ATP уменьшает вход ионов кальция в нервную терминаль, блокируя кальциевые каналы L-типа

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В нервно-мышечном соединении ATP уменьшает амплитуду многоквантовых токов концевой пластинки (ТКП), активируя пресинаптические Р2Y-рецепторы [1]. Угнетающее действие ATP на амплитуду постсинаптических токов является пресинаптическим эффектом и может быть обусловлено изменением активности кальциевых каналов, вход кальция (Са2+) через которые запускает процесс экзоцитоза синаптических везикул. Действительно, ATP обратимо снижала Са2+ ток в перисинаптическом отделе аксона [2] и уменьшала амплитуду Са2+-транзиента, зарегистрированного в различных отделах нервной терминали лягушки [3]. Изменение амплитуды транзиента отражает изменение концентрации свободных ионов Са2+ внутри терминали [4, 5], и ее снижение при действии ATP может свидетельствовать о влиянии этого пурина на активность пресинаптических кальциевых каналов. На нервной терминали лягушки функционируют несколько типов потенциал-зависимых кальциевых каналов [4]. Активность каналов какого типа изменяется при действии ATP неизвестно. Данные о влиянии ATP на потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа достаточно противоречивы. На различных объектах показано, что ATP способна как усиливать вход ионов кальция через каналы L-типа [6], так и ингибировать эти каналы [7]. В настоящей работе, используя флуоресцентный метод регистрации Са2+-транзиента в нервной терминали лягушки, мы выясняли, участвуют ли пресинаптические потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа в подавлении амплитуды Са2+-транзиента ATP. Установлено, что снижение амплитуды транзиента при активации пуринорецепторов частично обусловлено уменьшением входа ионов Са2+ через кальциевые каналы L-типа. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Исследование выполнено на изолированном нервномышечном препарате m. cutaneus pectoris лягушек Rana ridibunda. Относительное изменение уровня Ca2+ в нервной терминали (Ca2+-транзиент) оценивали при помощи флуоресцентного красителя Oregon Green Bapta 1. Подробно методика загрузки красителя через культю нерва, протоколы регистрации и обработки флуоресцентных сигналов представлены в работе [8]. Использовали следующий протокол экспериментов. После загрузки флуоресцентного красителя в нервные терминали препарат помещали в ванночку объемом 3 мл, через которую со скоростью 3 мл/мин протекал перфузионный раствор. Для предотвращения сокращений мышечных волокон при стимуляции двигательного нерва использовали раствор Рингера с пониженным содержанием ионов Са2+ и повышенным Mg2+: NaCl - 113.0 мМ, KCl - 2.5 мМ, NaHCO3 - 3.0 мМ, MgCl2 - 6.0 мМ, CaCl2 - 0.9 мМ (pH 7.2-7.3, температура 20.0 ± 0.3°C). Эксперименты проводили в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Декларацией о гуманном отношении к животным. В каждой серии экспериментов использовали 6-21 синапс от 3-5 животных. Стимуляцию двигательного нерва прямоугольными импульсами длительностью 0.2 мс с частотой 0.5 имп/с осуществляли стимулятором (A-M Systems 2100) при помощи «всасывающего» suction электрода. Со всей длины выбранной нервной терминали в контрольных условиях регистрировали 60 последовательных флуоресцентных сигналов, после чего в перфузионный раствор добавляли исследуемое вещество. Регистрацию 60 сигналов с той же терминали, что и в контроле, начинали спустя 20-25 мин после аппликации вещества. При необходимости в перфузионный раствор в присутствии первого вещества подавали следующее исследуемое соединение, и сигналы все с той же нервной терминали вновь регистрировали через 20-25 мин. Предварительно были проведены эксперименты, результаты которых свидетельствуют о том, что амплитудно-временные параметры флуоресцентного сигнала в ответ на редкую стимуляцию двигательного нерва не претерпевают изменений в течение 3-4 ч. Регистрацию флуоресцентных сигналов в ответ на нервный стимул осуществляли c помощью фотометрической установки на базе микроскопа Olympus BX-51 с водно-иммерсионным объективом ×60 в программе Turbo-SM. В качестве источника освещения использовали монохроматор Polyhrom V (Till Photonics, Munich, Германия), настроенный на длину волны возбуждения красителя - 488 нм. Флуоресцентный сигнал выделяли с использованием следующего набора фильтров: 505DCXT дихроическое зеркало, E520LP эмиссия (Chroma). Для уменьшения фонового свечения область освещения ограничивали при помощи диафрагмы. Данные анализировали с использованием программного обеспечения камеры Neuro CCD и ImageJ. В программе ImageJ выбирали области терминали и фона. Из всех значений свечения области терминали вычитали значение свечения фоновой области. Данные представляли как отношение: (ΔF / F0 - 1) × 100%, где ΔF - интенсивность флуоресценции в ответ на стимул, а F0 - интенсивность флуоресценции в состоянии покоя. F0 регистрировали перед каждой записью флуоресцентных сигналов в ответ на нервный стимул. Статистическую значимость различий между выборками оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Манна-Уитни. Различия между выборками считали статистически значимыми при р < 0.05 (n - количество исследованных синапсов). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Экзогенная ATP в концентрации 10 мкМ вызывала снижение амплитуды Са2+-транзиента в ответ на нервный стимул в среднем на 13.2 ± 1.9% (р = 0.0003, n = 8; рис. 1А,В). Увеличение концентрации ATP до 100 мкМ не повлияло на выраженность эффекта - Ca2+-транзиент снижался на 13.6 ± 1.4% (р = 0.000003, n = 21) относительно контрольных значений (рис. 1В). Сурамин - неселективный антагонист Р2 рецепторов - в дозе 300 мкМ увеличивал величину Ca2+-транзиента в среднем на 20.5 ± 9.0% (р = 0.037, n = 8; рис. 1В) относительно значений в контрольных условиях. Добавление 100 мкМ ATP в среду, содержащую сурамин, не приводило к значимому изменению Ca2+-транзиента, которое составило лишь 3.4 ± 3.1% (р = 0.27, n = 5; рис. 1Б,В). Таким образом, влияние ATP на амплитуду Ca2+-транзиента связано с активацией Р2-рецепторов. Специфический блокатор кальциевых каналов L-типа нитрендипин в концентрации 5 мкМ снижал амплитуду Ca2+-транзиента на 12.4 ± 3.6% (р = 0.0003, n = 12; рис. 2), что свидетельствует о вкладе каналов L-типа в суммарный кальциевый ток, вызванный потенциалом действия (см. также [4]). Изменение амплитуды Ca2+-транзиента под влиянием ATP в условиях блокады каналов L-типа составило всего 4.2 ± 1.1% (р = 0.016, n = 7; рис. 2), что значительно меньше собственного эффекта ATP (критерий Манна-Уитни, р = 0.011). Таким образом, блокада кальциевых каналов L-типа уменьшала снижение амплитуды Ca2+-транзиента под действием ATP. Можно предположить, что активация пуринорецепторов ATP приводит к подавлению активности кальциевых каналов L-типа. Если это верно, то уменьшение амплитуды транзиента при действии нитрендипина должно быть менее выраженным в присутствии ATP. И действительно, нитрендипин не влиял на амплитуду Ca2+-транзиента после предварительной аппликации ATP - изменение амплитуды составило лишь 2.0 ± 1.9% (n = 6; рис. 2). Ранее мы показали, что экзогенная ATP в концентрации 100 мкМ уменьшала амплитуду Са2+ транзиента в равной степени в различных участках протяженного нервного окончания лягушки [3]. Уменьшение транзиента при действии ATP соответствует снижению амплитуды вызванных ТКП при нормальном содержании кальция [1] и квантового состава ТКП в условиях сниженной концентрации ионов Ca2+ в растворе [9]. Данные об ATP индуцированном уменьшении входа ионов Ca2+ внутрь терминали в ответ на нервный импульс согласуются с результатами работы [2], в которой показано обратимое снижение пресинаптического кальциевого тока под действием ATP. Экзогенная ATP снижала амплитуду ТКП в результате активации пресинаптических Р2Yрецепторов, поскольку эффект предотвращался предварительной инкубацией препарата в сурамине [1]. В наших экспериментах снижение амплитуды Ca2+-транзиента при действии ATP также предотвращалось сурамином (рис. 1Б,В). При этом сам сурамин вызывал увеличение Ca2+-транзиента (рис. 1). Этот эффект может быть связан с возможностью увеличения концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме в результате его выхода из саркоплазматического ретикулума [10]. Показано, что сурамин увеличивает не только вероятность открытого состояния, но и проводимость одиночных рианодин-чувствительных каналов [11]. Увеличение амплитуды Ca2+-транзиента под влиянием сурамина соответствует данным об увеличении квантового состава ТКП при блокировании Р2-рецепторов [12]. Данные о влиянии ATP на потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа достаточно противоречивы. ATP в микромолярных концентрациях способна обратимо дозо-зависимым образом подавлять ток через Ca2+-каналы L-типа в кардиомиоцитах [7]. В то же время активация пуринорецепторов способна усиливать вход ионов Ca2+ через каналы L-типа в перисинаптических глиальных клетках лягушки [6]. Полученные нами результаты показывают, что в снижение амплитуды Ca2+-транзиента при действии ATP вносит вклад подавление активности Ca2+-каналов L-типа. Об этом свидетельствует значительное снижение эффекта ATP на Ca2+-транзиент в присутствии нитрендипина - специфического блокатора каналов L-типа (рис. 2). Дополнительным подтверждением того, что в эффекты ATP вносят вклад Ca2+-каналы L-типа, является отсутствие влияния их специфического блокатора нитрендипина на амплитуду транзиента после предварительного действия ATP (рис. 2). В этих условиях, когда активность Ca2+ каналов L-типа уже снижена под действием ATP, у нитрендипина не остается мишеней для воздействия. Результаты нашей работы свидетельствуют, что в угнетающем действии ATP на вход Ca2+ в нервное окончание лягушки в ответ на нервный стимул существенную роль играет активность потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа.

Об авторах

Э. Ф. Хазиев

Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»; Казанский (Приволжский) федеральный университет; Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева

Автор, ответственный за переписку.
Email: atsen@list.ru
Россия

Д. В. Самигуллин

Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»; Казанский (Приволжский) федеральный университет; Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева

Email: atsen@list.ru
Россия

А. Н. Ценцевицкий

Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: atsen@list.ru
Россия

Е. А. Бухараева

Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: atsen@list.ru
Россия

Е. Е. Никольский

Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: atsen@list.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы