (TGENНR-NH2) в плазме крови крысы составляет 8 мин, что значительно выше, чем у нативной формы (НФ) пептида (TGENHR-ОH) [12]. С целью выбора наиболее эффективной формы пептида HLDF-6 для исследования ее в качестве фармацевтической субстанции (ФС) мы провели рас ширенное сравнительное изучение нейропротектор ной и ноотропной активности образцов ФС на осно ве АФ и НФ пептида HLDF-6 на животных моделях БА и ИИ. На первом этапе мы выявили нейропро текторную и ноотропную активность ФС на основе пептида HLDF-6 в моделях спорадической болезни Альцгеймера. Были использованы следующие мо дели: а) нарушение когнитивных функций при вве дении фрагмента (25-35) бета-амилоида в базальное гигантоклеточное ядро крыс Вистар; б) нарушение когнитивных функций при совместном введении фрагмента (25-35) бета-амилоида и иботеновой кислоты в гиппокамп крыс Вистар. Сравнительный анализ данных, полученных в обеих моделях БА, по казал, что нейропротекторная эффективность АФ пептида HLDF-6, оцениваемая по степени восстанов ления нарушенных когнитивных функций, значимо превышает эффективность НФ пептида. При ис пользовании АФ пептида HLDF-6 в дозе 250 мкг/кг (гораздо меньшей, чем доза препаратов сравнения) всегда наблюдалось практически полное восстанов ление функций [12]. В нашей работе представлены результаты из учения специфической активности ФС на основе АФ пептида HLDF-6 на трансгенной модели БА. Трансгенную модель использовали в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническо му изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия [13]. Болезнь Альцгеймера - нейродегенеративное заболевание, характеризующееся нарушением когнитивной функции и деменцией. Существуют наследственная и спорадическая формы БА. Наследственная форма передается по аутосомно доминантному типу. В 1991 году был идентифици рован первый ген, обусловливающий семейную ма нифестацию БА, - локализованный на хромосоме 21 мутантный ген белка АРР - предшественника βА [14]. Позднее были выявлены мутации других генов, повышающие риск развития БА. Наибольшим эффектом из продуктов этих генов обладал пресени лин-1 (ген которого расположен на хромосоме 14), ответственный за 70-80% случаев наследственной БА с ранним началом [15]. Создание трансгенных жи вотных позволяет моделировать молекулярные про цессы развития БА в течение всей жизни организма. Основное преимущество трансгенной модели состоит в том, что введение животным генов человека, отве чающих за развитие наследственной формы БА (ге нов АРР и пресенилина), приводит к развитию у них патогенетических процессов, сходных с проявления ми БА у человека (образование амилоидных бляшек, окислительный стресс, нарушение холинергической передачи, гибель нейронов). Это позволяет предпо ложить, что процессы, проходящие в ЦНС модель ных животных, сходны с процессами при развитии БА у человека. Для изучения потенциальных лекар ственных препаратов наиболее подходят так на зываемые дабл-трансгенные мыши линии B6C3- Tg(APPswe,PSEN1de91)85Dbo [16]. Животные этой линии экспрессируют мутантный пресенилин чело века и химерный амилоидный белок мышь/человек. Характерной особенностью этой линии является раннее (в возрасте 6-7 месяцев) развитие патологии альцгеймеровского типа, обусловленное ускоренным отложением в мозге бета-амилоидных образований, и нарушение когнитивных функций, оцениваемое в моделях пространственного обучения [17, 18]. Цель нашей работы состояла в изучении ней ропротекторной и ноотропной активности АФ пептида HLDF-6 на трансгенных мышах B6C3- Tg(APPswe,PSEN1de91)85Dbo - животной модели наследственной БА. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Синтез АФ пептида HLDF-6 АФ пептида синтезировали по схеме, описанной в [12]. Экспериментальные животные В работе использовали здоровых мышей-самцов линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo ( Tg+), мышей дикого типа В6С3 (Tg-) и мышей C57Bl/6. Мышей весом 28-35 г в возрасте 8 месяцев получа ли из питомника лабораторных животных Филиала Института биоорганической химии РАН, Пущино. Питомник имеет международную аккредитацию AAALACi. Система управления качеством производ ства лабораторных животных в Питомнике сертифи цирована на соответствие международным требова ниям ИСО 9001:2008. Все исследования на животных выполняли согласно Правилам лабораторной практи ки в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н г. Москва «Об утверждении Правил лабораторной практики»), а также рекомендациям, изложенным в «Руководстве по проведению доклинических ис следований лекарственных средств» [13]. Были сформированы четыре группы мышей (по 10 особей в каждой): группа 1 (экспериментальная) - мыши Tg+, которым интраназально вводили ФС в дозе 250 мкг/кг; группа 2 (активный контроль) - мыши Tg+, которым интраназально вводили физиологический раствор; группа 3 (контроль-1) - мыши Tg-, которым интраназально вводили физиологический раствор; группа 4 (контроль-2) - мыши линии С57Bl/6, кото рым интраназально вводили физиологический рас твор. Введение дополнительной контрольной группы обусловлено тем, что использовали несколько моде лей когнитивных функций. Анализ опубликованных данных показывает, что особенности обучения и па мяти у мышей B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo изучали преимущественно в моделях пространствен ного обучения, тогда как другие когнитивные моде ли были исследованы недостаточно [18, 19]. Данные, полученные с использованием пространственного обучения, свидетельствуют, что различия между линиями B6C3-Tg+ и B6C3-Tg- наиболее выраже ны в моделях с высоким уровнем стресса (например, в лабиринте Морриса, но не в лабиринте Барнс) [20]. В то же время различия между В6С3-Tg+ и В6С3- Tg- выявлены преимущественно в моделях с поло жительным, а не с отрицательным подкреплением [21]. Когнитивные способности мышей В6С3-Tg- так же не охарактеризованы в достаточной мере. В связи с этим для оценки обоснованности эксперименталь ных протоколов мы сочли целесообразным ввести группу дополнительного контроля - мышей линии С57Bl с достаточно высоким уровнем ориентировоч но-исследовательской активности и стрессоустой чивости [22], и с уровнем когнитивных способностей, близким к среднестатистическому [23]. Мы не использовали препарат сравнения, посколь ку действие клинически эффективных препаратов (мемантина, донепезила и др.) в этой модели нахо дится на стадии пилотных исследований и не охарак теризовано в достаточной степени [24, 25]. Протокол введения ФС и тестирования когнитивных функций Животным группы 1 в течение 30 дней через день (всего 15 инъекций) вводили АФ пептида в дозе 250 мкг/кг интраназально в объеме 10 мкл/кг поровну в обе ноздри, а животным групп 2-4 вводили физио логический раствор по такой же схеме. Когнитивные функции оценивали после окончания инъекций по следующей схеме: 3-5 дни - тест распознавания объекта; 8-10 дни - тест пассивного избегания; 13-17 дни - тестирование в лабиринте Морриса. Тест распознавания нового объекта Тест распознавания нового объекта проводили при комнатном освещении в камере из серого пласти ка размером 35 × 35 × 40 см. Тест включал три пяти минутные сессии, разделенные интервалом 24 ч: 1 - без объектов, для адаптации к установке; 2 - с двумя одинаковыми объектами - металлическими цилин драми диаметром 3 см и высотой 3 см; 3 - с заменой одного из цилиндров на пластиковый куб с длиной ребра 3 см. Поведение животных регистрировали с помощью цифровой видеокамеры и анализирова ли, используя компьютерную программу EthoVision XT (Noldus). Оценивали уровень ориентировочно исследовательской активности при ознакомлении с предметами (сессия 2), а также время исследо вания «знакомого» и «нового» предметов в сессии 3. Индекс распознавания вычисляли по формуле: (Тн - Тз / Тн + Тз) × 100%, где Тн - время исследо вания «нового» объекта, а Тз - время исследования «знакомого» объекта во время третьей сессии [26-28]. Тест пассивного избегания Тест пассивного избегания проводили в установке Columbus Instruments (США). Экспериментальная камера состояла из двух одинаковых отсеков разме ром 25 × 40 × 25 см с полом из металлических пру тьев. Отсеки соединялись между собой отверстием в общей стенке (8 × 8 см), снабженным гильотинной дверью. Один из отсеков был освещен, другой затем нен. В ходе выработки пассивного избегания живот ное помещали в освещенный отсек и регистрировали время перехода в темную часть камеры (проявление норкового рефлекса). Сразу после того, как все четы ре лапы животного оказывались в темной половине камеры, гильотинная дверь опускалась и мышь по вергали электрокожному раздражению через пру тья пола (0.6 мА, 3 с), после чего ее сразу вынимали из камеры и помещали в домашнюю клетку. Через 48 ч после выработки тестировали выработанный на вык. Мышь вновь помещали в светлый отсек, и фик сировали время перехода в темную половину [29-31]. Лабиринт Морриса Лабиринт Морриса представлял собой круглый бас сейн серого цвета диаметром 165 см с высотой стенок 60 см, наполненный водой на высоту 40 см. В центре одного из секторов на 2 см ниже уровня воды распо лагалась круглая платформа из плексигласа диаме тром 9 см. Бассейн находился в комнате с большим количеством обстановочных стимулов (постеры, шкафы и т.д.), ключевые стимулы над платформой отсутствовали. В ходе обучения животных опускали в воду с четырех разных точек и фиксировали время достижения платформы. После достижения плат формы животное оставляли на ней на 15 с, а затем на 2 мин возвращали в домашнюю клетку. Обучение проводили в течение 5 дней [18]. Статистическая обработка данных Статистическую обработку результатов проводи ли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Обработку проводили при помощи программного пакета STATISTICA 6.0. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Модель распознавания нового объекта Исследование объектов в сеансе экспозиции (та блица) не выявило значимых отличий в уровне ори ентировочно-исследовательской активности между контрольными группами Tg- и C57Bl/6. В то же вре мя у животных группы активного контроля (Tg+ с введением физиологического раствора) исследо вательская активность была статистически значимо ниже, чем у мышей группы Tg-. Животные экспе риментальной группы не отличались существенно ни от группы активного контроля, ни от мышей Tg-. Выявлены достаточно высокие значения индекса распознавания объекта, характеризующего деклара тивную долговременную память, связанную с функ циями периринальной коры (участка средней височ ной извилины), у мышей группы C57Bl/6, сравнимые с опубликованными данными [32]. Обнаружено сни жение индекса распознавания у животных кон трольной группы Tg- по сравнению с мышами груп пы C57Bl/6, а также у мышей из группы активного контроля по сравнению с контрольными мышами Tg-. Введение ФС пептида восстанавливало индекс рас познавания до уровня, превышающего значения не только в активном контроле, но и в группе Tg- (рис. 1). Модель пассивного избегания Не выявлено статистически значимых межгруппо вых различий в длительности латентного периода перехода в темный отсек в день обучения до подачи электрокожного раздражения. В то же время обнаружены существенные меж групповые различия по увеличению времени пере хода в темный отсек в день тестирования, который характеризует долговременную память (рис. 2). Сравнение показателей возрастания времени перехода в темный отсек в день тестирования (ха рактеризующего долговременную память) не выяви ло статистически значимых различий между кон трольными группами C57Bl/6 и Tg-, а также между активным контролем и группой Tg-. Животные, по лучавшие ФС, существенно превосходили группу ак тивного контроля и на уровне тенденции (p = 0.062) превосходили группу Tg-. Пространственная память в лабиринте Морриса Показателем долговременной памяти в данной мо дели служит среднее время достижения платфор мы на 2-5 дни обучения. Результаты представлены на рис. 3. Тест Манна-Уитни не выявил статистически значимых различий между контрольными груп пами (C57Bl/6 и Tg-) ни в один из дней обучения. Животные Tg+, получавшие физиологический рас твор, имели существенный дефицит пространствен ной памяти в 4-й и 5-й дни обучения по сравнению с группой Tg-. Введение ФС приводило к частичному восстановлению пространственной памяти у мышей Tg+. На 4-й день обучения уровень выполнения на выка у животных этой группы занимал промежу точное положение между животными группы Tg+, получавшими физиологический раствор, и живот ными Tg-. В 5-й день обучения мыши Tg+, получав шие ФС, выполняли задачу существенно лучше, чем группа Tg+ с введением физиологического раствора и не отличались значимо от контрольной группы Tg-. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные результаты свиде тельствуют, что в условиях интраназальной до ставки ФС на основе АФ пептида HLDF-6 в дозе 250 мкг/кг эффективно стимулирует выполнение когнитивных задач трансгенными мышами B6C3- Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo во всех использован ных моделях. Следует отметить, что результаты, полученные в дополнительной контрольной группе мышей C57Bl/6, подтверждают валидность исполь зованных моделей когнитивных функций. При этом в модели обстановочного пространственного обуче ния (лабиринт Морриса) динамика обучения кон трольной группы Tg- не отличалась от динамики у мышей C57Bl/6. В группе активного контроля вы явлено снижение динамики обучения по сравнению с Tg-, а введение ФС оказывало выраженный нейро протекторный эффект с восстановлением показате лей обучения до контрольного уровня. В модели распознавания объекта отмечено суще ственное снижение показателей обучения в группе Tg- относительно C57Bl/6 и (несколько менее выра женное) в группе активного контроля относительно Tg-; при этом введение ФС приводило к повышению показателя обучения до уровня, превосходящего Tg-. В модели пассивного избегания также наблюда лось снижение показателей обучения в группе Tg относительно C57Bl/6. Однако, в отличие от других тестов, не обнаружено ухудшения обучения живот ных группы активного контроля в сравнении с Tg-. Введение ФС так же, как и в других моделях, сти мулировало долговременную память у трансгенных мышей до уровня, даже несколько превышающего контрольный. Совокупность полученных данных свидетельству ет, что ФС на основе АФ пептида HLDF-6 обладает не только нейропротекторными свойствами, но и но отропным эффектом, т.е. стимулирует когнитивные функции вне зависимости от наличия нейродегене ративного процесса. Результаты нашей работы полностью согласуют ся с данными, полученными на животных моделях БА - фрагмент βА (25-35) вводили в базальное ги гантоклеточное ядро Мейнерта, фрагмент βА и ибо теновую кислоту совместно вводили в гиппокамп [12]. По совокупности полученных результатов в качестве объекта дальнейших доклинических исследований мы выбрали ФС на основе АФ пептида HLDF-6, за эффективную терапевтическую дозу приняли 250 мкг/кг и интраназальное введение в качестве способа доставки. Ранее методом радиорецепторного анализа мы провели изучение участия серотониновых, ГАМК и NMDA-глутаматных рецепторов мозга в ноотроп ном действии АФ пептида HLDF-6. Эти рецепторы участвуют в патогенезе различных неврологических расстройств и хронических нейродегенеративных заболеваний [33, 34]. Было изучено влияние АФ пеп тида HLDF-6 на характеристики связывания радио активно меченных лигандов с NMDA-рецепторами на мембранах гиппокампа, ГАМК-А и серотонино выми 5НТ2А-рецепторами на мембранах префрон тальной коры мышей BALB/c. Показано, что только в случае NMDA-глутаматных рецепторов субхрони ческое введение пептида в гиппокамп мышей приво дит к возрастанию количества связавшегося лиганда (G-3Н МК-801) [11], что отражает плотность соот ветствующих рецепторов. Таким образом, под воз действием АФ пептида HLDF-6 происходит восста новление до нормы количества NMDA-рецепторов, что вызывает улучшение когнитивного поведения. Субхроническое 5-разовое введение АФ пептида HLDF-6 не влияло на плотность ГАМК-рецепторов и никотиновых холинорецепторов, но сопровожда лось снижением плотности 5-HT2-серотониновых рецепторов [35]. Сделан вывод, что механизм фор мирования нейропротекторной активности пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH2 может включать воз действие на глутамат- и серотонинергическую си стемы. Пептид HLDF-6 является фрагментом природ ного фактора дифференцировки HLDF-6, присутствующего в крови и ЦНС млекопитающих и чело века. Проведенные нами доклинические испытания лекарственного средства на основе АФ пептида HLDF-6 показали, что оно хорошо растворимо, лег ко метаболизируется, не обладает иммуногенностью и токсичностью, характеризуется высокой эффек тивностью специфической активности, безопасно в дозе, в 10 раз превышающей терапевтическую. Результаты доклинических исследований позволя ют надеяться на успешное проведение клинических исследований препарата. Можно рассчитывать, что в этом случае препарат найдет широкое приме нение в терапии БА.

Об авторах

A. П. Бoгачук

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: apbog@mx.idch.ru
Россия

З. И. Сторожева

Федеральный медицинский исследовательский центр наркологии и психиатрии им. В.П. Сербского Минздрава России

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

Г. Б. Телегин

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

A. С. Чернов

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

A. T. Прошин

Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАН

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

В. В. Шерстнев

Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАН

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

Ю. A. Золотарев

Институт молекулярной генетики РАН

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

В. M. Липкин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: apbog@mx.ibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы