Том 15, № 4 (2023)

Митохондриальные болезни, вызываемые мутациями в ядерных генах, входят в большую группу наследственных заболеваний, при которых наблюдается угнетение энергетического обмена. Эти заболевания представляют особый интерес, поскольку ядерные гены кодируют не только большинство структурных белков системы окислительного фосфорилирования (OXPHOS), но и все белки, участвующие в их импорте из цитоплазмы и сборке в митохондриях. Дефекты в любом из этих белков могут привести к функциональному нарушению работы дыхательной цепи, включая дисфункцию комплекса I, играющего центральную роль в процессах клеточного дыхания и окислительного фосфорилирования, что является наиболее частой причиной митопатологий. Митохондриальные болезни проявляются в раннем возрасте и характеризуются прогрессирующим течением и поражением, в первую очередь, энергоемких тканей и органов. Терапию митохондриальных болезней необходимо начинать как можно раньше, однако их диагностика затрудняется гетерогенностью заболеваний и перекрыванием спектров их клинических проявлений. Для понимания молекулярного патогенеза митохондриальных болезней создают животные модели, т.е. животных с мутациями, проявления которых напоминают симптомы митопатологий человека. Использование животных моделей открывает новые возможности в исследовании функций генов, кодирующих митохондриальные белки, молекулярных механизмов возникновения и развития митопатологий, что необходимо для усовершенствования диагностики и разработки подходов к лекарственной терапии. В представленном обзоре суммированы и сопоставлены современные сведения о митохондриальных заболеваниях, вызванных мутациями в ядерных генах, и животных моделях, созданных для их изучения.

Развитие микроскопии обеспечило серьезный прорыв в биологических исследованиях на рубеже 20–21 вв. Световая флуоресцентная микроскопия с суперразрешением позволила визуализировать субклеточные структуры вплоть до локализации в них отдельных молекул и их взаимного расположения на масштабах десятков нанометров, а современная электронная микроскопия дала возможность изучать строение белковых комплексов с разрешением, приближающимся к атомному, в их нативном внутриклеточном окружении. Однако и флуоресцентная, и электронная микроскопия не преодолели своих естественных ограничений – зависимости от меток и жестких требований к объему образца соответственно. На роль метода, компенсирующего эти ограничения, претендует микроскопия в мягком рентгеновском диапазоне. Этот метод позволяет наблюдать всю совокупность субклеточных структур в состоянии, близком к нативному, без химической фиксации и применения меток, с изотропным разрешением порядка 40–70 нм, перекрывая пусть и сокращающийся, но все еще существующий зазор в разрешающей способности между световой и электронной микроскопией, при этом сочетаясь с первой и, потенциально, со второй. Настоящий обзор ставит своей целью рассмотреть вклад и вычленить принципиально новые возможности, которые уже дала биологическая микроскопия в мягком рентгеновском диапазоне, проанализировать особенности этого метода и оценить потенциальные направления его дальнейшего развития применительно к клеточно-биологическим исследованиям.

В представленном обзоре на примере двух наиболее распространенных типов патологии зрительной системы – наследственной оптической нейропатии и ретинопатии – рассмотрены in vitro моделирование этих заболеваний с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), а также подходы к разработке терапевтических стратегий. При нейропатиях наблюдаются дегенерация ганглиозных клеток сетчатки и атрофия зрительного нерва, а при ретинопатиях поражаются фоторецепторы или клетки пигментного эпителия сетчатки. ИПСК человека могут служить моделью для изучения патологических основ этих заболеваний и механизмов восстановления зрительных функций. В последние годы достигнут значительный прогресс в создании ганглиозных и ретинальных органоидов из ИПСК, опубликованы данные о потенциале ИПСК для моделирования оптических нейропатий, таких, как глаукома, нейропатия Лебера и др., в том числе и при разработке терапевтических подходов с использованием инструментов генетического редактирования.

Одной из проблем регенеративной медицины является образование гипертрофических и келоидных рубцов. Известно, что протеинкиназа RIPK3 участвует в некроптозе, при этом появляются данные в пользу ее неканонических функций, в том числе в развитии фиброза почек. В представленной работе изучена экспрессия RIPK3 в модели фибротических процессов в коже мыши и человека. Показано, что в келоидном рубце человека, а также в ране мыши присутствует субпопуляция RIPK3+Vim+-клеток, причем в раневом ложе мыши таких клеток достоверно больше, чем в нормальной коже. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) экспрессия Ripk3, а также биомаркеров фибробластов Acta2, Fap, Col1a1 и Fn1 выявлена в клетках, выделенных из раневого ложа, что свидетельствует о возможном синтезе RIPK3 фибробластами раневого ложа. Показано увеличение интенсивности флуоресценции фибробластов человека, окрашенных антителами к RIPK3, под воздействием липополисахарида (ЛПС, 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл) и TGF-β (0.1, 1, 2, 5 нг/мл) по сравнению с контролем. В то же время уровень экспрессии RIPK3 и маркеров активации фибробластов на уровне генов под воздействием TGF-β и ЛПС не отличался достоверно от контроля. Возможно, экспрессия RIPK3 в раневых фибробластах не связана напрямую с фибротическими процессами, и RIPK3 играет другую, пока неизвестную, роль в заживлении ран.

Пандемия коронавирусной инфекции COVID-19 позволила по-новому оценить угрозу, исходящую от коронавирусов, и перейти к фундаментальному анализу этого семейства и поиску эффективных противоковидных препаратов. Идут работы по актуализации вакцин против COVID-19 и продолжается поиск низкомолекулярных противоковидных препаратов-кандидатов на лекарство для амбулаторного назначения. Обсуждаются возможности и способы ускорения разработки противовирусных препаратов против других патогенов в рамках подготовки к следующей пандемии. В 2012–2015 гг. Н.Г. Цышкова и соавт. синтезировали группу близких по химической структуре к арбидолу водорастворимых низкомолекулярных соединений, обладающих противовирусной активностью. Среди них ряд соединений на основе аминоалкиловых эфиров 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты. Из этой довольно обширной группы соединений достоверным противовирусным эффектом в отношении SARS-CoV-2 в исследованиях in vitro обладал только один – дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)-3-(2-диэтиламиноэтокси)карбонилиндола. В концентрации 52.0 мкМ данное соединение полностью ингибирует репродукцию вируса SARS-CoV-2 с инфекционной активностью 10⁶ ТЦИД₅₀/мл. Концентрационные зависимости свидетельствуют о специфичности действия исследуемого соединения. Выявлена интерферон-индуцирующая активность; обнаружено подавление синцитиеобразования, индуцированного шиповидным белком (S-гликопротеином) SARS-CoV-2, на 89%. Указанное соединение с учетом его синтетической доступности, высокой активности (IC₅₀ = 1.06 мкг/мл) и высокого индекса селективности (SI = 78.6) отвечает требованиям, необходимым для разработки противовирусного средства для профилактики и лечения COVID-19.

Несмотря на значительный потенциал фотодинамической терапии (ФДТ) как малоинвазивного способа лечения, применение данного метода в онкологии имеет свои ограничения, такие, как 1) ограниченная глубина проникновения возбуждающего света вглубь ткани, что лишает возможности воздействовать на опухоли, локализующиеся глубоко в организме; 2) использование в качестве фотосенсибилизаторов химических медленно биодеградируемых молекул, что приводит к светоактивируемым фотодерматозам и гипертермии у пациентов. Для решения обозначенных проблем в данной работе предложена полностью биосовместимая адресная система для ФДТ без внешнего источника света, работающая на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) от окисленной формы люциферазного субстрата к белковой молекуле фотосенсибилизатора SOPP3. BRET-активируемая система представлена мультимодальным белком DARP-NanoLuc-SOPP3, который содержит помимо BRET-пары NanoLuc-SOPP3 адресный модуль DARPin, обеспечивающий тропность данного белка к опухолям, сверхэкспрессирующим рецептор второго типа эпидермального фактора роста человека (HER2). В опытах in vitro и на модели 3D-сфероидов доказана фотоиндуцируемая без внешнего источника света цитотоксичность данной системы в отношении HER2-положительных клеток аденокарциномы рака яичника человека. Кроме того, в опытах на животных с подкожными HER2-положительными опухолями показано селективное накопление DARP-NanoLuc-SOPP3 в опухолевом очаге. Предложенная полностью биосовместимая система для адресной BRET-индуцированной терапии позволяет преодолеть: 1) необходимость во внешнем источнике излучения; 2) побочный фототоксический эффект от аберрантного накопления химических ФС. Полученные результаты демонстрируют большой потенциал полностью белковой самовозбуждающейся BRET-системы для адресной ФДТ.