Пространственная организация внутриядерных структур дофаминергических нейронов мозга человека

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Для ядра эукариотической клетки характерна слож ная внутренняя структурно-функциональная ком партментализация, которая позволяет повысить эффективность внутриклеточных процессов за счет концентрирования специализированных факторов в определенных участках ядерного пространства. Среди важнейших ядерных компартментов при нято выделять ядрышки, ядерные спеклы, тельца Кахаля, PML-тельца и др. [1]. При этом одни внутри ядерные структуры (например, ядрышки) присут ствуют в большинстве клеток эукариот, в то время как другие характерны для конкретного типа кле ток. Примером таких специфических внутриядер ных структур могут служить тельца Маринеско, которые в норме выявляются исключительно в ней ронах черного вещества (substantia nigra) и голубо го пятна (locus coeruleus) мозга человека и прима тов [2, 3]. Важно отметить, что, хотя по отдельности и ядрышки, и тельца Маринеско являются сравни тельно хорошо охарактеризованными структурами, детального изучения их формы и пространственного взаиморасположения в ядрах нервных клеток про ведено не было. Решить подобную задачу позволяет метод конфокальной микроскопии, предполагающий использование первичных антител к известным мар керным белкам различных внутриядерных структур. Для ядрышка таким маркером является нуклеофос мин (nucleophosmin, NPM, В23) - полифункциональ ный белок, участвующий в биогенезе рибосом, ду пликации центросом, регуляции пролиферации и апоптоза [4-6]. Интересно, что В23 экспрессиру ется на высоком уровне не только в активно проли ферирующих клетках, но также в постмитотических нейронах, однако данные о его роли в этих нейро нах практически отсутствуют [6]. Предполагают, что в ядрышке нервных клеток В23 действует как датчик клеточного стресса, инициируя механиз мы, способствующие поддержанию жизнеспособно сти нейронов (например, стабилизируя транскрип ционный фактор р53) [7]. Кроме того, нормальный уровень В23 в нейронах является, возможно, услови ем поддержания блокады клеточного цикла, в то вре мя как чрезмерная экспрессия данного белка может побудить клетку к возврату в клеточный цикл и ини циировать гибель нейронов, что наблюдается в ходе развития нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезни Альцгеймера и Паркинсона, боковой амиотрофический склероз [8-10]. В связи с этим осо бенно существенным представляется иммуноцито химическое исследование распределения белка В23 в дофаминергических нейронах черного вещества головного мозга человека, так как массовая гибель дофаминергических нейронов является характерным признаком болезни Паркинсона и обязательным по казателем адекватности экспериментальных моде лей этого заболевания [11, 12]. В отличие от В23, особенности распределения ко торого в дофаминергических нейронах не изучены, убиквитин как компонент протеасомной системы деградации поврежденных белков неоднократно из учали при анализе функционального состояния ней ронов черного вещества в норме и при патологии [13, 14]. В настоящее время убиквитин считается специ фическим маркером телец Маринеско, функциональ ное значение которых все еще остается непонятным [3]. При изучении внутриядерных убиквитин-имму нопозитивных телец нейронов substantia nigra го ловного мозга человека с использованием методов световой микроскопии и иммуноцитохимии было по казано, что в черном веществе до 20% нейронов могут содержать убиквитин-иммунореактивные тельца, морфологическая характеристика которых соответ ствует тельцам Маринеско [15]. Следует отметить, что в рамках того же исследования в ядрах нейронов черного вещества обнаружены структуры, которые по ряду признаков не могли быть отнесены к тельцам Маринеско, однако содержали убиквитин в детекти руемом количестве [15]. В последние годы появились данные о том, что убиквитин (вместе с убиквитин подобными белками) играет важную роль не только в процессах внутриклеточной деградации белков, но и в биогенезе рибосом [16]. Это предполагает при сутствие данного белка в составе ядрышек, однако результаты иммуноцитохимических исследований, которые подтверждали бы данное предположение, отсутствуют. Таким образом, изучение формы и пространствен ного расположения В23- и убиквитин-иммунопози тивных структур в дофаминергических нейронах го ловного мозга человека является актуальной задачей современной нейробиологии и представляет интерес для фундаментальной неврологии. Поэтому поиск подходов к решению именно этих вопросов и соста вил цель нашей работы. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использованы фрагменты среднего мозга человека (n = 6, мужчин и женщин в возрасте от 25 до 87 лет, причина смерти которых не была связана с заболеваниями и повреждениями головного мозга). Материал получен из архива отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медици ны. Программа исследований имеет положительное заключение Локального этического комитета ФГБНУ «ИЭМ». Материал был фиксирован в цинк-этанол формальдегиде [17] и залит в парафин. Из парафи новых блоков готовили срезы толщиной 5, 7 и 10 мкм, которые наклеивали на предметные стекла с адге зивным покрытием (Histobond, Polysine, SuperFrost Gold, Германия). Часть препаратов окрашивали классическим нейрогистологическим методом - то луидиновым синим по Нисслю. Перед постановкой иммуноцитохимических реакций верифицировали пригодность материала для исследования (исклю чали нейродегенеративный процесс и посмертный аутолиз). Для улучшения иммунореактивности вы являемых антигенов проводили их тепловое дема скирование в модифицированном цитратном буфере pH 6.1 (S1700, Dako, Дания). Контрольные иммуно гистохимические реакции проводили с учетом реко мендаций производителей реагентов. При постановке иммуногистохимических реакций для микроскопии в проходящем свете использовали следующие первичные антитела: поликлональные кроличьи антитела к убиквитину (Dako) в разведении 1 : 400; моноклональные мышиные антитела к белку B23 (нуклеофосмину) клон FC82291 (Sigma- Aldrich, США) в разведении 1 : 200 и мышиные моноклональные антитела к тирозингидроксила зе (клон 1B5) в разведении 1 : 50 (Leica-Novocastra, Великобритания). Для выявления связанных с из учаемыми маркерами кроличьих и мышиных пер вичных антител использовали реагент MACH2- Universal HRP-Polymer ( Biocare Medical, США). Пероксидазную метку выявляли с использованием диаминобензидинового хромогена (DAB+; Dako). После постановки иммуноцитохимических реакций часть срезов подкрашивали 0.5% водным раствором крезилового фиолетового (Dr. Grubler, Германия) и 0.1% водным раствором астрового синего (Merck, Германия). При постановке отдельных и комбинированных иммуногистохимических реакций для конфокальной лазерной микроскопии использовали те же самые первичные антитела, что и для иммунопероксидаз ной реакции. В двойной реакции использовали две комбинации антител - к тирозингидроксилазе/убик витину и B23/убиквитину. После теплового демаски рования антигенов проводили инкубацию с первич ными антителами в течение 65 ч при 270С. В качестве вторичных антител для выявления первичных мы шиных антител использовали моновалентный Fab фрагмент иммуноглобулина осла, меченный био тином (Jackson ImmunoResearch, США). После обработки вторичными антителами препараты инку бировали в растворе стрептавидина, конъюгирован ного с флуорохромом Cy2 (Jackson ImmunoResearch). Для выявления первичных кроличьих антител ис пользовали антитела свиньи против иммуноглобу линов кролика, конъюгированные с тетраметил родаминизотиоцианатом (TRITC), произведенные Dako. Часть препаратов после постановки одиночной реакции на белок B23 подкрашивали ядерным кра сителем 7-AAD (Invitrogen, США). Конфокальную микроскопию проводили с использованием микро скопа LSM 710 (Carl Zeiss, Германия). После проведения иммуноцитохимической реак ции на белок В23 определяли размер ядрышек ней ронов черного вещества. Диаметр ядрышка измеряли с использованием средств компьютерной программы LAS EZ (Leica, Германия). Анализировали ядрыш ки только тех нейронов, в цитоплазме которых четко просматривались гранулы нейромеланина. Измерения были выполнены независимо двумя ис следователями (О.В. Кирик и В.В. Гусельниковой) на двух разных микроскопах Leica DM750 (Leica), укомплектованных камерами ICC50 и ICC50HD (Leica), после проведения дополнительной кали бровки системы с помощью объект-микрометра. Количественные данные обрабатывали в програм ме Excel (Microsoft, США) и представляли в виде среднего значения (X) и стандартного отклонения (σ). Для оценки однородности совокупности рассчитыва ли коэффициент вариации (V). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Во всех случаях в препаратах были обнаружены ядрышки нейронов (как при окраске толуидиновым синим по Нисслю, так и при реакции на белок B23) и убиквитин-иммунопозитивные тельца (рис. 1). Двойная иммунофлуоресцентная реакция на ти розингидроксилазу и убиквитин (рис. 2) показала, что внутриядерные убиквитин-иммунопозитивные тельца действительно присутствуют в дофаминер гических нейронах черного вещества и отсутствуют в нейронах, не проявляющих реакцию на маркерный фермент синтеза катехоламинов - тирозингидрок силазу. Наблюдение ядрышек с использованием реакции на нуклеофосмин (B23) позволило выявить неодно родность их структуры при постоянстве ровных кон туров и округлой формы. Установлено, что для ней ронов черного вещества не характерно присутствие добавочных ядрышек. Все наблюдаемые нейроны содержали только по одному крупному ядрышку, ярко окрашенному при реакции на нуклеофосмин, в котором нередко просматривалась слабоокрашен ная область. Подобную структуру, нередко выявляе мую в ядрышках крупных нейронов, ранее называли ядрышковой вакуолью [18]. Позже было установлено, что она представляет собой гигантский фибрилляр ный центр (GFC), содержащий преимущественно фактор UBF [19]. Интересно, что ядрышки нейронов разных лиц из изученной выборки характеризова лись определенной индивидуальностью в размерах и достаточно низкой вариабельностью размеров (та блица). Изучение ядрышка с использованием конфокаль ной микроскопии подтвердило точность измерений, проведенных на иммунопероксидазных препара тах. При этом была исключена возможность лож ного увеличения размеров изучаемой структуры за счет диффузии хромогена. Установлено, что ги гантский фибриллярный центр, который обычно располагается на периферии ядрышка, достига ет 1-2 мкм в диаметре. Зона GFC характеризуется слабой флуоресценцией при реакции на белок B23, что свидетельствует о пониженной концентрации (но не об отсутствии) данного белка в этом ядрышковом компартменте. В периферической части GFC нередко обнаруживается ярко флуоресцирующая гранула, концентрирующая белок B23 (рис. 3). Проведение двойной реакции на белок B23 и убик витин позволило четко визуализировать ядрышко и тельца Маринеско. Высокая интенсивность флу оресценции при выявлении обоих маркеров обе спечила возможность адекватной трехмерной ре конструкции изучаемых структур как в режиме полупрозрачных объектов, так и в режиме конту рирования их поверхностей (рис. 4). При простран ственной реконструкции ядрышек и телец Маринеско обнаружено, что не все наблюдаемые объекты имеют правильную шаровидную форму. Так, для ядрышек типичной была форма шара или эллипсоида, однако единичные ядрышки имели грушевидную и гантелеобразную формы. Тельца Маринеско характеризовались бóльшим полиморфизмом, но при этом всегда имели четкие контуры (рис. 5). Эти тельца присутствовали в ядрах нейронов в разном количестве (до шести в пределах ядра одной клетки) и занимали различное положе ние относительно ядрышка. Так, тельце могло быть тесно ассоциировано с ядрышком и непосредственно примыкать к его поверхности, однако в большинстве случаев оно располагалось на небольшом расстоянии от ядрышка или было удалено от него. Если одно ядро содержало несколько телец Маринеско, то эти тельца могли быть как удалены друг от друга, так и сгруп пированы, иногда с непосредственным соприкосно вением границ. Локализация нескольких телец отно сительно ядрышка также была различной. Выявлены случаи, когда часть телец непосредственно примыкала к границе ядрышка, в то время как другие были удалены от него. Иногда тельца окружали ядрышко с разных сторон. В ряде случаев все тель ца обнаруживались на значительном расстоянии от ядрышка. Применение метода 3D-реконструкции позволило наблюдать все детали формы выявлен ных телец Маринеско (рис. 5). Полученные ре зультаты свидетельствуют о том, что большин ство идентифицируемых телец имеют правильную округлую, реже - овальную форму. Тем не менее, в ряде случаев отмечено присутствие на поверхно сти выявляемых телец уплощенных или вогнутых участков. Формирование такой сложной структуры поверхности тельца Маринеско может быть след ствием присутствия некой другой структуры, непо средственно примыкающей к поверхности данного тельца. Косвенно это подтверждается полученными нами ранее данными, свидетельствующими о том, что уплощенные или вогнутые участки убиквитин иммунопозитивных телец могут формироваться на их поверхности в местах контакта данных телец с ядрышком [15]. Более того, в нескольких случаях отмечено присутствие убиквитин-иммунопозитив ных телец, примыкающих к поверхности структуры, определенной нами как добавочное ядрышко, на по верхности таких телец в месте примыкания также формировалось уплощение или вогнутость [15]. Тем не менее, при постановке двойной реакции на убик витин и В23 было показано, что в ряде случаев тель ца Маринеско удалены от В23-позитивного ядрышка и при этом все равно имеют сложную форму поверх ности. Это может быть свидетельством присутствия в ядрах нейронов черного вещества других струк тур, с которыми взаимодействуют тельца Маринеско. С другой стороны, неровный контур данных телец в отсутствие ограничивающей мембраны может от ражать динамику макромолекул и быть следстви ем ухода молекул с периферических участков телец Маринеско. Другим важным результатом, полученным при ис пользовании конфокальной микроскопии с послой ным сканированием и 3D-реконструкции, стало подробное описание морфологии особых убиквитин позитивных структур, которые по ряду признаков не могут быть отнесены к тельцам Маринеско, но чет ко выявляются при постановке соответствующей ре акции на убиквитин (см. рис. 5). Эти структуры имеют сравнительно небольшие размеры (до 1 мкм в длину) и разнообразную форму - округлую, овальную, па лочковидную и т.п. Как и тельца Маринеско, данные структуры характеризуются вариабельностью рас пределения в пределах ядра, при этом часто распо лагаясь вблизи типичных телец Маринеско и иногда примыкая к ним. Интересно отметить, что при непосредственном примыкании таких убиквитин-по зитивных структур к типичным тельцам Маринеско на поверхности последних присутствуют уплощен ные или вогнутые участки, обращенные к данной структуре, что косвенно подтверждает предположе ние о неслучайном характере формирования слож ной поверхности телец Маринеско. Вопрос о природе выявленных убиквитин-иммунопозитивных струк тур, не являющихся тельцами Маринеско, остается открытым. С этой точки зрения интересны данные, представленные Lafarga M. и соавт., которые вы явили (с применением конфокальной и электрон ной микроскопии) в ядрах нескольких типов клеток особые структуры, названные кластосомами [20]. Согласно [20], эти внутриядерные структуры содер жат убиквитин в высокой концентрации и являют ся местом разрушения различных белков. При этом присутствие в ядрах клеток кластосом определяется интенсивностью процессов протеасомной деграда ции в клетке - чем более они интенсивны, тем более выражены кластосомы [20]. Данное обстоятельство могло бы объяснить обнаруженное нами присутствие убиквитин-позитивных структур лишь в отдельных нейронах черного вещества на фоне их отсутствия в большинстве клеток различным функциональным состоянием анализируемых нейронов. Изучение колокализации двух белков (убиквити на и B23) в ядрышках дофаминергических нейронов и тельцах Маринеско показало, что в ядрышках при сутствует белок В23, а убиквитин отсутствует. Белок В23 никогда не колокализуется в ядрышке с убик витином. Даже когда убиквитин-иммунопозитивные тельца непосредственно контактируют с ядрышком (см. рис. 4Б), зона кажущейся колокализации не пре вышает величины разрешения использованного обо рудования (0.2 мкм). В противоположность ядрыш ку, в тельцах Маринеско колокализация убиквитина и белка B23 хотя и не типична, но возможна (рис. 6). При этом флуоресценция B23 существенно слабее, чем в области интенсивно окрашенных зон ядрыш ка, и сопоставима с флуоресценцией области GFC. Идентификация в ядрах нейронов телец, в которых белок В23 присутствует и колокализован с убикви тином, ставит вопрос о природе данных структур. Опубликованы данные о том, что убиквитин (вме сте с убиквитин-подобными белками) играет важ ную роль не только в процессах внутриклеточной деградации белков, но и в биогенезе рибосом [16], что предполагает присутствие этого белка в составе ядрышек. Однако, как видно из рис. 6, идентифици рованная В23/убиквитин-иммунопозитивная струк тура характеризуется неправильной формой, отсут ствием внутренней структурированности и области GFC, в связи с чем она не может быть определена как ядрышко, особенно учитывая представленные выше данные об отсутствии добавочных ядрышек в дофаминергических нейронах черного вещества. Особенности формы и размеров выявленных телец, а также присутствие в них убиквитина в высокой концентрации скорее свидетельствуют в пользу того, что данные внутриядерные структуры пред ставляют собой специфическую разновидность телец Маринеско, содержащих белок В23. Однако нельзя исключать и возможность того, что обнаруженные В23/убиквитин-иммунопозитивные структуры яв ляются самостоятельными внутриядерными вклю чениями, не имеющими отношения ни к тельцам Маринеско, ни к кластосомам. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ядрах дофаминергических нейронов черного вещества человека присутствует несколько видов структур, содержащих исследованные белки и име ющих разнообразную форму. Относительно малыми размерами (до 2 мкм в диаметре), правильной фор мой и расположением вблизи ядрышка характери зуются структуры, подобные кластосомам. На раз личном расстоянии от ядрышка располагаются более крупные (чаще 2-4 мкм в диаметре) полиморфные тельца Маринеско, среди которых определяются атипичные структуры, содержащие как убиквитин, так и белок B23. Наиболее крупной и постоянной структурой ядра является ядрышко. Нами показана мономорфность и стабильность размеров ядрышек нейронов черного вещества человека. Установлено, что для ядрышка дофаминергических нейронов ха рактерно присутствие гигантского фибриллярно го центра (GFC), ранее детально изученного толь ко в нейронах лабораторных животных. Показано, что в составе GFC человека, в отличие от GFC крысы, обнаруживается непостоянная микроструктура, со держащая белок В23. Все перечисленные факты содержат новую ин формацию о дофаминергических нейронах мозга человека. Дальнейшие исследования в этой обла сти, направленные на изучение пространственной взаимосвязи ядрышка и телец Маринеско с другими внутриядерными структурами (тельцами Кахаля, PML-тельцами, ядерными спеклами), а также из учение динамики данных структур при развитии нейродегенерации позволят сделать вывод о во влеченности внутриядерных структур в регуляцию функционального состояния катехоламинергиче ских нейронов. Изучение особенностей распреде ления белков, входящих в состав данных структур, в норме и при патологии может способствовать об наружению новых молекулярных маркеров про цесса нейродегенерации. Анализ внутриядерных структур нейронов, устойчивых к повреждающим факторам, позволит сделать вывод о наличии (или отсутствии) взаимосвязи между особенностями вну триядерных включений и избирательной чувстви тельностью дофаминергических нейронов черной субстанции к повреждению.

Об авторах

Д. Э. Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: guselnicova.valeriia@yandex.ru
Россия

В. В. Гусельникова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: guselnicova.valeriia@yandex.ru
Россия

O. В. Кирик

Институт экспериментальной медицины

Email: guselnicova.valeriia@yandex.ru
Россия

E. Г. Сухорукова

Институт экспериментальной медицины

Email: guselnicova.valeriia@yandex.ru
Россия

И. П. Григорьев

Институт экспериментальной медицины

Email: guselnicova.valeriia@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы