ИФА-платформа для количественного анализа RBD-нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 как альтернатива мониторингу вируснейтрализующей активности

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

По состоянию на июль 2022 года коронавирус SARS-CoV-2 инфицировал более 564 млн человек, число погибших от COVID-19 во всем мире превысило 6.3 млн человек [1]. С начала пандемии разработаны десятки вакцин, одобренных ВОЗ [2, 3], и терапевтических антител [4–6]. Вакцины конструировали на основе различных платформ: белковых субъединичных, вирусных векторов, РНК, ДНК, инактивированных вирусов и ряда других. К сожалению, оценка эффективности разрабатываемых вакцин затруднялась различиями в платформах, антигенах, иммунологических анализах и показателях, используемых для оценки иммунных ответов. В конце 2020 года ВОЗ, Национальный институт биологических стандартов и контроля (NIBSC) и Коалиция за инновации в области обеспечения готовности к эпидемиям (CEPI) создали и распространили Международный стандарт человеческих анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов (NIBSC code: 20/136) [7]. Стандарт представляет себой лиофилизированный пул плазмы 11 переболевших доноров, который обладает активностью нейтрализующих антител, равной 1000 международных единиц в миллилитре (IU/ml, international units), и содержит 1000 ед. связывающих антител (BAU/ml, binding antibody units). Появление этого стандарта уменьшило межлабораторную вариативность и создало общий язык для представления данных, что важно для разработки диагностики, вакцин, терапевтических антител и отбора доноров [8]. Надежным контролем защищенности индивида от заражения SARS-CoV-2 является уровень вируснейтрализующей активности сывороточных иммуноглобулинов. Для получения достоверных данных требуется достаточно много времени и проведение финансово-затратных исследований с применением живого вируса. Усилия многих исследователей в последнее время направлены на разработку количественных методик, альтернативных существующим платформам, использующим образцы живого вируса SARS-CoV-2 [9–13].

В настоящей работе мы изучали гуморальный ответ у людей, прошедших профилактику наиболее популярными в Российской Федерации вакцинами: Гам-КОВИД-Вак (rAd26/rAd5, торговое название Sputnik V) [14] и КовиВак (инактивированный вирус) [15], сравнили его с антительным ответом у легко и тяжело переболевших COVID-19 пациентов и провели корреляцию между нейтрализацией RBD и вируса. В результате проведенных исследований нами предложена платформа для количественного анализа RBD-нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 как альтернатива мониторингу вируснейтрализующей активности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Количественное определение IgG, специфичных к RBD, и определение их изотипов методом ИФА

Для количественного определения IgG к RBD в лунки 96-луночных планшетов MaxiSorp (Nunc, Дания) вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного RBD (аминокислотные остатки 320–537), полученного в клетках CHO, в PBS в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали планшет в течение ночи при 2–8°C. После этого блокировали свободные сайты связывания, внося в каждую лунку планшета по 150 мкл блокирующего буфера (PBS, 0.05% Tween-20, 0.1% казеинат натрия) и инкубируя планшет в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого готовили образцы сыворотки в блокирующем буфере в трех разведениях (1:10, 1:50, 1:250) и трех повторностях в отдельном 96-луночном планшете с низкой сорбционной способностью. В этом же планшете готовили растворы первичного стандарта ВОЗ (NIBSC code: 20/136) и вторичного стандарта (получен в лаборатории из пула сывороток переболевших индивидов и охарактеризован относительно первичного) в блокирующем буфере в семи последовательных трехкратных серийных разбавлениях. После этого исследуемые образцы сывороток и стандарты в объеме 100 мкл/лунку вносили в лунки планшета с сорбированным RBD и инкубировали в течение 30 мин в термостатируемом шейкере на скорости 700 об/мин при 37^oС. После инкубации планшет промывали 5 раз, внося в каждую лунку по 350 мкл PBST (PBS, 0.05% Tween-20), и в каждую лунку вносили по 100 мкл конъюгата антител к IgG человека с пероксидазой хрена («Биосан», Новосибирск, Россия, кат. № I-3021), разбавленного 1:10000 в блокирующем буфере. После 30-минутной инкубации (37^oC, 700 об/мин) и промывки в лунки планшета добавляли по 100 мкл субстратного раствора TMB и инкубировали в темноте в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 10% раствора фосфорной кислоты и измеряли величины оптического поглощения (ОП) в лунках планшета при длине волны 450 нм (ОП₄₅₀) на планшетном спектрофотометре. Строили кривые зависимости среднего значения величин ОП от концентрации RBD-специфичных IgG в стандартах (BAU/мл) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8 (США). Эти кривые использовали для вычисления концентраций RBD-специфичных IgG в образцах сывороток: выбирали разведение образца, среднее значение величины ОП₄₅₀ которого попадает в диапазон ОП₄₅₀ кривой стандарта, и полученное значение в BAU/мл умножали на соответствующее разведение. Изотипы RBD-специфичных IgG анализировали согласно протоколу, описанному выше, но не строили калибровочные кривые и использовали следующие конъюгаты антител с пероксидазой: к человеческим IgG1 (HyTest, Финляндия, Cat. # 1G2cc), к человеческим IgG2 (HyTest, Финляндия, Cat. # 1G5), к человеческим IgG3 (HyTest, Финляндия, Cat. # 1G3cc), к человеческим IgG4 (HyTest, Финляндия, Cat. # 1G4cc). ИФА IgG к нуклеокапсидному и линейным антигенам проводили согласно [16]. Предел обнаружения в количественном и качественном анализе IgG к RBD определяли следующим образом: среднее значение ОП₄₅₀ в отрицательных образцах плюс три стандартных отклонения от среднего в отрицательных образцах.

Определение нейтрализующей активности на живом вирусе

Нейтрализующую активность сывороток крови определяли в реакции нейтрализации (РН) по подавлению образования негативных колоний, формируемых вирусом SARS-CoV-2 в односуточном монослое клеток Vero C1008 под агаровым покрытием. Разведения сывороток готовили в физиологическом растворе с добавлением антибиотиков (стрептомицина сульфат и бензилпенициллина натриевая соль) по 100 ЕД/мл. Рабочее разведение вируссодержащей суспензии на основе вируса SARS-CoV-2 готовили в растворе Хенкса с 2% фетальной телячьей сывороткой (FBS) и антибиотиками. В приготовленном разведении концентрация SARS-CoV-2 составила 100–150 БОЕ/мл (40–60 бляшек во флаконе). В эксперименте использовали односуточный монослой клеток Vero С1008 во флаконах T25. Смесь равных объемов сыворотки и культуры вируса SARS-CoV-2 инкубировали в течение 1 ч при 37°C. На каждое разведение сыворотки брали не менее четырех флаконов. В каждый из флаконов вносили по 0.5 мл смеси сыворотки и культуры вируса, равномерно распределяли инокулят по всему монослою клеток. Затем флаконы укладывали горизонтально и оставляли при температуре 37°C. После адсорбции комплекса антитела–вирус на клетках в течение 1 ч инокулят декантировали, затем наносили первичное агаровое покрытие, разработанное для вируса SARS-CoV-2 (по 10.0 мл во флакон), и инкубировали монослой при температуре 37°C в течение 2 сут. Через 2 сут на инфицированный монослой наносили вторичное агаровое покрытие с 0.1% раствором нейтрального красного с целью окрашивания клеток и инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре в темноте, затем проводили учет негативных колоний во флаконах. За титр антител исследуемой сыворотки принимали высшее ее разведение, в котором выявляют подавление образования негативных колоний, формируемых вирусом SARS-CoV-2 на 50% и более по сравнению с отрицательным контролем (FBS, заведомо не содержащая специфичных антител к вирусу SARS-CoV-2).

Определение нейтрализующей активности в псевдовирусной системе

Тесты с pVNT проводили с использованием рекомбинантных лентивирусов, несущих S-белок SARS-CoV-2 и кодирующих люциферазу светлячка (Luc) [17]. Для получения псевдовирусных частиц клетки HEK293T растили во флаконах T75 до достижения 50–70% конфлюентности и трансфицировали смесью плазмид (15 мкг pLuc, 15 мкг pGAG, 5 мкг pRev и 2 мкг SARS-CoV-2 S на флакон) с использованием PEI (75 мкг на флакон) в качестве трансфицирующего агента. Далее клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 72 ч в среде DMEM с 10% FBS. Через 72 ч культуральный супернатант центрифугировали сначала при 150 g и далее при 3900 g, а затем фильтровали через фильтр с порами размером 0.20 мкм. Полученные таким образом аликвоты супернатанта хранили при –80°C. Клетки HEK293T-ACE2 засевали в 96-луночные планшеты в плотности 2 × 10⁴ клеток/лунку и инкубировали в течение ночи. Готовили серийные разведения сывороток крови в среде DMEM с 10% FBS. Далее разбавленные образцы сывороток (5 мкл) смешивали со средой с псевдовирусами (50 мкл) в 96-луночных планшетах и инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 1 ч. Затем из лунок планшетов с клетками HEK293T-ACE2 удаляли по 50 мкл среды, и клетки инфицировали смесями вирус–сыворотка (50 мкл/лунку). Инокулированные клетки HEK293T-ACE2 далее инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 48 ч. Контроли тестировали в трех повторностях, исследуемые образцы тестировали однократно, 1 раз. После 48-часовой инкубации отбирали среду из лунок с клетками, в лунки добавляли по 100 мкл лизирующего буфера (25 мM Трис-фосфат, pH 7.8, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 2 мM DTT) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляли по 20 мкл реагента Bright-Glo™ Luciferase Assay Substrate (Promega, США) и измеряли величины люминесцентных сигналов в 96-луночных белых планшетах, содержащих по 80 мкл клеточных лизатов. С помощью ПО GraphPad Prism 8 строили кривые зависимости величин люминесцентных сигналов от разведений сывороток и вычисляли титры сывороток, обеспечивающие 50% нейтрализацию псевдовируса.

Количественное определение RBD-специфичных нейтрализующих антител методом конкурентного ИФА

В лунки 96-луночных планшетов MaxiSorp (Nunc, Дания) вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного, полученного экспрессией в клетках CHO, RBD (аминокислотные остатки 320–537) в PBS в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали планшет в течение ночи при 2–8⁰C. После этого проводили блокировку свободных сайтов связывания, внося в каждую лунку планшета по 150 мкл блокирующего буфера (PBS, 0.05% Tween-20, 0.1% БСА) и инкубируя планшет в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого готовили образцы сыворотки в блокирующем буфере в трех разведениях (1:10, 1:50, 1:250) и трех повторностях в отдельном 96-луночном планшете с низкой сорбционной способностью. В этом же планшете готовили растворы первичного стандарта ВОЗ и вторичного стандарта (получен в лаборатории из пула сывороток переболевших индивидов и охарактеризован относительно первичного) в блокирующем буфере в конечных концентрациях 10, 20 и 40 IU/мл. После этого исследуемые образцы сывороток и стандарты в объеме 100 мкл/лунку вносили в лунки планшета с сорбированным RBD и инкубировали в течение 30 мин в термостатируемом шейкере на скорости 700 об/мин при 37^oС. После инкубации планшет промывали 5 раз, внося в каждую лунку по 350 мкл PBST (PBS, 0.05% Tween-20), в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного hACE2-3xFLAG (0.2 мкг/мл) в блокирующем буфере. После 30-минутной инкубации при 37^oC на 700 об/мин и промывки в лунки планшета добавляли по 100 мкл раствора антител к FLAG, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma Aldrich, США, Cat. # A8592), в разведении 1:10 000 в блокирующем буфере, планшет инкубировали в течение еще 30 мин как описано выше. После промывки планшета в лунки добавляли по 100 мкл субстратного раствора TMB и инкубировали в темноте в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 10% раствора фосфорной кислоты, измеряли величины ОП₄₅₀ в лунках планшета на планшетном спектрофотометре. Строили кривые зависимости величин ОП₄₅₀ от концентрации RBD-специфичных нейтрализующих антител в стандартах IU (IU/мл) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8. Эти кривые использовали для вычисления концентраций RBD-специфичных нейтрализующих антител в образцах сывороток, для чего выбирали разведение образца, попадающее в диапазон ОП₄₅₀ кривой стандарта, и полученное значение в IU/мл умножали на соответствующее разведение. Предел обнаружения определяли следующим образом: среднее значение ОП₄₅₀ в отрицательных образцах минус три стандартных отклонения от среднего в отрицательных образцах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения SARS-CoV-2 S1 RBD-нейтрализующей активности сывороток человека

К настоящему моменту существует несколько методов количественного определения вируснейтрализующей активности сывороток: стандартный тест с «живыми» вирусами (cVNT), тест с псевдовирусами (pVNT) и конкурентные ИФА-тесты на основе иммунохимических методов (sVNT). Стандартные тесты (в случае SARS-CoV-2) должны проводиться в помещениях с классом биобезопасности не ниже второго. Тесты с псевдовирусами (PV) трудоемки, для их проведения требуется значительное время. Конкурентные ИФА-тесты удобны для проведения рутинной серодиагностики и занимают сравнительно немного времени. Однако их необходимо валидировать относительно тестов другого типа.

Нами разработана тест-система для количественного определения активности SARS-CoV-2 RBD-специфичных нейтрализующих антител в сыворотке или плазме крови [18]. Метод основан на использовании конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (кИФА) для измерения взаимодействия рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с рекомбинантным рецептором ACE2 человека (ACE2) в присутствии образца. На первой стадии происходит взаимодействие SARS-CoV-2 RBD-нейтрализующих антител (при их наличии в исследуемом образце) с RBD, сорбированным на поверхности лунок разборного полистиролового планшета. На второй стадии происходит взаимодействие RBD с рекомбинантным человеческим рецептором ACE2. Если исследуемый образец не содержит RBD-нейтрализующие антитела, то происходит образование комплекса «RBD–ACE2». Если образец содержит RBD-нейтрализующие антитела, то комплекс «RBD–ACE2» образуется частично или не образуется. На третьей стадии образовавшийся комплекс «RBD–ACE2» выявляют с помощью иммуноферментного конъюгата (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема количественного определения активности SARS-CoV-2 RBD-специфичных нейтрализующих антител в сыворотке или плазме крови методом кИФА. С рекомбинантным RBD, сорбированным в лунках планшета, взаимодействуют антитела из анализируемого образца сыворотки. Если в образце содержатся RBD-нейтрализующие антитела (А), то они блокируют связывание RBD с ACE2. Если образец не содержит нейтрализующие антитела (Б), то RBD, сорбированный на планшете, связывается с рекомбинантным ACE2 из раствора. Это связывание детектируется меченными пероксидазой антителами к 3×FLAG-последовательности (3×FLAG), которая содержится в рекомбинантном ACE2. Таким образом, регистрируемый колориметрический сигнал обратно пропорционален концентрации нейтрализующих антител в образце. Ab – антитела, не обладающие нейтрализующей активностью; ACE2 – рекомбинантный человеческий рецептор ACE2; HRP – антитела к эпитопу FLAG, меченные пероксидазой хрена; nAB – антитела, обладающие RBD-нейтрализующей активностью; RBD – рекомбинантный рецепторсвязывающий домен S-белка коронавируса SARS-CoV-2

 

Суммарное время анализа составляет 2–2.5 ч. Определение проводят относительно международного стандарта ВОЗ, предел обнаружения равен 4 IU/мл.

RBD-нейтрализующая активность сывороток, измеренная методом кИФА, высоко коррелирует с нейтрализацией вируса

Мы провели успешную валидацию разработанной тест-системы кИФА, сравнивая результаты активности анти-RBD-антител с показателями нейтрализации вируса, полученными с помощью стандартного теста с «живыми» вирусами (cVNT) и теста с псевдовирусами (pVNT). Показатели достоверности линейной аппроксимации (r²) составили 0.97 и 0.90 соответственно (рис. 2).

 

Рис. 2. Валидация теста RBD-нейтрализации путем сравнения с показателями нейтрализации вируса. А – график зависимости активности SARS-CoV-2 RBD-специфичных нейтрализующих антител в сыворотках крови, полученных в кИФА, от титров сывороток, обеспечивающих нейтрализацию 50% вируса (IC₅₀), полученных с помощью теста cVNT (26 образцов). Б – график зависимости активности SARS-CoV-2 RBD-специфичных нейтрализующих антител в сыворотках крови, полученных в кИФА, от титров сывороток, обеспечивающих нейтрализацию 50% псевдовируса (IC₅₀), полученных с помощью теста pVNT (29 образцов). r² – показатель достоверности линейной аппроксимации. Во всех образцах сывороток, где анти-RBD-нейтрализующие антитела не обнаружены (25 образцов), нейтрализация SARS-CoV-2-инфекции во всех тестах не обнаружена

 

Характеристика групп образцов сывороток и анализ их протективных свойств

Мы исследовали 134 образца сывороток, полученных от четырех групп людей (табл. 1): тяжело переболевшие COVID-19 (Госпитализированные пациенты); легко переболевшие COVID-19 (Амбулаторные пациенты); не болевшие ранее COVID-19 и вакцинированные двумя дозами Гам-КОВИД-Вак (Вакцинированные Гам-КОВИД-Вак); не болевшие ранее COVID-19 и вакцинированные двумя дозами КовиВак (Вакцинированные КовиВак).

 

Таблица 1. Характеристика групп образцов сывороток

Группа	Кол-во	Пол, м/ж	Возраст, медиана (минимум, максимум)	Время (дни) после появления симптомов или введения второй дозы вакцины, медиана (минимум, максимум)
Госпитализированные пациенты	27	15/12	57 (37, 69)	23 (19, 47)
Амбулаторные пациенты	41	21/20	39 (27, 61)	25 (17, 44)
Вакцинированные Гам-КОВИД-Вак	43	20/23	41 (25, 62)	21 (14, 28)
Вакцинированные КовиВак	23	11/12	36 (28, 58)	20 (14, 30)

 

Все образцы сывороток тестировали как с помощью разработанного нами метода кИФА, определяющего активность RBD-нейтрализации (RBD-nAb) – способность сывороток ингибировать (нейтрализовать) связывание RBD с ACE2, так и с помощью разработанного нами метода количественного ИФА, определяющего общую концентрацию SARS-CoV-2 RBD-специфичных иммуноглобулинов класса G (IgG). В последнем случае определение так же проводят относительно международного стандарта ВОЗ, предел обнаружения составляет 1 BAU/мл.

Частота встречаемости IgG-позитивных сывороток среди групп: Госпитализированные пациенты, Амбулаторные пациенты и Вакцинированные Гам-КОВИД-Вак варьировала от 85 до 93%. В группе Вакцинированные КовиВак частота составила всего 26% (рис. 3А). Среди этих IgG-серопозитивных сывороток частота встречаемости RBD-nAb-позитивных сывороток варьировала от 67 до 95% (рис. 3Б). Частота встречаемости RBD-nAb-позитивных сывороток в группе, отражающая протективные свойства сывороток, варьировала от 22 до 81% (рис. 3В).

 

Рис. 3. Частота встречаемости серопозитивных образцов сывороток в анализируемых группах. А – частота встречаемости анти-RBD IgG-позитивных образцов сывороток в группе. Б – частота встречаемости RBD-nAb-серопозитивных сывороток среди RBD-IgG-серопозитивных образцов. В – частота встречаемости RBD-nAb-серопозитивных образцов. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью точного критерия Фишера (*p < 0.05, ****p < 0.0001)

 

Концентрации SARS-CoV-2 RBD-специфичных IgG в серопозитивных образцах в разных группах различались незначительно (рис. 4А). С другой стороны, несмотря на практически идентичные концентрации RBD-специфичных IgG в серопозитивных образцах всех групп, активность RBD-специфичных вируснейтрализующих антител была значительно выше в группе Госпитализированные пациенты по сравнению с другими группами (рис. 4Б).

 

Рис. 4. Концентрация SARS-CoV-2 RBD-специфичных IgG и активность RBD-ACE2-нейтрализующих антител в серопозитивных образцах сывороток, измеренных методом ИФА. А – концентрация SARS-CoV-2 RBD-специфичных IgG в серопозитивных образцах сывороток. Б – нейтрализующая активность RBD-специфичных антител (RBD-nAb) в серопозитивных образцах сывороток. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью критерия Краскела–Уоллиса (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001)

 

С целью дальнейшего прояснения природы гуморального ответа дважды серопозитивные (RBD-IgG⁺ и RBD-nAb⁺) образцы тестировали с помощью изотип-специфичных конъюгатов. Анализ изотипов IgG, кроме переключения на изотип IgG1 во всех группах, выявил также повышенную продукцию антител изотипа IgG3 в группе вакцинированных Гам-КОВИД-Вак (рис. 5).

 

Рис. 5. Частота встречаемости SARS-CoV-2 RBD-специфичных изотипов IgG среди серопозитивных образцов сывороток, способных нейтрализовать взаимодействия RBD–ACE2. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью точного критерия Фишера. ****p < 0.0001

 

Взаимосвязь RBD-нейтрализующей активности антител и концентрации анти-RBD IgG

Для характеристики взаимосвязи между активностью SARS-CoV-2 RBD-специфичных nAb и концентрацией SARS-CoV-2 RBD-специфичных IgG мы провели линейный регрессионный анализ каждой группы образцов сывороток. Выявлены различия в активности RBD-nAb (нормированной по концентрации RBD-специфичных IgG) в исследуемых образцах из различных групп. Активность RBD-nAb может быть выражена через тангенс угла наклона линии регрессии (рис. 6). Активность RBD-nAb была значительно выше в образцах сывороток группы Госпитализированные пациенты по сравнению с другими группами.

 

Рис. 6. Линейный регрессионный анализ RBD-ACE2-нейтрализующей активности сывороточных антител и концентрации RBD-специфичных IgG. Дважды серопозитивные (RBD-IgG⁺ и RBD-nAb⁺) образцы сывороток обозначены белыми кругами, негативные образцы – серыми кругами. 95% доверительные интервалы (CI) и предел обнаружения активности и концентрации обозначены пунктирными линиями. R – коэффициент корреляции Пирсона. K – тангенс угла наклона линии регрессии

 

RBD-нейтрализующие свойства сывороток, полученных от представителей разных групп

Для правильной оценки RBD-нейтрализующей активности гуморального иммунитета (индекс протективности) необходимо, кроме RBD-нейтрализующей активности, также учитывать частоту формирования иммунного ответа в исследуемой группе. Поэтому индекс протективности сывороток групп рассчитывали как значение тангенса угла наклона линии регрессии (K) в группе (рис. 6), приведенного на частоту встречаемости SARS-CoV-2 RBD-специфичных nAb-позитивных образцов сывороток в группе (рис. 3В). Полученные данные приведены на рис. 7.

 

Рис. 7. Вируснейтрализующая активность гуморального иммунитета в разных группах. Индекс протективности группы Амбулаторные пациенты принят за 100%

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Возникновение, развитие и сохранение защитного гуморального иммунитета к коронавирусу SARS-CoV-2 после заболевания и/или вакцинной профилактики очень важны и в значительной степени определяют меры, применяемые государством в борьбе с коронавирусной инфекцией. Нейтрализующие антитела имеют огромное значение для защиты организма от вируса. Механизм действия вируснейтрализующих антител разнообразен: ингибирование связывания вирионов с клеточными рецепторами, подавление проникновения вирусных геномов в цитоплазму клетки, блокирование проникновения вирусных геномов из эндосомы в цитоплазму клеток и, наконец, просто агрегация вирусных частиц. Основным типом нейтрализующих антител при коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 являются антитела, препятствующие взаимодействию рецепторсвязывающего домена S-белка вируса с клеточным ACE2-рецептором. Проведено множество исследований, демонстрирующих корреляцию уровня защиты организма с наличием SARS-CoV-2 анти-RBD-иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови человека [19–22].

Отдельный пул исследований посвящен адаптивной иммунотерапии COVID-19, а именно, созданию рекомбинантных терапевтических вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 [23–25]. В этом случае особый интерес представляет потенциальная возможность защиты от новых вариантов вируса, и вопрос нейтрализации вируса стоит весьма остро.

В случае SARS-CoV-2 в определенной степени можно говорить о том, что RBD-ACE2-нейтрализующая активность сывороток практически эквивалентна вируснейтрализующей активности антител и может использоваться в качестве аналога для определения нейтрализующих антител к SARS-CoV-2.

Целью данной работы было детальное изучение защитных свойств гуморального иммунного ответа у госпитализированных и амбулаторных пациентов, а также после профилактики двумя самыми популярными в РФ вакцинами против SARS-CoV-2.

Для изучения гуморального иммунитета к SARS-CoV-2 нами созданы две простые, быстрые и удобные ИФА-тест-системы: для количественного измерения концентрации SARS-CoV-2 анти-RBD-IgG и для количественного определения SARS-CoV-2 S1 RBD-ACE2-нейтрализующей активности антител (RBD-nAb). Эти системы образуют платформу, которая, благодаря своей модульной структуре, может быть в кратчайшие сроки (до 1–2 недель) адаптирована к новым штаммам (заменой RBD белка) или даже к новым вирусам (заменой рецептора ACE2).

Используя эти тест-системы, мы определили (в разрезе изучаемых групп) следующие параметры сывороток крови: частоту встречаемости SARS-CoV-2 анти-RBD-IgG положительных сывороток, концентрацию IgG в сыворотках, частоту встречаемости SARS-CoV-2 RBD-nAb-положительных сывороток, нейтрализующую активность RBD-nAb в сыворотках.

Концентрация SARS-CoV-2 анти-RBD-IgG-антител была примерно одинакова среди всех серопозитивных сывороток, однако частота встречаемости IgG-положительных сывороток в группе вакцинированных препаратом КовиВак, сделанным на основе инактивированного вируса, была более чем в 3 раза ниже, чем в остальных группах. Ранее мы показали, что большинство SARS-CoV-2 анти-RBD-антител у переболевших COVID-19 пациентов были конформационно-зависимыми [16, 26]. По-видимому, препарат КовиВак обладает достаточно низкой иммуногенностью, причиной которой, возможно, является частичное разрушение структуры эпитопов S-белка в процессе инактивации вируса или при его хранении. Частота встречаемости RBD-nAb-положительных сывороток и их активность были наибольшими в группе Госпитализированные пациенты.

Нами также исследован профиль образования изотипов IgG-антител в различных группах. Антитела изотипа IgG1 обнаружены в образцах сывороток из всех групп. Следует отметить, что только в группе Вакцинированные Гам-КОВИД-Вак также обнаружены антитела изотипа IgG3. Переключение на продукцию антител изотипов IgG1 и IgG3, по-видимому, происходит под воздействием IL-21 [27]. Антитела изотипа IgG3 образуются на ранних стадиях иммунного ответа и характеризуются высокой способностью к активации комплемента и высокой аффинностью к клеточным рецепторам Fcγ. Все перечисленные свойства антител данного изотипа, в дополнение к RBD-нейтрализующей активности, приводят к активации антителозависимого фагоцитоза и опосредованной антителами цитотоксичности [28–30]. Переключение на продукцию антител изотипов IgG1 и IgG3 в группе Вакцинированные Гам-КОВИД-Вак может быть объяснено природой аденовирусного вектора, используемого в вакцине Гам-КОВИД-Вак.

Мы также рассчитали RBD-нейтрализующую активность гуморального иммунитета в исследуемых группах. Индекс протективности в группе Вакцинированные Гам-КОВИД-Вак на 25% превышал индекс в группе Амбулаторные пациенты и почти в 4 раза превышал индекс в группе Вакцинированные КовиВак. Наибольшая RBD-нейтрализующая активность наблюдалась в группе Госпитализированные пациенты (в 4 раза выше, чем в группе Амбулаторные пациенты), что говорит о наличии высокоаффинных и высокоспецифичных антител наряду с высокой частотой развития иммунного ответа. По-видимому, это объясняется долговременной вирусной нагрузкой госпитализированных пациентов, которая приводит к образованию вируснейтрализующих антител с высокой константой связывания с вирусными эпитопами [16, 31–33].

ВЫВОДЫ

1. Разработана релевантная платформа для количественного анализа RBD-нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 как альтернатива мониторингу вируснейтрализующей активности, позволяющая количественно определять концентрации SARS-CoV-2 анти-RBD IgG-антител, а также SARS-CoV-2 RBD-ACE2-нейтрализующую активность антител.
2. Проведено сравнительное исследование 134 образцов сывороток от тяжело и легко переболевших COVID-19 пациентов и лиц, вакцинированных препаратами Гам-КОВИД-Вак и КовиВак.
3. В группе Госпитализированные пациенты наблюдался наибольший индекс протективности.
4. Защитные свойства гуморального иммунитета после вакцинации препаратом Гам-КОВИД-Вак были в 4 раза выше, чем после вакцинации препаратом КовиВак.
5. Преимуществом разработанной платформы является возможность в кратчайшие сроки (1–2 недели) адаптировать методику к вновь появляющимся вариантам вируса и тем самым получить количественные данные по защищенности индивидов, прошедших вакцинацию предыдущими типами вакцин.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования, проект № 075-15-2021-1049.

Об авторах

Никита Николаевич Костин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: nkostin1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9447-9961
SPIN-код: 5840-5090
Scopus Author ID: 57201266735
ResearcherId: I-6532-2012

научный сотрудник, лаборатория Биокатализа

Россия, Москва, 117997

Татьяна Владимировна Бобик

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: bobik_tanya@mail.ru
Россия, Москва, 117997

Георгий Андреевич Скрябин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: skryabin.george@gmail.com
Россия, Москва, 117997

Мария Александровна Симонова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: marisimonova@gmail.com
Россия, Москва, 117997

Вера Дмитриевна Кнорре

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vera.knorre@gmail.com
Россия, Москва, 117997

Виктория Александровна Абрикосова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: abrikosova_victoria@rambler.ru
Россия, Москва, 117997

Юлиана Анатольевна Мокрушина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: yuliana256@mail.ru
Россия, Москва, 117997

Иван Витальевич Смирнов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997

Наталья Леонидовна Алешенко

Центральная клиническая больница РАН

Email: nl.aleshenko@gmail.com
Россия, Москва, 117593

Наталья Андреевна Круглова

Институт биологии гена РАН

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Дмитрий Вячеславович Мазуров

Институт биологии гена РАН

Email: dvmazurov@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Алексей Эдуардович Никитин

Центральная клиническая больница РАН

Email: Nikitinmd@mail.ru
Россия, Москва, 117593

Александр Габибович Габибов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: gabibov@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

Список литературы

Дополнительные файлы