Связь экспрессии изоформ аденозинкиназы и эктонуклеотидаз CD39/CD73 в крови больных колоректальным раком

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Роль внеклеточного аденозина в микроокружении опухоли хорошо изучена [1]. Аденозин может регулировать врожденные и адаптивные иммунные реакции [2], снижая действие эффекторного звена и стимулируя иммуносупрессорное звено. Поэтому внеклеточный аденозин представляет собой барьер для противоопухолевой иммунотерапии. Терапевтический потенциал блокады ферментов – эктонуклеотидаз CD39 (эктонуклеозидтрифосфат-дифосфогидролаза, ENTPD1) и CD73 (экто-5’-нуклеотидаза, 5’NT), расщепляющих ATP до аденозина, а также ингибирование аденозиновых рецепторов (в основном A2a) показан в доклинических исследованиях и проходит проверку на I/II стадиях клинических испытаний для онкологических больных [3]. Однако пока не удалось добиться эффективности, ожидаемой по результатам доклинических исследований [4].

Многочисленные пути, управляющие балансом АТР и аденозина, остаются недостаточно хорошо изученными. При разработке подходов к блокаде аденозинового сигнального пути слабо учитывается внутриклеточная регуляция аденозина. В последнее время обсуждается не только «классический» путь образования внеклеточного аденозина из АТP эктонуклеотидазами CD39-CD73, но и роль альтернативного пути, в котором участвует внеклеточный никотинамидадениндинуклеотид (NAD⁺), в прогрессии рака [5]. Поэтому актуальным представляется изучение и других компонентов метаболизма аденозина в условиях развития опухоли.

Концентрация аденозина регулируется аденозинконвертирующими ферментами: аденозинкиназой (ADK) и аденозиндезаминазой [6, 7]. ADK добавляет остаток фосфорной кислоты к аденозину и превращает его в АМР. Аденозиндезаминаза удаляет аминогруппу с молекулы аденозина с образованием инозина. Кроме того, уровень аденозина может регулироваться путем его доставки во внеклеточное пространство через двунаправленные переносчики нуклеотидов.

Особый интерес представляет аденозинкиназа, которая регулирует доступность аденозина и является важным звеном сложных гомеостатических и метаболических сетей [8]. Баланс аденозина и ADK строго поддерживается в здоровых клетках, а изменения экспрессии этого фермента приводят к разной степени активации аденозиновых рецепторов, что часто и определяет роль ADK в развитии патологий [9]. ADK участвует не только в метаболизме пуринов, но и в регуляции трансметилирования. Показана связь экспрессии ADK с метилированием ДНК. Использование специфических ингибиторов ADK может дозозависимо снижать уровень глобального метилирования ДНК в клетках HeLa [10]. ADK человека представлена двумя изоформами, которые отличаются молекулярной массой и, предположительно, функциями. Короткая изоформа, ADK-S, находится в цитоплазме. Она обеспечивает рутинное метаболическое удаление аденозина в нормальных условиях путем его фосфорилирования с образованием АМР. Основная функция ADK-S состоит в регуляции уровня внеклеточного тканевого аденозина. Длинная изоформа ADK-L локализуется в ядре и биохимически напрямую связана с S-аденозилметионин-зависимым путем трансметилирования, который управляет метилированием ДНК и гистонов. Высокий уровень и активность ADK-L связаны с повышенным глобальным метилированием ДНК [1].

Роль ADK в развитии рака изучена недостаточно. Результаты проведенных исследований [10–15] указывают на потенциальную роль ADK в канцерогенезе, в частности колоректального рака (КРР) [14], рака молочной железы [15] и печени [12]. На возможность участия ADK в развитии опухоли указывает также связь ADK с клеточной пролиферацией в процессе онтогенеза и c ангиогенезом, а также изменения в экспрессии этого фермента в опухолевой ткани и его ассоциация с эпигенетической регуляцией [8].

КРР – одно из распространенных злокачественных заболеваний, входит в число основных причин смертности от рака. Значимую роль в патогенезе КРР отводят аденозинергическому пути [16], тесно связанному с супрессией адаптивного иммунитета. Однако связь ADK с иммунными механизмами при КРР не исследована.

В связи с этим цель исследования состояла в изучении уровня мРНК ADK, ADK-L, ADK-S и его связи с содержанием Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD39/CD73, в периферической крови больных КРР.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалом для исследования служила венозная кровь, собранная из локтевой вены натощак в пробирки с антикоагулянтом К3EDТА. В работе про­анализирован 31 образец крови пациентов в возрасте 65 ± 12.4 лет с аденокарциномой толстой кишки в основном (91%) умеренной степени дифференцировки. Диагноз у всех пациентов установлен на основании клинико-инструментального обследования и подтвержден гистологически. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1. Критериями включения пациентов в исследование были возраст старше 18 лет и подтвержденный диагноз рака толстой кишки.

 

Таблица 1. Характеристика участников исследования

Показатель		Больные КРР	Здоровые доноры
Количество		31	17
Пол	М	11 (35.5%)	6 (35.3%)
	Ж	20 (64.5%)	11 (64.7%)
Возраст, медиана(min–max)		65.0 лет(45–78 лет)	55.0 лет(28–79 лет)
Стадия КРР	1–2	16 (51.6%)	–
	3–4	15 (48.3%)
Степень дифференцировки опухоли	G1	3 (9.7%)	–
	G2	23 (74.2%)
	G3	5 (16.1%)

 

Критериями исключения были неоадъювантная терапия, аутоиммунные и воспалительные заболевания в последние 3 месяца. В качестве контроля проанализированы 17 образцов крови здоровых лиц соответствующего возраста (56.10 ± 17.70 лет). Исследование проведено согласно требованиям Хельсинкской декларации 2013 г. и одобрено Комитетом по медицинской этике при Министерстве здравоохранения и социального развития Республики Карелия и Петрозаводском государственном университете (протокол № 25 от 12.02.2013 г.). Все обследованные лица подписали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование выполнено с использованием приборной базы Центра коллективного пользования научным оборудованием ИБ КарНЦ РАН.

Анализ экспрессии генов

Суммарную РНК выделяли из крови с помощью реагента TRIzol LS (ThermoFisher Scientific, США) и очищали от примесей ДНК, обрабатывая образцы ДНКазой I (Lucigen, США). Количество и качество полученной РНК оценивали на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio-Rad, США). Синтез кДНК выполняли с использованием случайных гексапраймеров и обратной транскриптазы MMLV («Евроген»). Амплификацию кДНК, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени проводили с использованием реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I («Евроген») в соответствии с инструкцией производителя на приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 (Bio-Rad, США) в двух повторах и c контролем без матрицы. Экспрессию интересующих генов нормировали по экспрессии референсного гена GAPDH. Праймеры, использованные для оценки экспрессии генов ADK, ADK-L, ADK-S, A2AR, CD39 и СD73 («Синтол»,), представлены в табл. 2. Оптимальную температуру отжига подбирали постановкой температурного градиента. Для ADK, ADK-L, ADK-S: денатурация кДНК 5 мин, 95°С; 40 циклов: денатурация – 95°С, 30 с; отжиг – 61°С, 30 с; элонгация – 72°С, 30 с. Для A2AR, CD39 и СD73: денатурация кДНК 5 мин, 95°С; 40 циклов: денатурация – 95°С, 30 с; отжиг – 64°С, 30 с; элонгация – 72°С, 30 с. Специфичность ПЦР контролировали с помощью анализа кривых плавления. Относительный уровень экспрессии генов рассчитывали методом 2^–∆∆Ct, где Сt – пороговый цикл, а ΔСt – разница между значениями пороговых циклов для референсного и таргетного генов. Итоговый уровень экспрессии генов рассчитывали относительно уровня в контроле (здоровые доноры), принимая величину экспрессии каждого исследуемого гена в контроле за единицу. Данные представлены в относительных единицах, рассчитывали среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M ± SE).

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в работе

Ген	Праймер 5’ → 3’
	Прямой	Обратный
ADK	TTACTACGAGCAGAATGAGCAG	TGGCAGCAGCAAGATTAGC
ADK-L	TGTAGAGCCAAAGTGGGGTG	GCCTCCACCTTCAGCTTTTTG
ADK-S	AAGCAGTTGCTGTGGTACCTG	AGCAGAGGATTTCCCATTCCA
A2AR	CTTGGGTTCTGAGGAAGCAG	CAGCAGCTCCTGAACCCTAG
CD39	AGCAGCTGAAATATGCTGGC	GAGACAGTATCTGCCGAAGTCC
CD73	ATTGCAAAGTGGTTCAAAGTCA	ACACTTGGCCAGTAAAATAGGG
GAPDH	GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAG	GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT

 

Проточная цитофлуориметрия

Образцы цельной крови окрашивали антителами и затем инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте в соответствии с протоколом производителя. Эритроциты лизировали реагентом BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences, США). В работе использовали следующие моноклональные антитела: CD3-PC5 (клон UCHT1), CD4-FITC (клон OKT4), CD4-PC7 (клон OKT4), CD8-PC7 (клон RPA-T8), CD25-PC5 (клон BC96), CD127-PC7 (клон EBIORDR5), CD73-PE (клон AD2), CD39-PE (клон EBIOA1), CD39-FITC (клон EBIOA1) (eBioscience, США), а также соответствующие им изотипические контроли. Все события получены на цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). В каждом образце анализировали не менее 30000 событий в лимфоцитарном гейте, основанном на прямом и боковом светорассеянии. Данные представлены в виде M ± SD.

Статистический анализ

Статистическая обработка материала и расчет показателей проведены с использованием программы GraphPad Prism v.7. Значимость различий между количественными показателями вычисляли, используя непараметрический критерий Манна–Уитни. Различия считали значимыми при р < 0.05. Степень взаимосвязи параметров оценивали с помощью корреляционного анализа по Спирмену.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Уровень экспрессии мРНК аденозинкиназы в периферической крови больных КРР

Опубликованы данные об экспрессии гена ADK в ткани КРР [14], однако не известно, как экспрессируется ген ADK и его изоформы в периферической крови больных КРР и как он связан с клиническими признаками заболевания. Нами оценено относительное содержание мРНК гена ADK и его изоформ в периферической крови пациентов с КРР. Сравнение группы больных КРР и здоровых доноров выявило пониженный уровень мРНК ADK-L (p = 0.002) при КРР. Содержание мРНК гена ADK и изоформы ADK-S не отличалось от содержания в контрольной группе. Показано, что в образцах крови больных с III–IV стадиями КРР уровень мРНК ADK-L снижен (p < 0.001) по сравнению со здоровыми донорами (рис. 1). При этом различия между уровнями мРНК ADK-L у больных на начальных стадиях заболевания (I–II стадии) и в контрольной группе не имели статистической значимости. Содержание мРНК гена ADK и изоформы ADK-S в образцах крови больных с начальными и поздними стадиями КРР также было приближено к уровню у здоровых лиц.

 

 

Рис. 1. Изменение относительного уровня мРНК гена ADK и изоформ ADK-S, ADK-L в крови пациентов с КРР по сравнению со здоровыми донорами. Относительный уровень мРНК в контроле принят за 1. Нормализация выполнена по мРНК гена GAPDH

 

В работе рассмотрена также связь между уровнями мРНК исследуемого гена и клиническими признаками заболевания. Выявлена средняя отрицательная корреляция между содержанием мРНК ADK-L и размером опухоли (Т2–Т4), которая составила 0.508 при p = 0.038. Однако не обнаружено значимых корреляционных связей между уровнем мРНК ADK-L и стадией заболевания. Различия в уровне мРНК гена аденозинкиназы у больных КРР с наличием и отсутствием отдаленных метастазов (М0–М1) или метастазов в регионарные лимфатические узлы (N0–N2) не имели статистической значимости.

Уровень внеклеточного аденозина регулируется сетью ферментов, в том числе и эктонуклеотидазами CD39 и СD73, которые играют ключевую роль в канцерогенезе [17]. Ранее нами было показано, что в периферической крови больных КРР повышен уровень мРНК гена СD39, тогда как уровень мРНК гена СD73 был таким же, как у здоровых лиц [18]. Нами проанализирована связь между относительной экспрессией генов CD39, CD73 и A2AR и экспрессий гена ADK и его изоформ в периферической крови больных КРР. Получены новые данные о существовании связи между экспрессией этих генов: выявлена отрицательная корреляция между относительным содержанием мРНК ADK-S и мРНК гена CD39. Показана положительная корреляционная связь уровней мРНК ADK-L и CD73 (табл. 3).

 

Таблица 3. Значения коэффициентов корреляции между уровнем мРНК гена ADK, изоформ ADK-S, ADK-L и содержанием мРНК генов CD39, CD73, A2AR при колоректальном раке

Уровень мРНК	ADK		ADK-S		ADK-L
	rS	p	rS	p	rS	p
A2AR	-0.284	0.21	0.02	0.9346	0.406	0.0843
CD39	-0.038	0.097	-0.468	0.043	-0.329	0.168
CD73	-0.033	0.889	-0.16	0.511	0.518	0.0232

Примечание. Жирным шрифтом выделены статистически значимые показатели.

 

Взаимосвязь между уровнем экспрессии гена ADK и содержанием CD39+/CD73+ Т-клеток

Установленная на уровне мРНК связь аденозинкиназы с эктонуклеотидазами CD39 и CD73 в периферической крови предполагает существование связи ADK с иммунными клетками, экспрессирующими CD39/CD73. Ключевое значение в противоопухолевом иммунном ответе имеет баланс эффекторных CD8⁺, CD4⁺ Т-клеток и иммуносупрессорных регуляторных Т-клеток (Treg). Эти лимфоциты, как и многие другие клетки, чувствительны к действию аденозина, которое проявляется в основном через аденозиновый рецептор A2aR, а также способны участвовать в продукции аденозина, используя экспрессию на своей поверхности CD39 и/или СD73 [3]. Для выявления связи между уровнем экспрессии ADK и уровнем Т-клеток, участвующих в генерации аденозина, проанализировано относительное содержание CD39⁺/CD73⁺ эффекторных Т-лимфоцитов (CD4⁺ Т-хелперов и CD8⁺ цитотоксических клеток) и супрессорных Treg-клеток у больных КРР (n = 20) и здоровых лиц (n = 17) (рис. 2).

 

Рис. 2. Относительное содержание CD39⁺ и CD73⁺ Т-клеток в периферической крови больных КРР и здоровых доноров

 

Как у здоровых, так и у больных лиц, CD39-положительные клетки преобладали в популяции Treg-клеток, тогда как экспрессия CD73 была более характерна для CD8⁺ Т-клеток (рис. 3). Это отмечают и другие авторы [19]. Поскольку популяция эффекторных CD4⁺ Т-клеток содержит 3–5% Treg-клеток, которые характеризуются повышенной экспрессией CD25, то для исключения вклада Treg-клеток в экспрессию CD39/СD73 Т-хелперными клетками рассматривали фенотип CD4⁺CD25^-/int.

 

Рис. 3. Пример гистограмм распределения экспрессии CD39 и СD73 на поверхности CD8⁺ и CD4⁺ Т-клеток здорового донора. По оси Х – интенсивность флуоресценции флуорохромов FITC и PE, конъюгированных с антителами к CD39 и CD73 соответственно. По оси Y показано количество событий в гейте лимфоцитов. Справа под горизонтальной линией отмечены клетки, экспрессирующие CD39/CD73, слева находятся клетки, негативные по экспрессии CD39/CD73

 

Показано, что около 64% всех Тreg-клеток в крови больных КРР были CD39⁺, что значимо отличалось от содержания Treg-клеток в крови здоровых доноров (p = 0.0008), у которых CD39⁺ Treg-клетки составили 42%. Достоверные различия показаны и для CD4⁺CD39⁺ Т-хелперов (p = 0.037). В популяции CD8⁺ Т-клеток больных КРР содержание CD73-положительных клеток было снижено (p = 0.024). Содержание CD73⁺ Тreg-клеток, CD73⁺CD4⁺ Т-клеток и CD39⁺CD8⁺ Т-клеток у больных КРР было таким же, как в контроле.

Для оценки взаимосвязи ADK c содержанием CD39⁺/CD73⁺ Т-лимфоцитов проведен анализ возможных связей между уровнем мРНК гена ADK, его изоформ ADK-L, ADK-S и содержанием CD39/CD73-экспрессирующих Т-клеток в периферической крови больных КРР. Однако статистически значимых корреляционных связей не выявлено (табл. 4).

 

Таблица 4. Значения коэффициентов корреляции между уровнем мРНК гена ADK, изоформ ADK-S, ADK-L и относительным содержанием CD39⁺ и CD73⁺ Т-клеток в крови больных колоректальным раком

Субпопуляция Т-клеток	ADK		ADK-S		ADK-L
	rS	p	rS	p	rS	p
CD8+CD73+	0.107	0.840	0.178	0.713	-0.036	0.951
CD8+ CD39+	0.033	0.948	-0.217	0.581	0.126	0.295
CD4+CD25-/intCD73+	-0.217	0.581	-0.300	0.437	0.393	0.295
CD4+CD25-/intCD39+	-0.021	0.929	0.255	0.278	0.002	0.995
CD4+CD25+CD127lo/-CD73+	-0.381	0.359	-0.381	0.360	0.256	0.549
CD4+CD25+CD127lo/-CD39+	0.051	0.827	0.278	0.235	-0.151	0.522

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время установлено, что аденозинергический путь представляет интерес в качестве перспективной мишени для противоопухолевой терапии. Экспрессия и активность основных участников этого пути, CD39/CD73/A2aR, повышены в опухолевой ткани и часто ассоциируются с клиническими признаками заболевания и неблагоприятным прогнозом при некоторых типах рака [17]. В клинических испытаниях получены предварительный оптимальный профиль безопасности блокаторов A2aR и CD73 и повышенная общая частота ответа на них [4, 20]. Тем не менее, положительные результаты как монотерапии, так и комбинированной терапии были в основном ниже, чем ожидалось на основании доклинических исследований. Это указывает на необходимость более тонкого отбора пациентов или использования биомаркеров, которые могли бы прогнозировать и оптимизировать результаты терапии [4, 20].

Фермент ADK действует как регулятор уровня аденозина, превращая его в AMP. В настоящее время нет четкого понимания роли ADK при развитии опухоли. Ранние работы показывают повышение уровня экспрессии гена ADK [14] и ферментативной активности ADK [21] в опухолевой ткани больных КРР по сравнению с нормальной тканью. У больных раком печени, напротив, уровень белка ADK был ниже, чем в здоровой ткани. Кроме того, в экспериментальной модели снижение уровня ADK в печени увеличивало чувствительность к острым токсическим эффектам канцерогена (ди­этилнитрозамин) [12]. Ряд экспериментальных работ описывает ограничение пролиферации опухолевых клеток и индукцию апоптоза при обработке ингибиторами ADK, в том числе и в клеточной линии HT-29 колоректального рака [22]. Довольно мало известно о роли изоформ ADK при канцерогенезе. Так, Shamloo и соавт. [15] определили более значимую роль длинной изоформы ADK при раке молочной железы. Нокдаун гена этой изоформы приводит к событиям, предполагающим ее участие в митогенезе, канцерогенезе и инвазии опухолевых клеток. Практически не определен уровень ADK в периферической крови, а также связь ADK с активацией ключевых для противоопухолевого иммунного ответа популяций лимфоцитов (CD8⁺/CD4⁺ Т-клеток, Тreg-клеток) у больных КРР.

Полученные нами результаты подтверждают изменение экспрессии ADK в патогенезе КРР. Согласно опубликованным данным, в опухолевой ткани идет локальное повышение активации ADK. Это может быть связано с накоплением аденозина в микроокружении опухоли и его активным метаболизмом. На периферии, в крови, напротив, мы наблюдали снижение уровня мРНК ADK-L в группе больных с III–IV стадиями КРР по сравнению с группой здоровых лиц, а также обратную связь между изменением уровня мРНК ADK-L у больных с распространенным процессом (Т2–Т4), тогда как уровень ADK-S не изменялся по сравнению с контролем.

Как известно, некоторые популяции лейкоцитов экспрессируют эктонуклеотидазы CD39/СD73 и могут участвовать в генерации аденозина [23], что может привести к иммунной супрессии и росту опухоли, в том числе и при КРР [3, 24]. В нашей работе обнаружены значимые корреляционные связи между уровнем мРНК гена CD39 и мРНК ADK-S в периферической крови (r = -0.468 при p = 0.043), а также между уровнем мРНК гена CD73 и мРНК ADK-L (r = 0.518 при p = 0.0232) у больных КРР. Кроме того, не выявлена связь генной экспрессии ADK и изоформ с изменением экспрессии гена, кодирующего аденозиновый рецептор A2aA, активация которого на лимфоцитах способствует развитию иммунной супрессии.

В нашей работе впервые проанализирована связь между содержанием основных эффекторных и супрессорных популяций лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD39/CD73, и изменениями экспрессии ADK у больных КРР. Определение содержания CD4⁺, CD8⁺ Т-клеток и Treg-клеток в периферической крови показало, что наиболее значимо при КРР изменяется содержание CD39⁺ Т-клеток (табл. 3). Впервые проведен анализ связи между содержанием CD39⁺ и CD73⁺ Т-клеток и содержанием мРНК ADK и ее изоформ в периферической крови больных КРР. Достоверных корреляционных связей не обнаружено.

На сегодняшний день известно, что нести на своей поверхности эктонуклеотидазы CD39 и CD73 могут не только Т-лимфоциты, но и нейтрофилы, составляющие большинство в периферической крови, а также В-клетки, моноциты и эндотелиальные клетки [22, 25]. РНК для анализа экспрессии в нашей работе выделяли из цельной крови. Возможно, для определения взаимосвязи между исследуемыми показателями требуется проведение более глубокой оценки с использованием в качестве исходного материала для анализа экспрессии генов фракции мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты), а также увеличение объема выборки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами, а также опубликованные данные свидетельствуют об изменении экспрессии ADK в патогенезе КРР. Обнаружена связь экспрессии длинной и короткой изоформ ADK с экспрессией CD39 и CD73 – эктонуклеотидаз, участвующих в генерации внеклеточного аденозина. Показана перспективная роль мРНК ADK-L в качестве биомаркера КРР. Однако взаимосвязь между уровнями экспрессии гена ADK, изоформ ADK-L, ADK-S и содержанием Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD39/CD73, в периферической крови больных КРР в данном исследовании не обнаружена.

***

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда(грант № 21-75-00013).

Об авторах

Галина Анатольевна Жулай

Институт биологии – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра «Карельский научный центр Российской академии наук»

Email: zhgali-111@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6266-3289

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории генетики

Россия, 185910, Республика Карелия, Петрозаводск, ул. Пушкинская, д.11

Михаил Игоревич Шибаев

Республиканская больница имени В.А. Баранова

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshib@karelia.ru

кандидат медицинских наук, заведующий эндоскопическим отделением

Россия, 185910, Республика Карелия Петрозаводск, ул. Пирогова, д.3

Список литературы

Дополнительные файлы