Отправить статью по E-mail Бактериоцин микробиоты ротовой полости енотовидной собаки подавляет рост метициллинрезистентного патогена Staphylococcus aureus
- Авторы: Баранова М.Н.1, Соболева Е.А.1, Корниенко М.А.2, Малахова М.В.2, Мокрушина Ю.А.1,3, Габибов А.Г.1,3, Терехов С.С.1, Смирнов И.В.1,3
-
Учреждения:
- Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)
- Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина федерального медико-биологического агентства»
- Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
- Выпуск: Том 16, № 4 (2024)
- Страницы: 105-108
- Раздел: Краткие сообщения
- Дата подачи: 11.12.2023
- Дата принятия к публикации: 18.11.2024
- Дата публикации: 09.12.2024
- URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/27349
- DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.27349
- ID: 27349
Цитировать
Аннотация
Глобальное распространение антибиотикорезистентности патогенных бактерий является одной из ключевых проблем XXI века. Разработка новых технологических платформ, основанных на анализе антибактериальной активности индивидуальных представителей микробиома, позволила проводить широкомасштабный поиск антимикробных агентов различного механизма действия. Ввиду своей малой изученности, микробиом диких животных можно рассматривать как естественный резервуар биоразнообразия для поиска новых антибиотиков. В данной работе с использованием микрофлюидной технологии ультравысокопроизводительного скрининга из микробиома ротовой полости енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides) выделен штамм бактерии Staphylococcus pseudintermedius E18, с высокой эффективностью подавляющий рост метициллинрезистентного патогена S. aureus (MRSA). Показано, что основным действующим веществом штамма S. pseudintermedius E18 является бактериоцин с молекулярной массой 27 кДа, обладающий высоким положительным зарядом и чрезвычайно узким спектром активности. Бактериоцин S. pseudintermedius E18 инактивировался под действием повышенной температуры, протеиназы К и EDTA. Дальнейшие исследования структуры бактериоцина S. pseudintermedius E18 позволят понять механизм его антимикробного действия, что открывает перспективы разработки новых антимикробных препаратов белковой природы.
Полный текст
Поиск новых противомикробных препаратов необходим, поскольку бактерии постоянно эволюционируют, приобретая устойчивость к новым антибиотикам [1]. Использование новых платформ, задействующих методы метаболомики, геномного и транскриптомного секвенирования с последующим биоинформатическим анализом, а также внедрение альтернативных способов культивирования микроорганизмов открывают новые возможности для скрининга антибиотической активности природных соединений.
Микробиомы животных представляют собой уникальный резервуар для поиска новых антимикробных агентов [2–4]. Пробиотические микроорганизмы привлекают особый интерес в качестве потенциальных продуцентов антибиотиков [5, 6]. Несмотря на то, что пробиотические штаммы и бактерии-комменсалы могут оказывать непрямое действие на микробиом, влияя на иммунную систему хозяина [7] или продуцируя функционально значимые ферменты [8], для большинства бактериоцинов характерен механизм прямого убийства патогенов.
В этой работе c целью выделения штаммов-продуцентов веществ, обладающих антимикробной активностью в отношении золотистого стафилококка и идентификации метаболитов, обуславливающих их антагонистические свойства, проведен ультравысокопроизводительный скрининг микробиома слюны енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides).
Ранее нами была описана платформа ультравысокопроизводительного скрининга микробных сообществ (рис. 1) [2, 9], основанная на культивировании одиночных клеток микроорганизмов с репортерным штаммом бактерий в изолированных каплях двойной эмульсии с последующим выделением активных фенотипов методом флуоресцентно-активируемой клеточной сортировки. Эту платформу применили для профилирования микробиома ротовой полости енотовидной собаки и выявления штаммов, активных в отношении золотистого стафилококка.
Рис. 1. Схема платформы ультравысокопроизводительного скрининга для отбора микроорганизмов, ингибирующих рост бактерии-мишени
В результате скрининга получили шесть фенотипически различных штаммов, воспроизводимо ингибирующих рост Staphylococcus aureus на агаризованной среде BHI и в жидкой культуре (активность оценивали методом двухкратных серийных разведений). Штаммы идентифицировали методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MC) (табл. 1).
Таблица 1. Масс-спектрометрическая идентификация и антагонистическая активность отобранных штаммов бактерий-продуцентов в отношении золотистого стафилококка
Штамм | Микроорганизм | Зоны ингибирования роста S. aureus, | Максимальная активность в жидкой культуре | |
Кратность | Время | |||
Е14 | Bacillus pumilus | 11 ± 2 | 61 ± 9 | 2 |
Е18 | Staphylococcus pseudintermedius | 5 ± 1 | 256 ± 47 | 4 |
Е32 | Bacillus amyloliquefaciens | 4* ± 1 | 5 ± 1 | 2 |
ЕВ10 | Pasteurella dagmatis | 0.9 ± 0.1 | 8 ± 1 | 8 |
ЕВ16 | Ralstonia insidiosa | 3.1 ± 0.4 | - | - |
ЕВ27 | Curtobacterium luteum | - | 4 ± 1 | 1 |
ЕВ30 | Brachybacterium sp. | - | 2.1 ± 0.5 | 1 |
*Диффузная зона ингибирования.
Наибольшей активностью в отношении S. aureus в жидкой среде обладал штамм S. pseudintermedius Е18 (рис. 2А). Для наработки и идентификации активного вещества проведен более подробный анализ динамики антагонистического действия штамма-продуцента (рис. 2Б).
Рис. 2. Фенотип штамма-продуцента Е18 на агаризованной среде BHI (А) и анализ динамики продукции метаболитов, ингибирующих рост S. aureus (Б)
Для очистки активного соединения применили твердофазную экстракцию с использованием сорбента LPS-500 (табл. 2). Большая часть вещества не могла быть элюирована повышением содержания ацетонитрила в буферном растворе при pH 5.0, для элюции использовали 0.1% трифторуксусную кислоту (TFA) в водном растворе ацетонитрила.
Таблица 2. Очистка соединения, продуцируемого штаммом Е18, методом импульсной твердофазной экстракции с использованием сорбента LPS-500
Буферный раствор | А | Б | А + В, %В | ||
40 | 70 | 100 | |||
Активность по ингибирующему разведению, % от нанесенной пробы | 2 ± 1 | 9 ± 1 | 12 ± 3 | 68 ± 7 | 11 ± 2 |
Примечание. Буфер А: 10 мМ NH4OAc, 5% ацетонитрил, pH 5.0; буфер Б: 10 мМ NH4OAc, 80% ацетонитрил, pH 5.0; буфер В: 0.1% TFA, 80% ацетонитрил.
Инкубация соединения, продуцируемого штаммом E18, в течение 1.5 ч при 60°С приводила к утрате его антибиотической активности. В связи с термолабильностью и характером элюции при твердофазной экстракции была выдвинута гипотеза о высокомолекулярной природе вещества. Активные образцы среды культивирования с добавлением 50 мМ фосфата натрия с pH 7.5 подвергали действию протеиназы К (0.1 мг/мл). После 3 ч инкубации при 37°С наблюдалась полная потеря ингибирующей активности в отношении S. aureus. Ввиду предположительно белковой природы соединения для его дальнейшей очистки использовали соответствующие методы.
Первая стадия очистки включала ионообменную хроматографию с использованием сорбента SP-sepharose (табл. 3).
Таблица 3. Очистка соединения, продуцируемого штаммом Е18, методом катионообменной хроматографии с использованием сорбента SP-sepharose
Содержание буфера Б, % | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
Активность по ингибирующему | 6 ± 5 | 2 ± 1 | 15 ± 3 | 26 ± 7 | 21 ± 5 | 11 ± 2 |
Примечание. Буфер А: 10 мМ NH4OAc, pH 6.0; буфер Б: 10 мМ NH4OAc, 1 M NaCl, pH 6.0. Для дальнейшей работы использовали фракции, соответствующие 60 и 80% содержания буфера Б (600 и 800 мМ NaCl).
На второй стадии очистки использовали хроматографическую колонку Heparin-sepharose (GE Healthcare, США), буферные растворы А (20 мМ HEPES, pH 7.0) и Б (20 мМ HEPES, 1 M NaCl, pH 7.0) со скоростью потока 1 мл/мин. Элюцию проводили линейным градиентом буфера Б, 20 мин (рис. 3А,Б). Время удержания косвенно свидетельствовало о высоком положительном заряде белка.
Рис. 3. Хроматографическая очистка белка, определяющего антибиотическую активность штамма S. pseudintermedius Е18. Красным обозначены фракции, обладающие наибольшей антибактериальной активностью. А – репрезентативная хроматограмма, полученная при фракционировании активных метаболитов S. pseudintermedius E18 с использованием смолы Heparin-sepharose. Б – репрезентативные электрофореграммы (15% ПААГ). Очистка белка методом хроматографии с использованием сорбента SP-sepharose и последующая очистка с использованием колонки Heparin-sepharose. В – репрезентативная электрофореграмма. Фракции, полученные в результате очистки белка методом гель-фильтрации с использованием колонки Superdex 75
На третьей стадии очистки применяли гель-фильтрационную хроматографию с использованием колонки Superdex 75 и буферного раствора 20 мМ HEPES, 250 мМ NaCl, pH 7.0 со скоростью 0.4 мл/мин. Активность соответствовала белку размером приблизительно 27 кДа (рис. 3В), время удержания составило приблизительно 23 мин.
Очищенный белок использовали для функциональных исследований. Минимальная ингибирующая концентрация этого белка в отношении S. aureus составила 0.05 ± 0.02 мкг/мл. Полученный бактериоцин оказался высокоспецифичным – МИК в отношении Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Streptococcus pneumoniae и Bacillus cereus была выше 10 мкг/мл, что свидетельствует об отсутствии антимикробной активности.
Таким образом, штамм S. pseudintermedius продуцирует бактериоцин III класса – термолабильный полипептид размером 27 кДа, ингибирующий рост бактерий, рода Staphylococcus [10–12]. Бактериоцины III класса включают бактериолизины, тайлоцины и нелитические белки. Наиболее изученным подклассом являются бактериолизины. Известные представители бактериолизинов относятся к металл-зависимым протеазам, катализирующим гидролиз пептидных мостиков или стволовых пептидов в пептидогликане бактерии-мишени [12]. Было выдвинуто предположение, что выделенный из S. pseudintermedius белок также является пептидогликан-гидролазой. Инкубация белка в течение 15 мин при 25°С в присутствии 10 мМ EDTA приводила к полной потере его активности. Таким образом, вещество, обеспечивающее антистафилококковую активность штамма S. pseudintermedius, является металл-зависимым ферментом, что характерно для бактериолизинов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Развитие резистентности к антибиотикам у патогенных бактерий привело к возобновлению интереса к противомикробным средствам, разрушающим бактериальные мембраны и клеточные стенки [13]. В результате ультравысокопроизводительного скрининга микробиоты енотовидной собаки обнаружен штамм бактерии S. pseudintermedius E18. Посредством хроматографического фракционирования показано, что этот штамм продуцирует антимикробный агент, являющийся литическим ферментом.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-14-00331.
Об авторах
М. Н. Баранова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)
Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997
Е. А. Соболева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)
Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997
М. А. Корниенко
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина федерального медико-биологического агентства»
Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 119435
М. В. Малахова
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина федерального медико-биологического агентства»
Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 119435
Ю. А. Мокрушина
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН); Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
Email: ivansmr@inbox.ru
Faculty of Chemistry
Россия, Москва, 117997; Москва, 119991А. Г. Габибов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН); Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
Email: ivansmr@inbox.ru
Faculty of Chemistry
Россия, 117997, Москва; Москва, 119991С. С. Терехов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)
Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997
И. В. Смирнов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН); Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
Автор, ответственный за переписку.
Email: ivansmr@inbox.ru
Faculty of Chemistry
Россия, Москва, 117997; Москва, 119991Список литературы
- https://www.who.int/news/item/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed.
- Terekhov S.S., Smirnov I.V., Malakhova M.V., Samoilov A.E., Manolov A.I., Nazarov A.S., Danilov D.V., Dubiley S.A., Osterman I.A., Rubtsova M.P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018. V. 115. № 38. P. 9551–9556.
- Adnani N., Rajski S.R., Bugni T.S. // Nat. Prod. Rep. 2017. V. 34. № 7. P. 784–814.
- Akbar N., Siddiqui R., Sagathevan K.A., Khan N.A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019. V. 103. № 10. P. 3955–3964.
- Pereira W.A., Mendonça C.M.N., Urquiza A.V., Marteinsson V.Þ., LeBlanc J.G., Cotter P.D., Villalobos E.F., Romero J., Oliveira R.P.S. // Microorganisms. 2022. V. 10. № 9. P. 1705.
- Liao S.F., Nyachoti M. // Anim. Nutr. 2017. V. 3. № 4. P. 331–343.
- Liang L., Yang C., Liu L., Mai G., Li H., Wu L., Jin M., Chen Y. // Microb. Cell Fact. 2022. V. 21. № 1. P. 88.
- El-Saadony M.T., Alagawany M., Patra A.K., Kar I., Tiwari R., Dawood M.A.O., Dhama K., Abdel-Latif H.M.R. // Fish Shellfish Immunol. 2021. V. 117. P. 36–52.
- Terekhov S.S., Smirnov I.V., Stepanova A.V., Bobik T.V., Mokrushina Y.A., Ponomarenko N.A., Belogurov A.A., Rubtsova M.P., Kartseva O.V., Gomzikova M.O., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114. № 10. P. 2550–2555.
- Meade E., Slattery M.A., Garvey M. // Antibiotics. 2020. V. 9. № 1. P. 32.
- Heng N.C.K., Tagg J.R. // Nat. Rev. Microbiol. 2006. V. 4. № 2. P. 160.
- Zimina M., Babich O., Prosekov A., Sukhikh S., Ivanova S., Shevchenko M., Noskova S. // Antibiotics. 2020. V. 9. № 9. P. 553.
- Bush K. // Rev. Sci. Tech. 2012. V. 31. № 1. P. 43–56.
Дополнительные файлы
