Биогенез рибосом эукариот: 60S субъединица

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

В первой части нашего обзора подробно описаны механизмы формирования и процессинга общего 90S предшественника, биогенез малой 40S субъединицы, а также ядрышко как специальная внутриядерная структура, необходимая для формирования и раннего созревания предшественников рибосом. Во второй части рассмотрение деталей биогенеза рибосом продолжено на примере формирования большой 60S субъединицы человека и дрожжей.

БИОГЕНЕЗ ПРЕДШЕСТВЕННИКА СУБЪЕДИНИЦЫ 60S

25S рибосомная РНК (рРНК) 60S субъединицы дрожжей состоит из шести консервативных доменов (I–VI), которые более тесно переплетены друг с другом, чем домены 18S рРНК в малой субъединице (SSU) (рис. 1). На внешней поверхности большой субъединицы (LSU) расположены домены I и II 25S и 5.8S рРНК, а домены IV и V входят в состав функциональных центров. Домены III и IV соединяют малую и большую субъединицы. При этом домен III рРНК связывается с другими доменами рРНК в нижней части субъединицы 60S, 5.8S рРНК находится между доменами I и III, а 5S рРНК закреплена поверх доменов II и V (рис. 1). Домен VI связан с доменами I, II и 5.8S рРНК.

 

Рис. 1. Структура и созревание пре-рРНК дрожжей. А – 25S рРНК содержит шесть доменов (I–VI) вторичной структуры. 5.8S рРНК (показана черным) комплементарно взаимодействует с доменом I 25S рРНК (адаптировано из https://crw-site.chemistry.gatech.edu/). Б – последовательность сборки доменов пре-60S пре-рРНК. Цветовая кодировка доменов 25S рРНК соответствует панели (А). Присоединение рибосомных белков и факторов биогенеза к предшественнику 35S рРНК. Формирование туннеля выхода полипептида (черный кружок) начинается с того, что домен VI связывается с доменами I и II и с участком 5.8S предшественника рРНК. Складывание доменов рРНК осуществляется в следующем порядке: VI, V, III и IV. В состоянии F (конечном), домен V полностью свернут [1]. В – поворот 5S рРНК [2]. Г – схема вторичных структур ITS1 и ITS2 дрожжей и человека. Знаком «V» обозначены сайты расщепления. Предсказанные сайты отмечены знаками вопроса, подчеркнуты сайты связывания экзонуклеазы у человека [3]. Д – модель процессинга ITS2 РНКазой PNK [4]. Е – схема взаимодействия ядерной РНК-экзосомы с пре-60S [5]. Ж – удаление ITS2 из частицы пре-60S ферментами процессинга РНК. Показаны промежуточные соединения, образующиеся во время удаления ITS2 [6]

 

В 2017 году тремя группами исследователей были опубликованы крио-ЭМ-структуры высокого разрешения пре-60S из ядер дрожжей. В этих структурах идентифицированы шесть типов пре-60S частиц, различающихся плотностью упаковки РНК и составом рибосомных белков (RP) [1, 6–8] (рис. 1). Вторичная структура рРНК LSU разделена на шесть доменов, однако эти домены невозможно отчетливо выделить в 3D-структуре, в отличие от четырех доменов 18S рРНК в SSU. Домены I и II 25S рРНК в процессе транскрипции связывают 5.8S и ITS2, образуя структурный каркас для дальнейшей сборки (рис. 1) [1, 7, 8]. Домен VI, после того как РНК-полимераза I (Pol I) завершает его транскрипцию, сразу принимает упорядоченную структуру, в то время как центральные домены (III, IV и V) остаются неупорядоченными, взаимодействуя с факторами сборки рибосом (ФСР), которые препятствуют образованию контактов с 5’-концевыми доменами. В составе зрелой LSU домены I–V формируют туннель выхода пептида, II и VI – GTP-азный центр, а домен V – пептидилтрансферазный центр (ПТЦ) с A- и P-сайтами. Скоординированный процесс присоединения и диссоциации различных ФСР обеспечивает последовательное формирование этих ключевых структур. Например, серия последовательных взаимодействий с ФСР (Nog1, Rei1 и Reh1), происходящих сразу после окончания формирования туннеля выхода полипептида, способствует завершению фолдинга [9–13]. Домен VI, который соответствует 3’-концу 25S рРНК, стабильно включается в основу частицы, замыкая кольцо рРНК и оставляя свободными домены III–V [1, 7, 8] (рис. 2). Они последовательно собираются вокруг образующегося позднее туннеля выхода растущего полипептида, оставляя ПТЦ в незрелой конформации. Последовательность событий отличается от пути биогенеза 40S, где укладка рРНК происходит последовательно от 5’- к 3’-концу 18S рРНК. Примечательно, что предварительным условием для образования этих кольцеобразных промежуточных соединений рРНК в 60S субчастице является удаление внутреннего транскрибируемого спейсера 1 (ITS1) и внешнего транскрибируемого спейсера – 3’-ETS (рис. 3), поскольку эти последовательности стерически препятствуют ассоциации домена VI рРНК с другими доменами. Кольцевой промежуточный продукт охватывает как 5’-, так и 3’-конец рРНК и может защищать рРНК от деградации, но не препятствует модификации гетероциклических оснований. Закрепление 5’- и 3’-концов, вероятно, облегчает сборку подвижных соседних доменов, формируя своеобразный каркас. Домен V особенно «выигрывает» от предварительной сборки других доменов рРНК, так как его участки должны сформировать контакты с несколькими доменами, включая 5S рРНК (рис. 1, 2). В ходе этого процесса конформация комплекса меняется трижды (рис. 1, 2).

 

Рис. 2. Схема сборки большой субъединицы дрожжей. Показаны последовательные стадии созревания большой рибосомной субъединицы (60S), начиная с самых ранних стадий в ядрышке, через стадии в нуклеоплазме и, наконец, в цитоплазме. Показаны части рДНК, из которых образуются 5.8S рРНК, ITS2, домены I–VI 25S рРНК и 3′-ETS. Адаптировано из [14]. Факторы сборки и комплексы, структура которых известна, схематично изображены; если структуры не установлены, приведены их текстовые аббревиатуры

 

Некоторые ФСР, такие, как Rrp5, Mak21, Noc2 и Nop4, по-видимому, способствуют уплотнению рРНК на самых ранних котранскрипционных стадиях биогенеза LSU, образуя жесткую опору для согласованного сворачивания РНК [14–19]. Структуры прерибосомных частиц мутантов с дефицитом этих ФСР имеют более рыхлую структуру [14, 18]. Ранние ФСР (Npa1, Npa2, Rsa3 и Nop8) и РНК-хеликаза Dbp6 образуют стабильный комплекс, который может выполнять структурную функцию [19, 20]. Шесть других РНК-хеликаз (Dbp2, Dbp3, Dbp7, Dbp9, Mak5 и Prp43) также необходимы на начальных этапах сборки, требующих ремоделирования структур РНК (для обзора см. [20, 21]). Интересно, что расщепление по A2 и A3 ITS1 связано с транскрипцией и процессингом последовательностей, удаленных друг от друга в первичной структуре на несколько тысяч нуклеотидов. Котранскрипционное расщепление в сайте A2 происходит, когда синтезированы домены I и II 25S рРНК [22, 23]. Гидролиз по A3 происходит после окончания транскрипции и процессинга 3′-ETS [24]. Возможно, в результате фолдинга РНК, опосредованного белками, формируются структуры, способные взаимодействовать с ФСР и нуклеазами. Например, связывание Rrp5 ITS1 как в процессоме SSU (сайт A2), так и в частицах пре-60S (сайт A3) [25–27] может регулировать расщепление в этих местах и координировать сборку обеих субчастиц [16, 18, 28, 29].

Ранние ядрышковые частицы пре-60S содержат приблизительно 30 ФСР и 30 рибосомных белков (табл. 1). Большинство из них, по-видимому, стабилизируют структуру, а часть обладает ферментативной активностью, которая может контролировать переход между ключевыми этапами в процессе сборки 60S. Например, факторы Nop2 и Spb1 важны для независимого от мякРНП метилирования РНК. Субстрат и функция хеликазы Has1 не установлены, как и функции GTP-аз Nog1 и Nug1, которые, вероятно, необходимы для высвобождения Nop2 и Spb1 из более поздних пре-60S субчастиц. Интересно, что белки семейства Brix вместе с белками-партнерами [31–34], по-видимому, сворачивают рРНК, соединяя вместе разные домены. Например, димер Ssf1–Rrp15 связывает домены III и VI рРНК; комплекс Brx1–Ebp2 – стык доменов I и II. Rpf1–Mak16 контактирует с 5.8S рРНК и доменами I, II и VI. Белки семейства Brix, Rpf2 и Rrs1 взаимодействуют с 5S рРНК и доменом V в частице Nog2 пре-60S [13], а комплекс Imp4–Mpp10 связывает 5′-ETS и зарождающийся 3′-домен внутри частицы 90S.

 

Таблица 1. Факторы сборки большой субъединицы рибосом [20, 30]

Факторы биогенеза рибосом; компоненты LSU Saccharomyces cerevisiae
Номер кластера			Homo sapiens	S. cerevisiae	Функция
8	8	4	PDCD11	Rrp5	Cтруктурный
	4		RBM28	Nop4	Структурный
1			DDX51	Dbp6	DEAD-box-хеликаза
	1		DDX50	Dbp3	«
1	1		DDX31	Dbp7	«
1	4		DDX56	Dbp9	«
1	1		DDX24	Mak5	«
			DDX54	Dbp10	«
	2		GAR1	Gar1	Кофактор псевдоуридин-синтазы
2	2		NHP2	Nhp2	Кофактор псевдоуридин-синтазы
	8		NOP10	Nop10	Кофактор псевдоуридин-синтазы
6	6	6	DKC1	Cbf5	Псевдоуридин-синтаза
2	2	2	NOP56	Nop56	Основной компонент BoxC/D мякРНП
			NOP58	Nop58	То же
2	2	2	FBL	Nop1	«
2	2	11	NHP2L1	Snu13	«
			KIAA0020	Puf6	Структурный
1			PWP1	Pwp1	Структурный
			RBM34	Nop12	Структурный
4	4	4	DDX27	Drs1	DEAD-box-хеликаза
6	11	11	PAK1IP1	Mak11	Структурный
			PPAN	Ssf1	«
			PPAN	Ssf2	«
4	4	4	RRP15	Rrp15	«
9	11		SURF6	Rrp14	«
4	4	4	WDR74	Nsa1	«
4	4	4	RRP1/NOP52	Rrp1	«
4	10	10	RPF1	Rpf1	«
4	4	4	MAK16	Mak16	«
			NVL	Rix7	AAA-ATP-аза
4	4	4	EBNA1BP2	Ebp2	Структурный
4	4	4	BRIX1	Brx1	«
4	4	4	BOP1	Erb1	«
		4	WDR12	Ytm1	«
8	8	8	DDX18	Has1	DEAD-box-хеликаза
4	4	11	NOC2L	Noc2	Структурный
1			FTSJ3	Spb1	рРНК-метилаза
			DDX55	Spb4	DEAD-box-хеликаза
1			NOP2	Nop2	рРНК-метилаза
1			NIP7	Nip7	Структурный
			NOC3L	Noc3	«
4	4	4	PES1	Nop7	«
4	4	4	MKI67IP	Nop15	«
				Cic1	«
	8		eIF6	eIF6	«
11	11	11	GLTSCR2	Nop53	Структурный, связывание РНК. Экзосомы
2			RSL24D1	Rlp24	Структурный
4	4	4	GTPBP4	Nog1	GTP-аза
			MRTO4	Mrt4	Структурный
4	1	1	NSA2	Nsa2	Структурный
1			GNL3	Nug1	GTP-аза
11		11	RRS1	Rrs1	Структурный
		1	RPF2	Rpf2	Структурный
11		11	GNL2	Nog2	GTP-аза
			NLE1	Rsa4	Структурный
			WDR18	Ipi3	Структурный
			MDN1	Mdn1	AAA-AТР-аза
11	11		SDAD1	Sda1	Структурный
Частицы, содержащие Nmd3
2			NMD3	Nmd3	«
		2	ZNF622	Rei1	«
			ZNF622	Reh1	«
	6		LSG1	Lsg1	АТР-аза

 

Выделение пре-60S в комплексе с фактором Nsa1 позволило установить, что при образовании LSU комплекс Nsa1–Rpf1–Mak16–Rrp1 стабилизирует поверхность, контактирующую с растворителем; комплекс Rlp24–Nog1–Mrt4–Mak16–Tif6–Nsa2 взаимодействует преимущественно с доменами V и VI; а комплекс Nsa3–Nop15–Rlp3–Nop7–Erb1–Ytm1 организует ITS2 при формировании «стопы». Подобно нескольким ФСР 90S субчастицы, Erb1 имеет длинный N-конец, который «извивается» по поверхности пре-60S, контактируя с отдаленными факторами, включая димер Brx1–Ebp2, хеликазу Has1, Nop16 и фактор «стопы» Nop7 [1, 7, 8]. Более того, β-пропеллерный домен Erb1 стабильно взаимодействует с фактором Ytm1, служащим субстратом АТP-азы Rea1 [35]. На определенном этапе Rea1 создает механохимическую силу для удаления Ytm1 и расположенного в глубине структуры Erb1. Примечательно, что другие белковые комплексы содержат также белки (Nsa1, Rlp24), которые диссоциируют при помощи таких AAA-АТP-аз, как Rix7 и Drg1 [35, 36].

Пока неясно, когда и как 5S РНП (5S рРНК, uL18/Rpl5, uL5/Rpl11) включается в самые ранние частицы пре-60S. Взаимодействие происходит с 5S РНП в свернутой конформации и, следовательно, требует конформационного поворота на 180° на более поздних этапах созревания 60S [6, 13, 37]. Эта стадия сочетается с формированием ПТЦ, правильность образования которого проверяется удалением Rsa4 с помощью огромной Rea1 AAA-AТP-азы и GTP-зависимой диссоциации Nug2 [38, 39]. Связывание факторов ядерного экспорта с пре-60S и последующий транспорт происходят после преодоления контрольных точек качества сборки [39]. Несмотря на строгую систему контроля точности сборки в ядре, пре-60S частицы, содержащие ITS2 и связанные с ней факторы, могут попадать в цитоплазму и даже участвовать в трансляции [40–42].

Транспорт пре-60S в цитоплазму и контроль качества предшественников субъединиц

Транспорт из ядрышка в нуклеоплазму сопровождается обменом белковыми факторами, которые способствуют ремоделированию и последующему экспорту предшественников из ядра. В цитоплазме рибосомы пре-60S проходят последние стадии созревания, включая удаление ФСР, присоединение нескольких последних RP и проверку качества функциональных центров.

Адаптерный белок Nmd3 с последовательностью ядерного экспорта контролирует взаимодействие экспортина Crm1/Xpo1 с субъединицей 60S, облегчая ее транспорт в цитоплазму [6, 43–46]. Обнаружено взаимодействие практически готовых 60S субъединиц с неканоническими факторами экспорта [6, 46].

В цитоплазме предшественник пре-40S, связываясь с несколькими ФСР, блокирующими доступ к каналу мРНК и P-сайту связывания инициаторной тРНК, проходит контроль качества. Впоследствии при участии АТР-азы Fab7 и фактора инициации трансляции эукариот 5B (eIF5B) 40S присоединяется к большой субъединице 60S, при этом GTP-азный центр eIF5B должен находиться в активной конформации. Образование комплекса гарантирует способность зрелой 40S обеспечивать гидролиз GTP. Формирование зрелого 3′-конца 18S рРНК эндонуклеазой Nob1 сопровождается диссоциацией оставшихся ФСР от 40S, диссоциацией комплекса 40S и 60S, что сигнализирует о готовности малой субчастицы к финальной стадии процессинга [12, 47–49].

Биогенез рибосом у человека гораздо сложнее, чем у дрожжей

Основные этапы и молекулярные события биогенеза рибосом консервативны. Долгое время считалось, что большинство стадий образования субъединиц в клетках человека и Saccharomyces cerevisiae одинаковы, но это оказалось сильным упрощением ситуации. Ядрышки человека имеют три отдела, а не два, как у дрожжей, они участвуют в большем числе клеточных процессов [50, 51] и содержат по меньшей мере в 20 раз больше белков, чем у дрожжей (до 300 у дрожжей; 6000 у человека) [52]. Сложность физиологических процессов у многоклеточных организмов определяет потребность в новых способах регуляции формирования рибосом, о чем свидетельствует, например, зависимость синтеза 40S субъединиц у мышей от циркадных ритмов [53, 54].

Рибосомы человека имеют больший размер, чем рибосомы дрожжей. Они содержат больше рибосомных белков, которые нередко крупнее дрожжевых. рРНК человека сравнимы по размеру с дрожжевыми за исключением 28S рРНК, которая в 1.5 раза больше. Наиболее значительно различаются размеры ETS и ITS: у человека они содержат много моно- и динуклеотидных повторов, которые, возможно, возникли вследствие ошибок репликации. Усложнение структуры рибосом высших эукариот и, соответственно, рРНК неизбежно влияет на биогенез рибосом [26], что выражается в появлении большего числа предшественников [55]. Биогенез 40S субчастиц человека сопровождается образованием минимум двух дополнительных предшественников, содержащих 30S и 21S пре-рРНК (рис. 3) [15, 56]. У дрожжей 70–80% зарождающихся транскриптов пре-рРНК подвергаются котранскрипционному расщеплению в ITS1, в то время как у млекопитающих первичный транскрипт почти всегда расщепляется посттранскрипционно [23, 57]. Показано, что процессинг ITS1 в клетках человека происходит сложнее, чем в клетках дрожжей, и нуждается как в эндо-, так и в экзонуклеолитической активности [57–59].

 

Рис. 3. Схемы созревания транскрипта 35S пре-рРНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae (А) и транскрипта 47S пре-РНК человека (В). Три из четырех рРНК: 18S, 5.8S и 25S (у дрожжей)/28S (у человека) синтезируются Pol I в виде одного длинного транскрипта. Кодирующие последовательности «зрелых» рРНК окружают 5′-, 3′-ETS, ITS1 и ITS2 – некодирующие спейсеры. На схеме показано взаимное расположение известных и предсказанных сайтов расщепления. Процессинг пре-рРНК у почкующихся дрожжей (Б). Упрощенная схема процессинга пре-рРНК человека (Г). Первичный транскрипт, 47S пре-рРНК, первоначально расщепляется на обоих концах молекулы, по сайтам 01 и 02, образуя предшественник 45S, который процессируется по двум альтернативным путям [51]. «>» (например, С2> C1’> C1) обозначает последовательное укорачивание соответствующих 3′- или 5′-концов пре-рРНК с помощью нуклеаз

 

Отличительной чертой биогенеза эукариотических рибосом является модульная сборка прерибосомных комплексов. Как у дрожжей, так и у человека UTP-A, UTP-B и UTP-C, а также мякРНК U3, гетеродимеры RCL1–BMS1 и комплексы IMP3–IMP4–MPP10 и EMG1 собираются на вновь синтезируемом пре-рРНК-транскрипте и образуют ядро так называемой процессомы SSU. Сходным образом некоторые комплексы, такие, как PeBoW человека (Nop7–Erb1–Ytm1 у дрожжей) [60] и PELP1–TEX10–WDR18 (Rix1–Ipi3–Ipi1 у дрожжей) [61], действуют во время биогенеза пре-60S субчастиц. Несмотря на эволюционную консервативность, их состав различается у разных видов; у человека выявлено несколько дополнительных РНК-хеликаз, например, DDX21 для UTP-B и DDX27 для PeBoW [62, 63]. Все это указывает на дополнительные стадии ремоделирования на ранних стадиях сборки прерибосом у человека.

Продукция 18S рРНК в клетках млекопитающих может происходить в условиях подавления синтеза 28S рРНК [64–67]. Дефицит нескольких рибосомных белков LSU человека [57] не препятствует образованию как 18S рРНК, так и ее прямого предшественника – 18S-E пре-рРНК, несмотря на серьезное снижение эффективности синтеза 28S рРНК. Эти данные подтверждают модель, согласно которой ранние этапы сборки каждой рибосомной субчастицы контролируют проксимальное расщепление в ITS1. Примечательно, что этот способ расщепления предшественников SSU и LSU не исключает существования факторов, которые могут участвовать в обоих расщеплениях ITS1. В клетках млекопитающих разделение предшественников SSU и LSU происходит одновременно, что затрудняет анализ стадий процессинга. Дефицит различных факторов сборки SSU и LSU мыши приводит к ингибированию одного из двух расщеплений ITS1 [68]. Существует гипотеза, согласно которой расщепление в двух сайтах ITS1 пре-рРНК мыши, соответствующих сайтам Е и С у человека, скоординированы с ранними этапами сборки SSU или LSU. В результате этого каждая субчастица остается прикрепленной к ITS1 до тех пор, пока не достигнет стадии созревания, готовой к отщеплению ITS1 [68].

В отсутствие ряда факторов сборки LSU ингибирует расщепление в сайте A2, что приводит к накоплению аберрантных 35S пре-рРНК [69–71] и остановке процессинга. В отличие от дрожжей, в клетках млекопитающих расщепление транскрипта происходит в любом из двух сайтов, расположенных в ITS1, что приводит к генерации основных предшественников, которые созревают до 18S и 5.8S/28S рРНК (рис. 3). Дефекты ранних этапов сборки LSU в клетках млекопитающих ингибируют расщепление в 3′-области ITS1. Разделение РНК рибосомных субчастиц у млекопитающих включает расщепление ITS1 в двух сайтах, в отличие от одного у дрожжей.

Информации о структуре прерибосом человека очень мало, потому что не существует надежных методов их выделения и очистки. Идентификация факторов синтеза рибосом человека стала возможной только при проведении высокопроизводительных скринингов на основе малых интерферирующих РНК, которые позволяют выявить дефекты продукции промежуточных звеньев пре-рРНК, накопление рибосом или компонентов прерибосом в ядрышке или нуклеоплазме [30, 72]. Такой скрининг позволил идентифицировать 286 белков, включая ортологи ФСР дрожжей, а также 74 специфичных для человека белка и мякРНК, которые, возможно, являются ФСР [30, 73] (табл. 1). Недавно с помощью скрининга факторов, влияющих на количество или морфологию ядрышек, обнаружили 139 потенциальных ФСР [74]. Однако роль отдельных ФСР человека практически не изучена. Состав, активность и структура промежуточных комплексов также изучены недостаточно, потому что большинство данных получено путем экстраполяции данных анализа прерибосом дрожжей. В ряде случаев функции даже гомологичных факторов синтеза рибосом могут различаться, например, Nip7 и Spb1 дрожжей необходимы для созревания 5.8S и 25S рРНК, а их гомологи – NIP7 и FTSJ3 человека – участвуют в синтезе 18S рРНК [75]. Отдельную проблему представляет сложность идентификации ФСР, которые непосредственно участвуют в сборке субчастиц, и их отличия от белков/сигнальных путей, которые опосредованно влияют на продукцию рибосом.

Проведен высокопроизводительный скрининг функций ядрышковых белков человека путем снижения их уровня с помощью малых интерферирующих РНК. Результаты этого скрининга позволяют разделить белки ядрышка на 12 функциональных кластеров в зависимости от их влияния на определенные стадии процессинга пре-рРНК. В разных типах клеток, включая первичные клеточные линии, наблюдали возникновение сходных дефектов [30]. Например, клетки с дефицитом UTP18 накапливают аберрантную 34S пре-рРНК, что обусловлено ингибированием реакций раннего расщепления предшественника рРНК (в сайтах 01, A0 и 1). Клетки, лишенные RPS11, накапливают значительные количества 30S пре-рРНК из-за отсутствия процессинга в сайтах A0 и 1. NOL9 в первую очередь участвует в процессинге ITS2, так как 32S пре-рРНК накапливается в отсутствие этого белка. 43S и 26S пре-рРНК обнаруживают в больших количествах в клетках с дефицитом RPS3, чем в контрольных клетках, указывая на участие этого белка в расщеплении сайтов A0 и 1. В клетках, лишенных RPS3, накапливается укороченная версия 21S – 21S-C (рис. 3).

Белки MDN1, NVL2 и AFGH2 человека являются гомологами трех дрожжевых ААА-АТР-аз (Rea1/Mdn1, Rix7, Drg1 соответственно), участвующих в высвобождении специфических факторов биогенеза пре-60S субчастиц [76]. Присутствие MDN1 в комплексах пре-60S и PELP1–TEX10–WDR18 (комплекс Rix1 в дрожжах) позволяет предположить, что этот фермент выполняет сходные функции у разных организмов – от дрожжей до человека [77]. Общие роли играют также некоторые РНК-хеликазы. Например, Dhr1 дрожжей и DHX37 человека опосредуют высвобождение мякРНК U3 [78–81]. При этом у нескольких РНК-хеликаз человека выявлены дополнительные функции, связанные с биогенезом рибосом. Например, DDX51 требуется для высвобождения специфичной для многоклеточных мякРНК U8 из комплексов пре-LSU [82], а DDX21 координирует процессинг пре-рРНК с транскрипцией, облегчая доступ «поздних» мякРНК пре-40S к комплексам [63, 78, 83].

В клетках человека идентифицированы несколько новых прерибосомных мини-комплексов [82]. Так, антиапоптотический фактор транскрипции AATF, нейрогидин (NGDN) и NOL10 образуют ядрышковый подкомплекс (ANN) [84]. Эти белки взаимодействуют с ранними прерибосомами, а отсутствие любого из компонентов ANN приводит к нарушению расщепления пре-рРНК на ранних стадиях биогенеза. XND, ядрышковый комплекс, состоящий из NF-kB-репрессирующего фактора (NKRF), РНК-хеликазы DHX15 и 5′-3′-экзонуклеазы XRN2, также участвует в ранних стадиях сборки рибосом человека [85]. NKRF рекрутирует XRN2 в прерибосомные комплексы, где он принимает участие в процессинге пре-рРНК и удалении вырезанных фрагментов пре-рРНК. NKRF также стимулирует АТР-азную и хеликазную активность DHX15 [85], т.е., по-видимому, эти белки совместно функционируют на ранней стадии ремоделирования пре-рРНК. Дрожжевой гомолог DHX15, Prp43, участвует в высвобождении мякРНК из частиц пре-60S и способствует расщеплению 3′-конца 18S рРНК [86, 87]. Фактор транскрипции, гетеродимер NF45–NF90, связывает двухцепочечную РНК в составе пре-60S. Отсутствие этих факторов, хотя и не влияет на процессинг рРНК, но вызывает изменения морфологии ядрышек и накопление пре-60S-комплексов [88].

Недавно в лаборатории Бекмана определили крио-ЭМ-структуры поздних ядерных и цитоплазматических комплексов пре-40S субчастиц человека [89]. Структура одного из промежуточных состояний позволила выявить положение фактора биогенеза RRP12 и двух метилтрансфераз (BUD23 и TRM112) в голове 40S субчастицы. Более поздняя цитоплазматическая пре-40S частица человека очень сходна с пре-40S дрожжей с консервативными ФСР в идентичных положениях. Таким образом, структура пре-40S и последние стадии механизма процессинга 18S рРНК являются эволюционно консервативными [89].

Рибосомные белки и их роль в формировании структуры рРНК и созревающих субчастиц

Основная роль рибосомных белков заключается в поддержании структуры и функции рибосом, а также продукции активных рибосом. Математическое моделирование показало фундаментальное преимущество сборки сложных комплексов, в частности рибосом, из многочисленных некрупных рибосомных белков, а не из небольшого числа более крупных полипептидов [90]. Известно, что большинство человеческих RP представлены в единственном варианте, а многие RP дрожжей имеют две изоформы. Удивительно, но ~50% транскриптов, которые синтезирует РНК-полимераза II человека, – это мРНК RP [91], и концентрация 80 RP в клетке тщательно поддерживается на уровне, оптимальном для сборки рибосом. Большинство генов RP имеют один или несколько общих промоторных элементов (GABP, Sp1, YY1) для синхронизации транскрипции. мРНК всех RP содержат 5′-концевой олигопиримидиновый тракт (5′-TOP), что позволяет также корегулировать их трансляцию [92]. Рибосомные белки, как правило, положительно заряжены, склонны к агрегации и деградации. Шапероны, связываясь (часто котрансляционно) с вновь синтезируемыми RP, стабилизируют их, а также облегчают импорт в ядро и присоединение к прерибосомным комплексам [93, 94]. В клетках человека найдены гомологи многих шаперонов RP дрожжей – это белки Bcp1/BCCIP, Syo1/HEATR3, Rrb1/GRWD1, Sqt1/AMMP и Tsr2/TSR2. В то же время другие, например Acl4 и Yar1, у многоклеточных организмов, по-видимому, не сохранились [78, 93, 95–98]. Примечательно, что рибосомные белки RPL5 (uL18) и RPL11 (uL5) связываются с прерибосомами в виде подкомплекса вместе с 5S рРНК [99]. Пре-5S рРНК синтезируется с помощью РНК-полимеразы III, и для созревания ее 3′-конца необходимы экзонуклеазы REX1, REX2 и REX3, а также RPL5 [100–102]. Как у дрожжей, так и у человека Rrs1/RRS1 и Rpf2/BXDC1 необходимы для интеграции 5S РНП в комплексы пре-60S, а белок-супрессор опухолей PICT1/GLTSCR2 является дополнительным фактором в клетках человека [102, 103]. Взаимодействие многих RP с прерибосомами изначально нестабильно, но правильное сворачивание и образование третичных структур в рРНК постепенно приводит к стабильному включению их в рибосомные комплексы. Фундаментальной особенностью сборки рибосом, которая сохраняется не только у эукариот, но происходит также в ходе синтеза прокариотических рибосом [104], является иерархическое включение RP, что способствует последовательной организации отдельных доменов субъединиц. Сначала белки 5′-, центрального и 3′-минорного доменов 18S рРНК формируют «тело» SSU, а затем происходит сборка «головы» и «клюва» [105]. Точно так же RP, находящиеся на поверхности LSU, которая контактирует с растворителем, включаются в структуру на первых этапах сборки, а белки, которые связываются с межсубъединичным интерфейсом и с центральным протуберанцем, встраиваются позже [106]. Универсальный характер иерархического порядка включения RP предполагает, что пошаговая сборка, стабилизация и уплотнение различных доменов рибосомных субчастиц являются важным механизмом, который помогает обеспечить правильность продвижения по пути сборки.

ВЫВОДЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

На протяжении многих лет сложный путь биогенеза эукариотической рибосомы изучали по большей части на клетках дрожжей, где простота генетических манипуляций в сочетании с возможностью выделения большого количества прерибосомных комплексов для композиционного и структурного анализа позволили получить большое количество данных о фундаментальных аспектах сборки рибосом. Недавние исследования подтверждают, что многие этапы сборки рибосом у дрожжей и человека схожи, а возникающие различия дают важную информацию о конкретных стадиях биогенеза, которые адаптировались в ходе эволюции. Хотя обнаружено множество факторов, необходимых для биогенеза рибосом человека, вполне вероятно, что перечень ФCР будет значительно расширен. Основные задачи заключаются в том, чтобы определить, какие из факторов, необходимых для синтеза рибосом, непосредственно связаны с прерибосомными комплексами, и проанализировать отдельные роли таких белков во время сборки субъединиц. Недавно полученные крио-ЭМ-структуры прерибосом дрожжей предоставили огромное количество информации о временном порядке, распределении и молекулярных функциях многих ФCР. Структурный анализ прерибосом должен значительно улучшить наше понимание сборки рибосом человека.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 20-04-00796 А «Анализ белково-нуклеинового состава интермедиатов сборки рибосомных субчастиц в генетически модифицированных клетках человека».

Об авторах

Анастасия Андреевна Моралева

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: deryabin95@mail.ru
Россия, 117997, Москва

Александр Сергеевич Дерябин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: deryabin95@mail.ru
Россия, 117997, Москва

Юрий Петрович Рубцов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: deryabin95@mail.ru
Россия, 117997, Москва

Мария Петровна Рубцова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mprubtsova@gmail.com
Россия, 119991, Москва

Ольга Анатольевна Донцова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Сколковский институт наук и технологий

Автор, ответственный за переписку.
Email: deryabin95@mail.ru
Россия, 117997, Москва; 119991, Москва; 121205, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы