Высокопродуктивная линия-продуцент фактора свертывания крови IX человека на основе клеток CHO

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Фактор IX (FIX) - это профермент сериновой протеазы каскада свертывания крови, которая в присутствии Са2+ и мембранных фосфолипидов гидролизует связь аргинин-изолейцин в молекуле фактора X с образованием активированного фактора Х (FХа). Нековалентный комплекс факторов IXа, VIIIa и X, связанных с фосфолипидной мембраной - «теназа» - является основным элементом петли положительной обратной связи каскада свертывания крови. Ген FIX расположен на Х-хромосоме. Врожденное отсутствие или низкий уровень функционально активного фактора IX приводят к развитию гемофилии В, X-связанному рецессивному генетическому заболеванию, встречающемуся приблизительно у одного из 30 тысяч мужчин. В частности, гемофилия королевских семей Европы - Royal family disease, обусловлена точечной мутацией гена FIX, приводящей к нарушению сплайсинга его мРНК и появлению не активного укороченного белка FIX [1]. Первоначально терапия гемофилии В ограничивалась периодическими переливаниями плазмы крови, впоследствии замененными на концентраты протромбинового комплекса - смеси витамин К-зависимых факторов свертывания крови IX, II, VII и X. Основным ограничением такой терапии был риск развития тромбоза. При фракционировании плазмы крови методом Кона получены лекарственные препараты FIX с большей степенью чистоты, содержавшие, однако, примеси активированного FIX (FIXa) и других факторов свертывания, таким образом, риск тромботических эпизодов сохранялся. Дополнительная иммуноаффинная очистка FIX позволила полностью удалять эти примеси, но, как и в случае других продуктов переработки плаз мы крови, не устраняла угрозу вирусного или прионного заражения. Препараты природного FIX, по лученные путем очистки на иммобилизованных моноклональных антителах мыши, также могут вызывать аллергические реакции на иммуноглобулин мыши и потенциально способствовать появлению нейтрализующих FIX антител, т.е. ингибиторной формы гемофилии B [2]. Клонирование кДНК FIX [3] и первые успешные попытки получения рекомбинантного FIX в гетеро логичных системах [4, 5] были проведены в 1980-1985 гг. В 1986 г. на основе линии СHO получили продуцент FIX с достаточно высокой удельной продуктивностью [6]. Лекарственный препарат рекомбинантного FIX - нонаког альфа (торговое название Бенефикс) - одобрен к применению в США и странах ЕС в 1997 г. В процессе получения лекарственного препарата исключено использование веществ животного происхождения и компонентов донорской плазмы. Нонаког альфа получают в клетках CHO, культивируемых в питательной среде, не содержа щей сыворотки или других продуктов животного происхождения. Выделение и очистку FIX проводят в четыре хроматографические стадии, не используя иммуноаффинную хроматографию, потенциально присутствующие вирусы удаляют при помощи нано фильтрации на фильтре с порогом отсечения 70 кДа. В готовой лекарственной форме нонакога альфа не используется альбумин человека [7]. Циркулирующий зрелый FIX имеет молекулярную массу около 57 кДа и среднюю концентрацию в плазме крови около 90 нМ. FIX состоит из четырех структурных доменов - Gla-домена, двух ЭФР-подобных доменов (ЭФР - эпидермальный фактор роста) и C-концевого домена сериновой протеазы. N-Концевой лидерный пептид FIX отделяется при транслокации полипептида в эндоплазматиче ский ретикулум; пропептид, непосредственно пред шествующий Gla-домену, отделяется при секреции зрелого белка. Активационный пептид, расположенный между вторым ЭФР-подобным доменом и доменом сериновой протеазы, отделяется при активации FIX. Активация FIX в каскаде свертывания крови осуществляется активированным фактором XI (внутренний путь) или активированным фактором VII (внешний путь). Содержащий 12 γ-карбоксилированных остатков Glu Gla-домен расположен на N-конце молекулы зрелого FIX. Он обеспечивает связывание FIX и FIXa с поверхностью эндотелиальных клеток [8]. Первый ЭФР-подобный домен FIX содержит высокоаффинный сайт связывания иона кальция, а так же обуславливает взаимодействие FIX с фактором VIIIa и с тканевым фактором (фактором III). Второй ЭФР-подобный домен FIX принимает участие в образовании комплекса FIXa-FVIIIa-FX. Он соединяется с доменом сериновой протеазы при помощи активационного пептида и единственной дисульфидной связи. Активационный пептид FIX содержит большую часть сайтов посттрансляционных модификаций, влияющих на свойства FIX, в том числе N-связанные олигосахариды [9]. Вследствие этого единственным существенным отличием рекомбинантного FIXa, полученного в клетках CHO, от природного FIXa, является уровень β-гидроксилирования остатка Asp64, составляющий в природном FIX 0.24 моль/моль, а в рекомбинантном - 0.4 моль/моль [8]. Блокирование этой посттрансляционной модификации при помощи ингибиторов 2-кетоглутарат-диоксигеназы не приводило к существенному изменению прокоагуляционной активности FIX. С-Концевой домен сериновой протеазы составляет около половины общей массы FIX, содержащийся в нем активный сайт скрыт активационным пептидом и экспонируется после его отделения. Из всех посттрансляционных модификаций только γ-карбоксилирование в домене Gla непосредствен но определяет прокоагуляционную активность FIX. Тем не менее рекомбинантный FIX, полученный в клетках CHO, имеет одно существенное отличие от природного FIX в качестве лекарственного средства - уровень восстановления прокоагуляционной активности FIX in vivo у пациентов при инфузии препаратов рекомбинантного FIX в среднем в 1.29 раза ниже, чем в случае природного концентрата FIX человека [10]. Причины, вызывающие меньшее восстановление прокоагуляционной активности у ре комбинантного FIX, остаются неясными, поскольку сравнительные клинические исследования фармакокинетики препаратов FIX показывают несколько больший период полувыведения рекомбинантного FIX: 36 ч у рекомбинантного FIX против 32.7 ч у при родного FIX [11]. Возможной причиной пониженного восстановления активности рекомбинантного FIX in vivo может быть отсутствие сульфатирования Tyr158 и/или фосфорилирования Ser155 в составе активационного пептида, однако доказательства в пользу этой гипотезы получены только на животных моделях гемофилии B [12]. Во многих случаях продуктивность систем гетеро логичной экспрессии гена FIX человека определялась не уровнем биосинтеза собственно FIX, а способностью клетки-хозяина осуществлять его корректную посттрансляционную модификацию. В частности, значительная доля секретируемого FIX, продуцируемого в клетках CHO, неактивна при практически любом уровне удельной продуктивности, так как со держит непроцессированный пропептид, полностью блокирующий функционирование Gla-домена. Восстановление нормального процессинга пропептида FIX возможно при коэкспреcсии субтилизин/кексин-подобной конвертазы PACE/furin или гомо логичной ей конвертазы PC5. Наилучший уровень удаления пропептида у секретированного FIX может быть достигнут при коэкспрессии укороченного варианта PACE/furin человека, также секретируемого в культуральную среду. Таким образом, удаление пропептида может происходить не только в аппарате Гольджи, но и во внеклеточном пространстве [7]. Активность FIX также определяется уровнем γ-карбоксилирования остатков Glu в Gla-домене. В полностью активном FIX первые 10 остатков Glu из 12 должны быть конвертированы в остатки Gla. В молекуле природного FIX все 12 остатков Glu в Gla-домене полностью γ-карбоксилированы, а в препаратах рекомбинантного FIX уровень модификации двух последних остатков снижен, что не влияет на свойства FIX. Следует отметить, что стандартный метод очистки рекомбинантного FIX при помощи анионообменной хроматографии с элюцией раствором CaCl2 при низкой ионной силе позволяет эффективно удалять молекулы FIX с не функциональным Gla-доменом, поэтому недостаточный уровень γ-карбоксилирования FIX влияет скорее на выход готового продукта, чем на удельную прокоагуляционную активность очищенного FIX. Общее число остатков Gla в очищенном рекомбинантном FIX из клеток CHO достигает 11.5 на одну молекулу белка, а удельная прокоагуляционная активность составляет не менее 200 МЕ/мг, что не от личается от удельной активности природного белка. Реакцию γ-карбоксилирования остатков Glu в мо лекулах витамин К-зависимых белков осуществляет витамин К-зависимая γ-глутаминкарбоксилаза (GGCX [КФ 4.1.1.90]) [13], реакция происходит в про свете эндоплазматического ретикулума и предшествует транслокации пробелков в аппарат Гольджи. Источником присоединяемой карбоксильной группы служит растворенный углекислый газ, а донором электронов и кофактором GGCX - восстановленная дигидрохиноновая форма витамина K (KH2), превращающаяся при прохождении реакции в 2,3-эпоксид хинона (K>O). Реакция γ-карбоксилирования требует постоянного поддержания существенной концентрации KH2 в просвете эндоплазматического ретикулума. Восстановление K>O до KH2 в клетках позвоночных катализируется ферментным комплексом VKOR, или VKORC (vitamin K oxidoreductase complex), основным компонентом которого является интегральный белок - субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксид-редуктазы витамина К (VKORC1 [КФ 1.1.4.1]) [14]. При попытках сверхэкспрессии в клетках CHO гена фактора свертывания крови VII человека (FVII), витамин К-зависимого белка, Gla-домен которого функционален только при полном γ-карбоксилировании всех 12 остатков Glu, установлено, что доля функционально активных молекул FVII очень низка и сверхэкспрессия GGCX не при водит к повышению удельной активности FVII. Одновременно с этим сверхэкспрессия гена FVII в клетках линий HepG2 (клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека) и BHK (клетки почки сирийского хомяка) позволяет получать преимущественно функционально активный белок. Причиной различий в способности клеток разных линий обеспечивать прохождение реакции γ-карбоксилирования является различный уровень активности комплекса VKOR. Сверхэкспрессия гена VKORC1 человека в клетках линии CHO позволяет получить функционально активный продукт и существенно повысить скорость секреции фактора VII [15]. Сходные данные получены для FIX, секретируемого клетками линии BHK [16]. В системах экспрессии фактора IX в клетках CHO, лимитированных уровнем процессинга пропептида целевого белка, уровень γ-карбоксилирования, обеспечиваемый эндогенным ферментом VKORC1, был достаточен для получения фактора IX с полной функциональной активностью [7]. Тем не менее при существенном увеличении уровня экспрессии гена FIX степень γ-карбоксилирования остатков Glu в Gla-домене может существенно снизиться, на что указывают сильные различия в уровне секреции FIX клетками линии HepG2 (трансформированные гепатоциты) и линиями клеток, полученных из других тканей [17]. Клетки HepG2 обладают высокой активностью VKORС1 и соответственно секретируют FIX более эффективно. Обычным способом увеличения витамин К-оксидоредуктазной активности в культивируемых клетках считается их трансфекция плазмидой, кодирующей известный ген VKORC1 человека. Однако относительная каталитическая эффективность этого метода в клетках других видов млекопитающих не очевидна. Ортологи VKORC1 разных видов млекопитающих не полностью гомологичны друг другу, и их каталитическая эффективность in vitro различается примерно в 4 раза [18]. В настоящий момент белковый состав комплекса VKOR не установлен. Наиболее вероятным источником электронов для работы VKORC1 считают тиоредоксин-подобные белки эндоплазматического люмена, в том числе TMX [19]. Мембранная топология VKORC1 установлена только по аналогии с бактериальным белком из Synechococcussp. Пространственная цепь переноса электронов к цистеинам активного центра VKORC1 пока не описана, в отличие от его гомолога VKORC1L1 [20]. Мы предположили, что низкая активность комплекса VKOR в клетках линии CHO может быть вы звана не низкой каталитической эффективностью собственного VKORC1 китайского хомячка, а лишь недостаточным уровнем его экспрессии. Таким об разом, требуемый максимальный уровень секреции FIX человека в клетках CHO может быть обеспечен путем коэкспрессии целевого гена, растворимого варианта PACE/furin человека и VKORC1 китайского хомячка. При этом необходимый уровень экспрессии вспомогательных генов может быть определен путем отбора клональных линий клеток-продуцентов по доле коагуляционно активных молекул FIX с уда ленным пропептидом. Получение и характеристика таких линий-продуцентов FIX являются целью на стоящей работы. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Создание генетических конструкций для экспрессии генов Создание экспрессионных векторов p1.1, p1.2-Zeo и p1.2-Hyg описано в работе [21]. Фрагменты ДНК, кодирующие целевые открытые рамки считывания (ОРС) генов FIX человека, VKORC1 человека или китайского хомячка, или фурин человека, слитые с консенсусной последовательностью Козак (GCCGCCATGG) [22], получали методом ПЦР с использованием соответствующих адапторных праймерных олигонуклеотидов. Продукты ПЦР выделя ли из 1% агарозного геля, используя набор реактивов Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США), и легировали с Т-вектором PAL-TA («Евроген», Москва) при помощи ДНК-лигазы фага T4 (Fermentas, Литва). ПЦР проводили с использованием олигонуклеотидов и смесей для ПЦР Encyclo PCR kit, Tersus polymerase mix, ScreenMix-HS («Евроген») на приборе PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research, США). Молекулярное клонирование про водили в штамме Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, США). Плазмидную ДНК выделяли при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas,Литва). В качестве источника ОРС FIX использовали коммерчески доступный клон кДНК FIX человека pCMV6-XL4/NM_000133.2 (sc126517, Origene, США) и адапторные праймеры AD-9-AbsF и AD-9-NheR, приведенные в табл. 1. Область ОРС VKORC1 человека амплифицировали с плазмиды pCMV6-XL4/NM_024006.4 (sc112318, Origene) с праймерами ADhVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR. С целью получения ОРС VKORC1 китайского хомячка из 2 млн клеток CHO DG44 реагентом TRI Reagent (MRC) выделяли суммарную РНК. кДНК синтезировали при помощи набора MINT («Евроген»), используя 2 мкг РНК-матрицы. Амплификацию кДНК проводили с помощью набора Encyclo PCR Kit, для ПЦР области ОРС использовали прайме ры vkof1, vkof2, vkor1. Продукт ПЦР клонировали в вектор pAL-TA с получением плазмиды pALCHOVKORC1. Нуклеотидная последовательность вставки была депонирована 03.04.2012 в GenBank под номером JQ400047.1. Аминокислотная последовательность ОРС фермента VKORC1 клеток CHO DG44 депонирована в GenBank (03-APR-2012) под номером AFG26681.1. При помощи адапторных праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR и плазмиды pAL-CHOVKORC1 в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 китайского хомячка с добавленными сайтами рестрикции для субклонирования в экспрессионный вектор. ОРС PACE/furin человека получали путем ПЦР с использованием праймеров AD-FUR-AbsF и AD-FUR-XbaR и плазмиды SC118550 (Origene) в качестве матрицы. ПЦР-продукт, содержащий ОРС растворимого делеционного варианта протеазы PACE/furin человека с делецией двух аминокислот (VQ), клонировали в вектор pAL-TA с образованием плазмиды pAL-Fur, после чего приводили ОРС в соответствие с эталонной последовательностью NM_002569, вводя шесть недостающих нуклеотидов методом инвертированной ПЦР c использованием праймеров IP-fVQ-F и IP-fVQ-R. Мутагенез проводили согласно [23] со следующими модификациями: праймеры фосфорилировали полинуклеотидкиназой фага Т4 («Сибэнзим») в буфере для ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas) в течение 30 мин при 37°С. ПЦР проводили с помощью набора Encyclo PCR kit по сле дующей схеме: 1 цикл - 4 мин, 94°C, 2 мин, 50°C, 2 мин, 72°C; затем 11 циклов - 1 мин, 94°C, 1 мин, 55°C, 2 мин, 72°C; разводили вдвое однократным буфером для эндонуклеазы DpnI, добавляли 10 ед. акт. этой эндонуклеазы и инкубировали при 37°C в течение 30 мин, затем инкубировали при 72°C с 2.5 ед. акт. полимеразы Pfu еще 30 мин, продукт ПЦР очищали и лигировали. Для поиска измененных участков ДНК методом ПЦР с колоний использовали специфический олигонуклеотид SQ-fVQ-R. Полученные плазмиды pAL-F9, pAL-hVKORC1-AN, pAL-CHOVKORC1-AN, pAL-FurVQ секвенировали в области вставки, правильные ОРС встра ивали в экспрессионные векторы p1.1, p1.2-Zeo или p1.2-Hyg по AbsI-NheI-сайтам. ДНК для транс фекции выделяли с помощью препаративного набора EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen, США) или ДНК GeneJet™ Midi (Fermentas). Перед трансфекцией секвенировали основные функциональные эле менты векторов и повторно области целевых ОРС. Плазмиды линеаризовали эндонуклеазами PvuI (p1.1 и p1.2-Zeo) или BspHI (p1.2-Hygro), осаждали этанолом, растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS) и стерилизовали фильтрацией через 0.22-мкМ фильтры (Millipore, США). Культивирование клеток CHO DG44 (Invitrogen) и трансфекцию плазмидой p1.1-F9 проводили как описано в [21]. Через 48 ч после трансфекции клетки помещали в селекционную среду CD CHO (Invitrogen) с 200 нМ метотрексата (MTX) и 8 мМ глутамина и культивировали до восстановления жизнеспособности клеток выше 85% (около 20 дней), пассируя 1 раз в 3-4 дня. Полученную популяцию клеток клонировали методом предельных разведений (1 клетка на лунку) в среде EX-CELL® CHO Cloning Medium (Sigma-Aldrich) с добавлением 8 мМ глутамина и без МТХ. Продуктивные клоны определяли методом ИФА, отобранные клоны последовательно переносили в 24-луночные планшеты, за тем в 6-луночные планшеты с культуральной средой ProCHO 5 (Lonza, Швейцария) с 8 мМ глутамина и переводили в суспензионный режим культивирования. Среди клональных культур, не потерявших жизнеспособность в условиях суспензионного культивирования, с помощью ИФА отбирали наиболее продуктивные. Для дальнейшей амплификации использовали клон p1.1-F9-T2/S. Амплификацию проводили в колбах Эрленмейера с 30 мл среды ProCHO с 8 мМ глутамина с добавлением 1, 2, 4 мкМ MTX до восстановления жизнеспособности клеток выше 85% в течение 15-20 дней. Полученную в присутствии 4 мкМ MTX культуру клеток с наибольшей удельной продуктивностью использовали во втором клонировании методом пре дельных разведений. Отобрали клон 3B12, который реадаптировали для суспензионного культивирования в среде ProCHO 5 и использовали для последовательной котрансфекции линеаризованных плазмид p1.2-Hyg-Fur и p1.2-Zeo-VKORC. Селекцию стабильно трансфицированных популяций проводили при помощи антибиотиков гигромицина Б и зеоцина соответственно. Поликлональную популяцию 3B12-FurVC использовали для окончательного клонирования методом предельных разведений как описано выше. Полученные клоны были последовательно раз делены на группы по уровню экспрессии растворимого PACE/furin и уровню прокоагуляционно активного FIX. Отобранные клоны повторно адаптировали к среде ProCHO 5 с 8 мМ глутамина и 1 мкМ витами на K3 (менадионсульфат, Sigma-Aldrich) и суспензионному культивированию в колбах Эрленмейера. ПЦР в реальном времени ПЦР-РВ проводили с использованием амплификатора iCycler iQ (Bio-Rad, США) и готовой реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR («Евроген»), содержащей интеркалирующий краситель SYBR Green I. Каждую реакцию повторяли 3 раза в объеме 25 мкл, в 3-5 по вторах. Геномную ДНК выделяли при помощи на бора Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega). Суммарную РНК выделяли при помощи набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). Для получения необходимых количеств кДНК использовали по 1 мкг суммарной РНК и набор реактивов Mint («Евроген»). Праймеры для ПЦР-РВ подбирали при помощи программы Beacon Designer v7.51, проверяли на специфичность при помощи NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Использовали праймеры, негомологичные последо вательностям китайского хомячка (к области FIX и IRES-DHFR). Данные ПЦР-РВ обрабатывали, используя программу iCycler Iq4, включая расчет эффективности реакций. Число копий вставки экспрессионной кассеты в геноме рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для серийных разведений плазмиды p.1.1-F9. Результаты ПЦР сравнивали с результатами для контрольного ампликона из состава гена PPIB, представленного в геноме клеток CHO только 1 раз, по поисковой выдаче алгоритма BLAST из базы данных NCBI Nucleotide Collection. Уровень экспрессии мРНК рассчитывали с использованием относительного метода ΔΔCq для праймеров с известной эффективностью ПЦР. Относительное увеличение уровня (разы) экспрессии гена, нормированного по контрольному гену, определяли по формуле из [24]. Праймеры для оценки копийности экспрессионной кассеты в геноме и уровня мРНК приведены в табл. 2. Саузерн-блот гибридизация Биотиновую метку вводили в ДНК при помощи на бора Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Fermentas). В качестве матрицы для получения зондов использовали плазмиду pAL-ID, содержащую общие с экспрессионными плазмидами p1.1 области начала репликации гена бета-лактамазы, EMCV IRES, ОРС DHFR [21], либо продукт амплификации плазмиды p1.1-F9 с праймеров AD-9-AbsF и AD-9-NheR, соответствующий ОРС FIX. Геномную ДНК для блотинга расщепляли эндонуклеазой ApaI в течение 16 ч и разделяли в 0.8% агарозном геле. Подготовку геля и перенос на мембрану Amersham Hybond-N+ (GE Healthcare, США) проводили по протоколу производителя мембраны в буфере с высокой ионной силой 20 × SSC (3 М NaCl, 0.3 М цитрат натрия) в течение 16 ч. ДНК фиксировали нагреванием мембраны до 80оС в течение 2 ч. Прегибридизацию и гибриди зацию проводили по [25] в растворе 7% додецилсульфата натрия, 0.5 M фосфата натрия, pH 7.2, 1% бы чьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 16 ч при 65оС. Мембрану промывали по протоколу производителя, детекцию проводили при помощи набора Biotin Chromogenic Detection Kit (Fermentas). Измерение концентрации FIХ методом ИФА Концентрацию FIX определяли по [26] с использо ванием в качестве иммобилизованного антитела по ликлональные антитела кролика к FIX (LifeSpan BioSciences, США) по 50 нг/лунку. В качестве специфичного антитела использовали моноклональные антитела мыши HIX-1 (F2645, Sigma-Aldrich). Образцы вносили в лунки без разведения или разводили в PBS с 1% БСА. Долю молекул FIX с неотделенным про пептидом определяли при помощи ИФА, используя в качестве иммобилизованных антител аффин но очищенные антитела кролика к синтетическому пептиду, соответствующему пропептиду FIX чело века, согласно [27]. Остальные шаги ИФА проводили как указано выше. Прокоагуляционную активность FIX определяли методом активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) при помощи «фак тор IX-тест» производства НПО «Ренам» (Москва). В качестве стандарта активности использовали рекомбинантный FIX в составе лекарственного средства Benefix (Wyeth, США). Измерения про водили при помощи оптического коагулометра ThromboScreen 400c (Pacific Hemostasis, США). Измерение активности фурина Активность фурина определяли при помощи пептидного субстрата с отделяемой группой 7-амино-4 метилкумарина Pyr-Arg-Thr-Lys-Arg-AMC (344935, Merck Millipore, США) по [27]. Измерение активности VKORC1 Активность VKORC1 измеряли с использованием DTT в качестве донора электронов по методике [28]. Субстрат ферментативной реакции - 2,3-эпоксид витамина K1 (K > O) - синтезировали и очищали из хи ноновой формы витамина K1 (Sigma Aldrich, США) [29]. Выделение и очистка FIX FIX выделяли и очищали по следующей методике: культуральную среду наносили на колонку с сорбентом Capto MMC, уравновешенную раствором 20 мМ цитрата натрия, pH 7.0, 100 мМ NaCl, 0.02% Твин-80, промывали раствором 20 мМ цитрата натрия, pH 7.0, 0.1 М NaCl. FIX элюировали раствором 20 мМ цитра та натрия, pH 6.5, 200 мМ NaCl, 0.5 М аргинина, 0.02% Твин-80. Элюат разбавляли в 4 раза водой и наносили на колонку с сорбентом Capto Q, уравновешен ную раствором 50 мМ Tris-HCl pH 8.0; 100 мМ NaCl; промывали раствором 50 мМ Tris-HCl pH 8.0; 200 мМ NaCl и проводили ступенчатую элюцию растворами 50 мМ Tris-HCl pH 8.0; 10 мМ CaCl2, 100-500 мМ NaCl. Фракции элюата, содержащие FIX с полной прокоагуляционной активностью, разбавляли водой в 2 раза и наносили на колонку с сорбентом Capto Heparin, уравновешенную раствором 50 мМ Tris-HCl pH 7.5; 100 мМ NaCl, промывали колонку раствором 50 мМ Tris-HCl pH 7.5; 200 мМ NaCl. FIX элюировали раствором 50 мМ Tris-HCl pH 7.5; 500 мМ NaCl. Раствор очищенного FIX концентрировали ультрафильтрацией при помощи кассеты VivaFlow200 10 кДa PES (Sartorius Stedim, Германия) и переводили в раствор хранения, содержащий 8 мМ L-гистидина, 0.8% са харозы, 208 мМ глицина, pH 7.2 и 0.004% Твин-80. Раствор очищенного FIX разделяли на аликвоты, за мораживали и хранили при температуре ниже -70oC. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение линии клеток CHO, экспрессирующих ген фактора IX человека Область открытой рамки считывания FIX с добавленной синтетической консенсусной последователь ностью Козак и блоком стоп-кодонов клонировали в ранее разработанный нами экспрессионный вектор p1.1 на основе некодирующих областей гена фактора элонгации трансляции 1альфа китайского хомячка с образованием экспрессионной плазмиды p1.1-F9 (рис. 1). Протяженные геномные области и ген фактора элонгации трансляции 1альфа китайского хомячка обеспечивали высокий уровень экспрессии целевых генов и постоянство этого уровня в течение не скольких месяцев последовательных пересевов [21]. Область ОРС гена FIX в плазмиде p1.1-F9 была со единена с селекционным маркером - дигидрофолатредуктазой мыши (DHFR) при помощи аттенюированного внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES), что обеспечивало экспрессию единой бицистронной мРНК. Такая структура обеспечивает максимально возможное сцепление целевого гена и селекционного маркера, что необходимо для амплификации генетических кассет, интегрированных в геном клеток-продуцентов. Плазмиду p1.1-F9 линеаризовали с разрушением гена бета-лактамазы и использовали для трансфекции клеток линии CHO DG44, дефектных по обоим аллелям гена dhfr. Через 48 ч после трансфекции клетки подвергали первичной селекции в присутствии трех различных концентраций метотрексата - 50, 100, 200 нМ. Во всех трех случаях получены стабильно трансфицированные популяции клеток с уровнями секреции FIX 0.69 ± 0.04, 1.05 ± 0.05 и 1.83 ± 0.24 мкг/мл по данным ИФА соответственно при времени удвоения куль тур 27-29 ч. Максимальный титр FIX зафиксирован в культуре, полученной в присутствии 200 нМ MTX, поэтому был проведен иммуноблотинг внутри клеточного и секретируемого этой культурой FIX (рис. 2A). Иммунореактивные полосы FIX с некорректной молекулярной массой не были обнаружены, что косвенно свидетельствовало об отсутствии повреждений генетических кассет, интегрированных в геном клеток. Полученную поликлональную культуру использовали для клонирования клеток методом предельных разведений. Клональные линии-продуценты FIX с максимальным титром продукта повторно адаптировали к условиям культивирования в суспензии среде без добавок нуклеотидов и ингибиторов DHFR. Уровень секреции FIX тремя лучшими клональными линиями составил 11.9 ± 0.4, 12.3 ± 0.4, 9.9 ± 0.3 мкг/мл после 3 дней культивирования. Для дальнейшей работы выбрали клональную линию p1.1-F9-T2/S с удельной продуктивностью (Qp) 2.99 ± 0.06 пг/клетка/день и временем удвоения 22.5 ч. Продуктивность клональной линии увеличивали путем амплификации целевого гена под дей ствием возрастающих концентраций метотрексата. После повышения концентрации MTX до 4 мкМ получили олигоклональную линию клеток с Qp 5.97 ± 0.18 пг/клетка/день, которую использова ли для второго клонирования методом предельных разведений. Среди 12 наиболее продуктивных клонов клеток, повторно адаптированных к суспензионному культивированию, отобрали клон p1.1-F9-Т2/4k-3B12 (далее в тексте и на рисунках - 3B12) с Qp 10.7 ± 0.4 пг/клетка/день и временем удвоения культуры 20.2 ч (рис. 2Б). Получение линии клеток, секретирующих биологически активный FIX FIX, секретируемый клональной клеточной лини ей 3B12, был практически полностью неактивным. Прокоагуляционная активность FIX в культуральной среде составляла 0.22 МЕ/мл при общей концентрации 59 мкг/мл (определение методом ИФА), что со ответствовало удельной активности, составляющей 1.8% от активности природного фактора IX человека. Отсутствие биологической активности FIX могло быть вызвано двумя известными причинами - недостаточным γ-карбоксилированием его Gla-домена [7] и сохранением пропептида у секретированных молекул FIX, что связано с невозможностью осуществления сколько-нибудь эффективного процессинга пропептида FIX эндогенными протеазами семейства PACE/furin клеток-хозяев [7]. Правильный процессинг пропептида фактора IX человека может быть обеспечен коэкспрессией гена сигнальной протеазы PACE/furin человека. Для ко экспрессии растворимого укороченного варианта PACE/furin человека мы использовали вектор p1.2-HYG, аналогичный вектору p1.1, но содержащий рас положенный вне контекста гена EEF1A ген гигромицин-фосфотрансферазы под контролем промотора SV40, обеспечивающий устойчивость к антибиотику гигромицину Б (рис. 1). Для сверхэкспрессии эндогенного VKORC1 мы клонировали область открытой рамки считывания гена vkorc1 из кДНК клеток CHO DG44 при по мощи праймеров, гомологичных началу и концу ОРС гена vkorc1 мыши. Секвенирование клонированного продукта ПЦР выявило приблизительно одинаковый уровень гомологии между vkorc1 китайского хомячка и vkorc1 мыши и человека (рис. 2В). VKORC1 китайского хомячка, в отличие от его ортологов у других млекопитающих, содержит мотив RRR [30] на границе первого трансмембранного домена и обладает значительно меньшей гомологией с vkorc1 человека (рис. 2Г). Охарактеризованная область ОРС гена vkorc1 китайского хомячка депонирована в GenВank (AFG26681.1), а также клонирована в вектор p1.2-Zeo с образованием плазмиды p1.2-Zeo-VKORC1 (рис. 1). На основе того же вектора экспрессии создана также контрольная конструкция p1.2-Zeo-hVKORC1, со держащая область ОРС vkorc1 человека. На основе клеток CHO DG44 получены стабильно трансфицированные поликлональные популяции, экспрессирующие оба ортолога гена vkorc1. В лизате клеток была измерена витамин К-оксидоредуктазная активность, а также определено число копий интегрированных экспрессионных кассет. Сверхэкспрессия обоих ортологов vkorc1 привела к сильному увеличению оксидоредуктаз ной активности в лизате клеток (табл. 3), при этом VKORC1 китайского хомячка обеспечивал втрое большую удельную ферментативную активность, чем VKORC1 человека при практически одинаковом числе копий интегрированных кассет - 5.8 ± 0.3 и 5.5 ± 0.5 копии/геном для генов vkorc1 китайского хомячка и человека соответственно. Уровень транскрипции обоих ортологов также не имел существенных отличий - у мРНК VKORC1 китайского хомячка составил 0.12 ± 0.03% от уровня мРНК β-актина; у мРНК VKORC1 человека - 0.09 ± 0.01; P = 0.16. Одновременно с этим обнаружено, что максимальная скорость конверсии субстрата VK > O микросомальной фракцией белков, полученных из клеток, трансфицированных геном VKORC1 человека, составляет около 5% в 1 ч, а в случае VKORC1 китайского хомячка - не менее 9% в 1 ч (данные не приведены). Поскольку сверхэкспрессия аутологичного гена vkorc1 в клетках CHO позволяет добиться максимальной витамин К-оксидоредуктазной активности, то этот вариант vkorc1 использовали для котрансфекции линии клеток-продуцентов FIX. Клетки клональной линии 3B12 последовательно трансфицировали линеаризованными плазмидами p1.2-Zeo-VKORC и p1.2-Hygro-Fur. В полученной популяции стабильно трансфицированных клеток, содержащих три генетические кассеты - для экспрессии фактора IX и двух вспомогательных ферментов, удельная прокоагуляционная активность FIX в культуральной среде составила 27% от стандарта, при этом по данным ИФА доля молекул секретированного FIX с неотделенным пропептидом составляла только 3.1% (рис. 2Б). Таким образом, активность растворимого PACE/furin человека в полученной популяции клеток была достаточной для практически полного отделения пропептида, однако уровень γ-карбоксилирования в большей части клеток был недостаточным для правильного формирования Gla домена FIX. Можно предположить, что не во всех стабильно трансфицированных клетках экспрессия вспомогательных ферментов была одинаково эффективной, но, в отличие от VKORС1, растворимый PACE/furin, выделяемый в культуральную среду частью клеток, обеспечивал отделение пропетида у всех секретированных молекул FIX. Для выделения клеток, в которых максимально эффективно работают оба вспомогательных фермента, т.е. образуется биологически активный FIX, провели клонирование полученной популяции методом предельных разведений, используя в качестве критериев отбора перспективных клонов прокоагуляционную активность секретируемого FIX и уровень пептидазной активности PACE/furin в культуральной среде. Из 199 первичных клонов клеток отобрали 80 с максимальной концентрацией FIX, из которых отобрали 24 клона с максимальной активностью PACE/furin, а из них 12 клонов с максимальной прокоагуляционной активностью FIX (данные не приведены). Пять из 12 отобранных та ким образом клональных линий успешно адаптировали к суспензионному культивированию в присутствии водорастворимого витамина K3, удельная прокоагуляционная активность FIX у всех клонов составляла более 185 МЕ/мг. Среди этих пяти клонов была определена основная линия 3B12-86 с Qp 11.2 ± 0.3 пг/клетка/день и две запасные линии - 3B12-78 и 3B12-05. Копийность гена FIX, области его селекционного маркера и вспомогательных генов в геноме линий-продуцентов и родительских популяций клеток определяли методом количественного ПЦР (рис. 3A,Б). Копийность областей ОРС FIX и DHFR не отличалась статистически значимо у всех исследованных объектов, т.е. ни в одном случае не обнаружены признаки «расцепления» целевого гена и гена селекционного маркера, т.е. изменения копийности гена селекционного маркера отдельно от целевого гена, несмотря на амплификацию генетических кассет в геноме продуцентов. В ходе получения линии 3B12-86 наблюдались изменения копийности гена FIX человека: копийность гена FIX возрастала при близительно в 5 раз при амплификации, сохранялась при клонировании амплифицированной популяции и затем упала в 4 раза при котрансфекциях плазмид со вспомогательными генами и повторного клонирования. Удельная продуктивность соответствующих линий клеток при этом не уменьшалась. Вероятно, при снятии селекционного давления наблюдалась потеря малоактивных копий генетической кассеты, возникших в процессе геномной амплификации. Копийность вспомогательных генов во всех полученных клональных линиях была значительно ниже, чем копийность гена FIX, поскольку отбор клонов клеток по критерию максимальной активности гена vkorc1 не проводили, а в случае PACE/furin проведен только один раунд отбора, в котором отобрали треть от всех полученных клонов. В основной линии-продуценте 3B12-86 методом ПЦР-РВ оценили изменение уровня экспрессии не скольких генов домашнего хозяйства, связанных с биосинтезом и посттрансляционным процессингом белков (рис. 3B). Ни у одного из проверенных генов не обнаружили значимого изменения уровня экспрессии, что указывает на отсутствие существенного изменения системы биосинтеза и процессинга белка клеток-хозяев, секретирующих FIX с достигнутой продуктивностью. Оценка целостности области открытой рамки считывания целевого гена Методом ПЦР с геномной ДНК и праймеров к областям промотора и терминатора использованных экспрессионных векторов показали, что преобладающие продукты ПЦР имеют «правильную» молекулярную массу (рис. 4А), а именно, везде выявляется продукт размером 2942 п.н., соответствующий р1.1-F9, а в случае геномной ДНК линии 3B12-86 обнаружены также ампликоны длиной 2511 и 852 п.н., соответствующие областям ОРС VKORC1 и PACE/furin. Аналогичная амплификация кДНК из линии 3B12-86 с праймерами, гомологичными областям начала и конца ОРС FIX, также выявила только продукт нужного размера (рис. 4Б), что подтверждает отсутствие протяженных делеций или инсерций в области ОРС FIX или мутаций, приводящих к изменению сплайсинга мРНК FIX. Блотинг по Саузерну на геномной ДНК из линии 3B12-86 с зондом, направленным к области ОРС FIX, выявил один рестрикционный фрагмент дли ной 1921 п.н. (рис. 4В), что указывает на отсутствие в геноме продуцента генетических кассет, встроившихся с разрывом ДНК в области ОРС FIX. Блотинг по Саузерну с использованием зонда к участкам ДНК плазмиды, соответствующим области начала репликации плазмиды и области гена bla, выявил два рестрикционных фрагмента - тяжелый фрагмент около 3700 п.н., приблизительно соответствующий расчетной интеграции кассеты по сайту ее линеаризации рестриктазой PvuI, а также короткий фрагмент размером около 800 п.н., предположительно со ответствующий интеграции кассеты с делецией ДНК вблизи сайта PvuI. Псевдонозерн-блотинг на кДНК, полученных из линий 3B12-86 и 3B12-78, также вы явил только мРНК FIX ожидаемой длины (рис. 4Г). Отсутствие мутаций в области ОРС FIX подтверждено также с помощью ПЦР-амплификации всей области ОРС FIX из геномной ДНК линии 3B12-86, клонирования ампликона и секвенирования вставки в трех плазмидных клонах. Во всех случаях не вы явлено изменений в последовательности ОРС FIX (данные не приведены). Выделение и очистка FIX Выделение и очистку FIX из кондиционированной среды линии 3B12-86 проводили при помощи трех последовательных стадий - мультимодальной хро матографии с сорбентом Capto MMC, позволяющим извлекать FIX из кондиционированной среды без ее дополнительной подготовки; псевдоаффинной хроматографии на анионообменном сорбенте Capto Q с элюцией прокоагуляционно активных молекул FIX хлоридом кальция при низкой ионной силе; аффинной хроматографии на специализированном сорбенте Capto Heparin, отделяющем гепаринсвязывающие белки от остальных молекул. Суммарный выход продукта составил 32%, удельная прокоагуляционная активность FIX в процессе очистки превысила 230 МЕ/мг, что соответствует показателям известного лекарственного препарата рекомбинантного FIX (табл. 4). По данным гель-электрофореза (рис. 5) большая часть молекул FIX элюировалась с сорбента Capto Q при добавлении ионов Ca2+ к низкосолевому элюенту, что указывает на наличие у этой части молекул FIX правильно сформированного Gla-домена, структурная перестройка которого при хелатировании ионов Ca2+ вызывает элюцию Gla-белков с анионообменного носителя. ВЫВОДЫ Разработанный нами ранее набор векторов на основе нетранслируемых участков гена EEF1A1 китайского хомячка может использоваться для получения линий клеток, секретирующих большие количества функционально активного FIX человека. Целевой ген может быть амплифицирован в геноме продуцентов путем культивирования клеток в присутствии возрастающих концентраций MTX, что приводит к многократному повышению секреции FIX. Достаточный уровень экспрессии вспомогательных генов vkorc1 и PACE/furin может быть обеспечен котрансфекцией «совместимых» плазмид с генами устойчивости к антибиотикам. Полученные клональные линии продуценты FIX содержат относительно небольшое число копий целевого гена и только несколько копий вспомогательных генов в составе хромосомной ДНК, что может способствовать поддержанию постоянства уровня секреции при длительном культивировании. Сравнительный анализ сверхэкспрессированных ортологов гена фермента VKORC1 показал, что аутологичный VKORC1 китайского хомячка обеспечивает вдвое большую ферментативную активность при одинаковом числе копий искусственного гена vkorc1 в геноме. Такой способ сверхэкспрессии гена vkorc1 может применяться для получения в клетках CHO не только продуцентов FIX, но и других витамин К-зависимых белков. Особенно перспективным представляется использование гена vkorc1 китайского хомячка для получения фактора VII свертывания крови человека в клетках CHO. Применяемая в настоящее время для промышленного производства FVII линия клеток BHK сочетает сравнительно высокую активность комплекса VKOR с низким общим уровнем секреции FVII, а также с определенными ограничения ми режима культивирования - в отличие от CHO эта линия требует присутствия в среде фетальной сыворотки крупного рогатого скота и способна к нормаль ному росту только в адгезионных условиях. Высокая удельная продуктивность созданной линии-продуцента фактора свертывания крови FIX позволит использовать для промышленного получения FIX простое периодическое культивирование продолжительностью 4-5 дней, титр FIX при этом составляет около 6 МЕ/мл. Такой метод получения FIX не нуждается в специализированных биореакторах с системами перфузии или в разработке способов поддержания жизнеспособности клеточной культуры в течение длительного времени, что значительно упрощает и удешевляет процесс промышленного производства рекомбинантного фактора IX человека.

Об авторах

С. В. Ковнир

Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ptichman@gmail.com
Россия

Н. А. Орлова

Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН

Email: ptichman@gmail.com
Россия

М. И. Шахпаронов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ptichman@gmail.com
Россия

К. Г. Скрябин

Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН

Email: ptichman@gmail.com
Россия

А. Г. Габибов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ptichman@gmail.com
Россия

И. И. Воробьев

Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ptichman@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы