Обратимая циклическая термоинактивация олигопептидазы В из Serratia proteamaculans

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Олигопептидаза В (OpdB) [КФ 3.4.21.83] - это трипсиноподобная сериновая пептидаза, принадлежащая к семейству пролилолигопептидаз. OpdB присутствует в одноклеточных эукариотах: трипаносомах Trypanosoma cruzi [1], T. brucei [2] и T. evansi [3], а также в лейшманиях Leishmania major и L. amazonensis [4]. OpdB или гены, кодирующие этот фермент, обнаружены в прокариотах: Escherichia coli [5], Moraxella lacunata [6], Salmonella enterica serovar typhimurium [7], Yersinia pestis [7], Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia и Rhodococcus erythropolis [8], микобактериях Mycobacterium tuberculosis и M. leprae [7], а также в спирохетах Treponema denticola [9]. Представители олигопептидаз В обнаружены также в некоторых высших растениях, например в амброзии Ambrosia artemisiifolia [10]. На настоящий момент наиболее изучены OpdB из простейших; определены трехмерные структуры OpdB L. major [11] и T. brucei [12]. Пространственная структура и энзимологические характеристики большинства бактериальных олигопептидаз В не определены, известны лишь нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Объектом нашего исследования является олигопептидазa В Serratia proteamaculans, названная нами PSP. Ген OpdB S. proteamaculans 94 был клонирован, секвенирован и экспрессирован в E. coli; изучена субстратная специфичность OpdB, ингибирование, а также влияние ионов кальция, pH и температуры на активность фермента [13-18]. Все ранее изученные олигопептидазы В как протозойные, так и бактериальные, отличает высокая термостабильность [5, 19]. PSP - это первая известная психрофильная олигопептидаза B. Этот фермент достаточно быстро инактивируется при 37°C; процесс термоинактивации не зависит от природы буфера, оставаясь одинаковым в фосфатном, имидазольном и Трис-буфере рН 7.5-8.0 [17]. Спектры собственной флуоресценции указывают на разворачивание молекулы PSP в результате нагревания при 37°C, сопровождающееся уменьшением ферментативной активности. Ионы кальция ускоряют и усиливают инактивацию PSP [17]. При изучении термоинактивации PSP в ходе экспериментов, описанных в [17], неожиданно обнаружили восстановление активности после инкубации некоторых проб при низких температурах. В этом исследовании мы детально изучили этот феномен при [Ca2+] = 0 и 50 мM. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использовали п-нитроанилид Nα-бензоилD,L-аргинина (BAPNA) (Sigma, США); Tрис и NaCl (Merck, Германия), глицерин (ICN, США); диметилсульфоксид (ДМСО) и п-нитрофениловый эфир п’-гуанидинобензойной кислоты (Fluka, Германия). Получение и очистка PSP дикого типа и точечных мутантов, экспрессированных в E. coli BL21(DE3) (Novagen), были выполнены как описано в [17, 20]. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре Eppendorf BioSpectrometer®kinetiс (Германия). Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда с помощью реактива Bio-Rad Protein Assay, стандарт БСА. Молярность растворов фермента определяли титрованием активных центров п-нитрофениловым эфиром п’-гуанидинобензойной кислоты [21]. Изучение активности препаратов PSP проводили спектрофотометрически с использованием BAPNA (0.2 мМ) в качестве субстрата в 0.1 М Tрис-HClбуфере, pH 8.0; 50 мМ CaCl2 , содержащем 2% ДМСО при 25°C, регистрируя увеличение оптического поглощения при 405 нм, происходящее при образовании свободного п-нитроанилина (∆ε405 10400 М-1см-1). Начальные скорости гидролиза субстрата (два-три повтора для каждого измерения; разница в величинах скоростей не более 5-10%) определяли по начальному линейному участку кинетической кривой (степень гидролиза не превышала 10%). Изучение термостабильности препаратов PSP Определяли начальную активность фермента дикого типа и его мутантных вариантов (0.05 мг/мл = 0.65 мкМ) после разведения запасного раствора фермента, нагретого до 25°С, в буфере инкубации при этой же температуре, отбирая аликвоты по 5-10 мкл и измеряя начальную скорость гидролиза субстрата BAPNA (0.2 мМ; общий объем 1.5 мл). Аликвоты растворов фермента (100 мкл; 0.65 мкМ) инкубировали в течение соответствующего промежутка времени при соответствующей температуре, отбирая по 5-10 мкл в кварцевую кювету с BAPNA и немедленно измеряя остаточную активность как описано выше. Контрольные пробы всех вариантов PSP с той же концентрацией (0.05 мг/мл = 0.65 мкМ) инкубировали в течение соответствующего промежутка времени при 25 и 4°С так же, как опытные образцы, за исключением нагревания, и определяли их активность. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характерной особенностью ферментов семейства пролилолигопептидаз, в том числе OpdB, является N-концевой β-пропеллерный домен, препятствующий проникновению в активный центр объемных глобулярных белков, и каталитический домен, расположенный в С-концевой части молекулы. Изучение трехмерных структур ферментов семейства пролилолигопептидаз показало, что эти белки существуют в открытой (неактивной) и закрытой (активной) форме, находящихся в равновесии. Определение трехмерных структур протозойных OpdB из L. major [11] и T. brucei [12] показало, что функционирование этих ферментов определяется не только аминокислотными остатками триады активного центра и первичного субстратсвязывающего центра, но и пятью междоменными солевыми мостиками SB1-SB5, в которых задействованы 9 заряженных аминокислотных остатков. Ключевая роль при этом принадлежит мосту SB1 - E 172/179-R650/664 (трипаносома/лейшмания), замыкание-размыкание которого при переходе от открытой неактивной формы фермента к закрытой активной и обратно приводит к образованию триады активного центра или соответственно к ее разрушению. Солевые мосты SB1-SB5 строго консервативны у всех протозойных OpdB. Аминокислотная последовательность PSP обладает 35% идентичности по отношению к последовательностям OpdB L. major и T. brucei; в области С-концевого каталитического домена уровень идентичности выше - 50%. При этом участки активного центра и первичного субстратсвязывающего центра у всех этих ферментов практически одинаковы. Однако оказалось, что пять функционально важных междоменных солевых мостов, обнаруженных в протозойных ферментах, не являются консервативными. Только один из них (SB3) сохраняется в PSP, а также в других известных бактериальных OpdB. В положениях, соответствующих пяти из семи заряженных остатков OpdB L. major и T. brucei, образующих солевые мосты SB1, SB2, SB4 и SB5, в PSP и других исследованных бактериальных OpdB находятся незаряженные или противоположно заряженные аминокислотные остатки. Отсутствует и ключевой солевой мост, отвечающий за активность фермента. Для выяснения механизма действия PSP мы провели моделирование трехмерной структуры этого белка в закрытой и открытой форме [20]. В результате были выявлены 12 заряженных остатков, образующих структуру из меж- и внутридоменных солевых мостов, определяющих структуру и активность PSP. Восемь из них (Е75, Е96, Е125, D647, D649, K655, R658, K660) были заменены на незаряженные путем точечного мутагенеза. Получены и охарактеризованы соответствующие мутантные ферменты и показана важная роль вышеперечисленных остатков. Удаление заряженных остатков 75, 96, 655 и 658 приводило к инактивации фермента, 125 и 649 - к повышению его активности. В зависимости от использованных субстратов замена остатков 647 и 660 приводила либо к 2-3-кратному понижению активности, либо к 1.5-2-кратному повышению [20]. В данном исследовании сравнили термостабильность при [Ca2+] = 0 и 50 мM PSP дикого типа (wt) и четырех точечных мутантов с заменой заряженных остатков His652-петли PSP (D647A, D649A, K655A и K660A), а также двух точечных мутантов (E75A и E125A) с заменой кислотных остатков, локализованных в N-концевом β-пропеллерном домене, на незаряженные. Как нами было неоднократно показано ранее, активность препаратов PSP дикого типа [15, 17, 18] и его мутантных вариантов [20] при температуре ≤ 25°C в 0.1 М Tрис-HCl-буфере, pH 8.0 практически не меняется в течение достаточно длительных интервалов времени (до 10-14 сут); при этом отсутствие или наличие (50 мМ) ионов Ca2+ не имеет значения. В данном исследовании активность исходных препаратов PSP, хранящихся как при 4°C, так и при 25°C также оставалась постоянной в течение всего эксперимента. Данные, представленные на рис. 1А,Б, показывают, что ионы кальция являются дестабилизирующим фактором для всех вариантов PSP. Термостабильность мутантов E75A и E125A при [Ca2+] = 0 выше на 20-25% термостабильности фермента дикого типа, а мутантов D649A, K655A, K660A и, особенно D647A, в 1.5-2 раза ниже (рис. 1А). При [Ca2+] = 50 мM различие в термостабильности всех вариантов PSP было менее выражено, однако наиболее термолабильным оказался мутант E75A (рис. 1Б). На основании данных о скорости инактивации PSP и соответствующих мутантных вариантов этого фермента, представленных на рис. 1, для изучения реактивации вариантов PSP выбрали инкубацию при 37°C в течение 3 ч. После определения остаточной активности пробы ферментов инкубировали при 25°C (0.5 и 1 ч), определяя активность, а затем оставляли при 4°C на 18-20 ч. Обнаружено, что активность как фермента дикого типа, так и всех мутантных вариантов возрастала (рис. 2А,Б), причем в случае wt, Е125А и Е75А при охлаждении частично термоинактивированной пробы систематически наблюдали 1.2-1.8-кратное повышение начальной активности (рис. 2А-В). Активность D649A при охлаждении достигала 100-107% (рис. 2Г). Еще более интересным представляется возможность повторения данного цикла нагревания-охлаждения аликвоты вариантов PSP (до 5-кратного), причем каждый цикл включает падение активности при нагревании (37°C) с последующим возрастанием при охлаждении (25 и 4°C). При последующих циклах (2-5) восстановленная активность превышала исходную в меньшей степени (или практически не превышала), а активность вариантов D649A в циклах 4 и 5 после охлаждения была меньше исходной (около 80%) (рис. 2Г). Аналогичные опыты по реактивации D647A, К655А и К660А также выявили повышение активности при охлаждении частично денатурированного фермента, однако при этом реактивация в первых двух циклах не превышала 75-80%, а в следующих циклах - 45-50% исходной активности препаратов (данные не приведены). Охлаждение частично инактивированных проб в присутствии ионов кальция также приводило к повышению активности, но оно не достигало 100%, оставаясь на уровне 64% (wt), 36% (D649A) и 28% (Е125А), даже при длительной инкубации (несколько суток) при 4°C (рис. 3). Термостабильность молекулы PSP мы изучали ранее с помощью высокочувствительной дифференциальной сканирующей калориметрии (ВЧ-ДСК). Полученные данные выявили низкую термостабильность PSP; кривая теплоемкости этого белка содержала два пика с соответствующими значениями Td = 43.1°C (менее стабильный C-концевой каталитический домен) и 46.3°C (более стабильный N-концевой β-пропеллер) [17]. Мы исследовали влияние на активность PSP (wt, Е125А и D649A) инкубации в течение 0.5 ч при температуре 43°C, соответствующей температуре денатурации C-концевого каталитического домена, с последующим охлаждением по схеме экспериментов при 37°C. Остаточная активность после нагревания составляла несколько процентов, тем не менее, последовательная инкубация при 25 и 4°C приводила к повышению активности вариантов PSP на порядок (до 20-40%) (рис. 4). В результате инкубации wt, Е125А и D649A в течение 0.5 ч при температуре 46°C, соответствовавшей плавлению N-концевого β-пропеллерного домена, наблюдалась полная инактивация фермента; последующая инкубация при 25 и 4°C к реактивации не приводила (данные не приведены). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Обнаружено уникальное свойство олигопептидазы В из S. proteamaculans (PSP) - способность к обратимой термоинактивации при 37°C с восстановлением и даже с некоторым превышением исходной активности при последующем охлаждении. Процесс можно повторять с аналогичными результатами многократно (до пяти циклов). Данный эффект может быть объяснен сдвигом равновесия между неактивной открытой формой фермента и активной закрытой в сторону открытой формы при нагревании. Последующее охлаждение приводит к обратному сдвигу в сторону закрытой активной формы. Основанием для этой гипотезы служат результаты рентгеноструктурных и ЯМР-исследований характера обратимых переходов между разными формами ферментов семейства пролилолигопептидаз [12], а также полученные нами ранее экспериментальные данные о корреляции термоинактивации PSP при 37°C с разворачиванием (согласно спектрам собственной флуоресценции) его белковой молекулы [17]. На рис. 5 изображены закрытая и открытая формы PSP, соответствующие полученной нами модели этого фермента [20]. Очевидно, что неактивная открытая форма - развернутая молекула, т.е. денатурированный фермент. Сложнее объяснить происходящее при этом повышение активности. Вероятно, в ходе перехода могут образовываться промежуточные более активные формы фермента. Действительно, ЯМРисследования пролилолигопептидазы человека обнаружили существование многочисленных конформаций этого белка в растворе, что позволило сделать вывод [12], что молекулы ферментов этого семейства, в том числе и OpdB, находятся в постоянно подвижном состоянии, принимая последовательно ряд различных конформаций, включая полностью открытую и полностью закрытую формы. Ионы кальция препятствуют обратному переходу к закрытой форме. Понижение термостабильности PSP в присутствии Са2+ может быть вызвано разрушением солевых мостов SB2 и SB3 при связывании Са2+ с остатками участвующих в них Е494 и D460. Действительно, замена соответствующих остатков в OpdB T. brucei на незаряженные приводила к значительному понижению термостабильности мутантов. Сделан вывод [22] о том, что солевые мосты SB2 и SB3 играют структурную роль, определяя стабильность молекулы OpdB.

Об авторах

М. В. Овчинникова

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский педагогический государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: anna.mikhailova@ibch.ru
Россия

А. Г. Михайлова

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: anna.mikhailova@ibch.ru

Д. М. Карлинский

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: anna.mikhailova@ibch.ru
Россия

В. А. Горленко

Московский педагогический государственный университет

Email: anna.mikhailova@ibch.ru
Россия

Л. Д. Румш

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: anna.mikhailova@ibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы