Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1035610.32607/20758251-2018-10-1-51-65Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleA Highly Productive CHO Cell Line Secreting Human Blood Clotting Factor IXВысокопродуктивная линия-продуцент фактора свертывания крови IX человека на основе клеток CHOKovnirS. V.КовнирС. В.
Russian Federation
ptichman@gmail.comOrlovaN. A.ОрловаН. А.
Russian Federation
ptichman@gmail.comShakhparonovM. I.ШахпароновМ. И.
Russian Federation
ptichman@gmail.comSkryabinK. G.СкрябинК. Г.
Russian Federation
ptichman@gmail.comGabibovA. G.ГабибовА. Г.
Russian Federation
ptichman@gmail.comVorobievI. I.ВоробьевИ. И.
Russian Federation
ptichman@gmail.comInstitute of Bioengineering of the Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of SciencesИнститут биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАНM. M. Shemyakin-Yu. A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of SciencesИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН15032018101VOL 10, NO1 (2018)ТОМ 10, №1 (2018)516517012020Copyright ©; 2018, Kovnir S.V., Orlova N.A., Shakhparonov M.I., Skryabin K.G., Gabibov A.G., Vorobiev I.I.Copyright ©; 2018, Ковнир С.В., Орлова Н.А., Шахпаронов М.И., Скрябин К.Г., Габибов А.Г., Воробьев И.И.2018Kovnir S.V., Orlova N.A., Shakhparonov M.I., Skryabin K.G., Gabibov A.G., Vorobiev I.I.Ковнир С.В., Орлова Н.А., Шахпаронов М.И., Скрябин К.Г., Габибов А.Г., Воробьев И.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10356

Hemophilia B patients suffer from an inherited blood-clotting defect and require regular administration of blood-clotting factor IX replacement therapy. Recombinant human factor IX produced in cultured CHO cells is nearly identical to natural, plasma-derived factor IX and is widely used in clinical practice. Development of a biosimilar recombinant human factor IX for medical applications requires the generation of a clonal cell line with the highest specific productivity possible and a high level of specific procoagulant activity of the secreted factor IX. We previously developed plasmid vectors, p1.1 and p1.2, based on the untranslated regions of the translation elongation factor 1 alpha gene from Chinese hamster. These vectors allow one to perform the methotrexate- driven amplification of the genome-integrated target genes and co-transfect auxiliary genes linked to various resistance markers. The natural open reading frame region of the factor IX gene was cloned in the p1.1 vector plasmid and transfected to CHO DG44 cells. Three consecutive amplification rounds and subsequent cell cloning yielded a producer cell line with a specific productivity of 10.7 ± 0.4 pg/cell/day. The procoagulant activity of the secreted factor IX was restored nearly completely by co-transfection of the producer cells by p1.2 plasmids bearing genes of the soluble truncated variant of human PACE/furin signal protease and vitamin K oxidoreductase from Chinese hamster. The resulting clonal cell line 3B12-86 was able to secrete factor IX in a protein-free medium up to a 6 IU/ml titer under plain batch culturing conditions. The copy number of the genome- integrated factor IX gene for the 3B12-86 cell line was only 20 copies/genome; the copy numbers of the genome-integrated genes of PACE/furin and vitamin K oxidoreductase were 3 and 2 copies/genome, respectively. Factor IX protein secreted by the 3B12-86 cell line was purified by three consecutive chromatography rounds to a specific activity of up to 230 IU/mg, with the overall yield > 30%. The developed clonal producer cell line and the purification process employed in this work allow for economically sound industrial-scale production of biosimilar factor IX for hemophilia B therapy.

Больные гемофилией B - наследственным нарушением свертывания крови - нуждаются в регулярном применении препаратов фактора свертывания крови IX. Рекомбинантный фактор IX человека, продуцируемый в культивируемых клетках линии СНО, практически эквивалентен природному фактору IX плазмы крови и широко используется в современной клинической практике. Получение биосимилярного рекомбинантного фактора IX человека предполагает создание клональной клеточной линии с максимально возможной удельной продуктивностью и высоким уровнем удельной прокоагуляционной активности секретируемого фактора IX. Ранее на основе нетранслируемых участков гена фактора элонгации трансляции 1альфа китайского хомячка нами было разработано семейство плазмидных векторов p1.1 и p1.2, позволяющее проводить амплификацию целевого гена в геноме клеток-продуцентов под действием метотрексата, а также котрансфекцию вспомогательных генов, сцепленных с различными селекционными маркерами. Природная область открытой рамки считывания гена фактора IX человека в векторе p1.1 была трансфицирована в клетки линии CHO DG44. В результате трех последовательных шагов амплификации и последующего клонирования получена линия клеток, продуцирующая фактор IX с удельной продуктивностью 10.7 ± 0.4 пг/клетка/день. Прокоагуляционная активность секретируемого фактора IX была практически полностью восстановлена путем котрансфекции клеток плазмидами семейства р1.2, несущими гены растворимого варианта протеазы PACE/furin и витамин К-оксидоредуктазы китайского хомячка. Клональная линия-продуцент 3B12-86 позволяла накапливать фактор IX в бессывороточной культуральной среде до концентрации 6 МЕ/мл при простом периодическом культивировании, при этом копийность интегрированного гена фактора IX составила всего 20 копий/геном, а интегрированных генов PACE/furin и VKORC1 - три и две копии/геном соответственно. Фактор IX человека, секретируемый линией 3B12-86, был очищен при помощи трех стадий хроматографии до удельной активности 230 МЕ/мг с выходом более 30%. Полученная клональная линия-продуцент фактора IX и метод очистки продукта позволяют вести экономически обоснованное промышленное производство биосимилярного рекомбинантного фактора IX для терапии гемофилии B.

blood clotting factor IXhemophilia Bheterologous protein expression systemгемофилия Bсистемы гетерологичной экспрессии рекомбинантных белковфактор свертывания крови IXThis study was supported by the Ministry of Industry of the Russian Federation (grant no. 121/13-FMP-0.507OK) and the Russian Foundation for Basic Research (grants nos. 16-34-01026 and 16-34-60242).Авторы выражают благодарность А.Л. Берковскому за ценные рекомендации и реагенты для коагулометрии. Работа проводилась при поддержке Минпрома (№ 121/13-ФМП-05.07ОК) и РФФИ (№ 16-34-01026 и 16-34-60242).[1] Rogaev E.I., Grigorenko A.P., Faskhutdinova G., Kittler E.L., Moliaka Y.K. // Science. 2009, V.326, №5954, P.817[2] Puetz J., Soucie J.M., Kempton C.L., Monahan P.E. // Haemophilia. 2014, V.20, №1, P.25-31[3] Kurachi K., Davie E.W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982, V.79, №21, P.6461-6464[4] Anson D.S., Austen D.E., Brownlee G.G. // Nature 1985, V.315, №6021, P.683-685[5] De la Salle H., Altenburger W., Elkaim R., Dott K., Dieterle A., Drillien R., Cazenave J.P., Tolstoshev P., Lecocq J.P. // Nature 1985, V.316, №6025, P.268-270[6] Kaufman R.J., Wasley L.C., Furie B.C., Furie B., Shoemaker C.B. // J. Biol. Chem. 1986, V.261, №21, P.9622-9628[7] McGrath B.M., Walsh G. // Directory of Therapeutic Enzymes. Boca Raton: CRC Press, 2005[8] Derian C.K., VanDusen W., Przysiecki C.T., Walsh P.N., Berkner K.L., Kaufman R.J., Friedman P.A. // J. Biol. Chem. 1989, V.264, №12, P.6615-6618[9] Makino Y., Omichi K., Kuraya N., Ogawa H., Nishimura H., Iwanaga S., Hase S. // J. Biochem. 2000, V.128, №2, P.175-180[10] Poon M.C., Lillicrap D., Hensman C., Card R., Scully M.F. // Thromb. Haemost. 2002, V.87, №3, P.431-435[11] Lissitchkov T., Matysiak M., Zavilska K., Laguna P., Gercheva L., Antonov A., Moret A., Caunedo P., Aznar J.A., Woodward M.K., Paez A. // Haemophilia. 2013, V.19, №5, P.674-678[12] Bond M., Jankowski M., Patel H., Karnik S., Strang A., Xu B., Rouse J., Koza S., Letwin B., Steckert J., Amphleand G., Scoble H. // Semin. Hematol. 1998, V.35, №2, S2, P.11-17[13] Berkner K.L. // Annu. Rev. Nutr. 2005, V.25, P.127-149[14] Garcia A.A., Reitsma P.H. // Vitam. Horm. 2008, V.78, P.23-33[15] Bolt G., Steenstrup T.D., Kristensen C. // Thromb. Haemost. 2007, V.98, №5, P.988-997[16] Wajih N., Hutson S.M., Owen J., Wallin R. // J. Biol. Chem. 2005, V.280, №36, P.31603-31607[17] De Castilho Fernandes A., Fontes A., Gonsales N., Swiech K., Picanco-Castro V., Faca S., Covas D. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2011, V.58, №4, P.243-249[18] Wilson C.R., Sauer J.M., Carlson G.P., Wallin R., Ward M.P., Hooser S.B. // Toxicology. 2003, V.189, №3, P.191-198[19] Schulman S., Wang B., Li W., Rapoport T.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, V.107, №34, P.15027-15032[20] Tie J.K., Jin D.Y., Stafford D.W. // J. Biol. Chem. 2014, V.289, №13, P.9396-9407[21] Orlova N.A., Kovnir S.V., Hodak J.A., Vorobiev I.I., Gabibov A.G., Skryabin K.G. // BMC Biotechnol. 2014, V.14, P.56[22] Kozak M. // Nucleic Acids Research 1987, V.15, №20, P.8125-8148[23] Griffin A.M., Griffin H.G. // Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Horizon Scientific Press, 1995 1995[24] Dussault A.A., Pouliot M. // Biol. Procd. Online. 2006, V.8, P.1-10[25] Church G.M., Gilbert W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984, V.81, №7, P.1991-1995[26] Harlow E., Lane D. // Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988[27] Bristol J.A., Furie B.C., Furie B. // J. Biol. Chem. 1993, V.268, №10, P.7577-7584[28] Rost S., Fregin A., Ivaskevicius V., Conzelmann E., Hortnagel K., Pelz H.J., Lappegard K., Seifried E., Scharrer I., Tuddenham E.G., Muller C.R., Strom T.M., Oldenburg J. // Nature 2004, V.427, №6974, P.537-541[29] Tishler M., Fieser L.F., Wendler N.L. // J. Am. Chem. Soc. 1940, V.62, №10, P.2866-2871[30] Alves D.S., Castello-Banyuls J., Faura C.C., Ballesta J.J. // FEBS Lett. 2011, V.585, №8, P.1169-1174