Внеклеточные везикулы микоплазм способны проникать в клетки эукариот in vitro и модулировать их протеом

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВ – внеклеточные везикулы; HSF – фибробласты кожи человека; 2D-DIGE – дифференциальный двумерный электрофорез; MALDI-TOF/TOF – времяпролетная/времяпролетная матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; PBS – фосфатно-солевой буфер.

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярные механизмы взаимодействия микоплазм (мельчайших, способных к самостоятельному воспроизведению прокариот, объединенных в класс Mollicutes) с клетками эукариот, обеспечивающие персистенцию инфекционных агентов, не ясны [1]. К настоящему времени установлено, что взаимодействие клеток микро- и макроорганизмов опосредуется ВВ, которые переносят соединения широкого спектра, включая белки, ДНК, РНК, в том числе короткие РНК [2]. ВВ бактерий могут проникать в клетки эукариот и модулировать иммунореактивность – такая способность обнаружена у некоторых возбудителей персистентных инфекций. ВВ микоплазм описаны [3, 4], но доказательства их способности проникать в эукариотические клетки пока отсутствуют.

В представленной работе изучена способность ВВ A. laidlawii – убиквитарной микоплазмы, инфицирующей высших эукариот, и основного контаминанта клеточных культур и вакцинных препаратов, проникать в культивируемые in vitro клетки эукариот и модулировать клеточный протеом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культуры клеток

Использовали культуру A. laidlawii PG8B в середине лог-фазы роста и первичную культуру фибробластов кожи человека (HSF – Human Skin Fibroblast). Фибробласты получали из биопсий кожи и культивировали в среде αMEM с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина при 37°C и 5% CO₂. Образцы кожи человека отбирали в соответствии с протоколом эксперимента, утвержденным Экспертной комиссией по биомедицинской этике Казанского федерального университета и Республиканской клинической больницы (№ 218, 15.11.2012). От доноров были получены письменные информированные согласия.

Выделение внеклеточных везикул

ВВ A. laidlawii выделяли как описано [3]. Изолированные везикулы анализировали с помощью трансмиссивной электронной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии как описано [3]. Микровезикулы, продуцируемые HSF в присутствии и в отсутствие везикул A. laidlawii, выделяли согласно [5]. Отбирали культуральную среду контрольных и опытных культур HSF. Клетки и дебрис удаляли с помощью центрифугирования (1500 g, 10 мин). Супернатант центрифугировали при 100000 g в течение 70 мин (ротор MLA-80, Beckman Coulter). Осадки ресуспендировали в PBS и центрифугировали при 100000 g, 70 мин. Промытые осадки ресуспендировали в PBS, наслаивали на градиент плотности Optiprep (10–20–30–40–45%) и ультрацентрифугировали при 100000 g в течение 17 ч. Фракции отбирали, трижды отмывали от Optiprep, суспендировали в PBS и хранили при 4°C до анализа. ВВ A. laidlawii добавляли к HSF в количестве 100 мкг (по общему белку) и инкубировали в течение 4 ч. Культуры фибробластов с ВВ и без ВВ составили опыт и контроль соответственно. Везикулярную ДНК A. laidlawii детектировали с помощью ПЦР как описано [6].

Анализ с помощью конфокальной микроскопии

Препараты ВВ A. laidlawii окрашивали DiI, акридиновым оранжевым и Hoechst 33342 для визуализации мембраны, РНК и ДНК соответственно. Препараты микровезикул HSF окрашивали с помощью антител против p53, конъюгированными с Alexa Fluor 647 и DiO для визуализации мембраны. Несвязавшиеся молекулы красителей удаляли с использованием концентратора с пределом отсечения 3 кДа. Препараты исследовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss LSM 780.

Для визуализации интернализации ВВ A. laidlawii фибробласты культивировали на покровных стеклах. ВВ A. laidlawii окрашивали флуоресцентными красителями, как описано выше, и добавляли к HSF. Фибробласты промывали буфером и фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом. Ядра клеток окрашивали DAPI, а F-актин – с помощью антител, конъюгированных с Alexa Fluor 488. Слайды исследовали под микроскопом, данные обрабатывали в программе ZEN 9.0.

Микроскопические изображения окрашенных HSF и ВВ A. laidlawii в темном поле получали на микроскопе Olympus BX51 [7]. Данные обрабатывали в программе Exponent 7.

Иммуноферментный анализ

Для количественного определения цитокинов HSF удаляли центрифугированием, концентрации интерлейкинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в супернатанте определяли методом ELISA («Вектор-Бест», Россия) согласно протоколу производителя.

Протеомный анализ

Протеомный анализ HSF проводили согласно [8]. Клетки открепляли от пластика с помощью трипсина, трижды отмывали от питательной среды с помощью PBS. Осадки клеток растворяли в буфере (8 M мочевина, 2 M тиомочевина, 16.7% раствора (30% CHAPS + 10% NP-40)) и обрабатывали смесью нуклеаз (Micrococcal Nuclease Mix). Концентрацию белка в образцах измеряли по методу Бредфорд. Белки окрашивали с красителями CyDye DIGE Cy3 (контроль) и CyDye DIGE Cy5 (опыт), реакцию останавливали с помощью 10 мМ раствора лизина. Эффективность окрашивания проверяли с помощью 1D-электрофореза в ПААГ и сканирования геля на сканере Typhoon Trio. Образцы объединяли (брали равные количества каждого образца), добавляли дитиотреитол (ДТТ) до 80 мМ и амфолиты 3–10 до 0.2% и разделяли с помощью 2D-электрофореза. Гели сканировали на сканере Typhoon Trio. Для визуализации белковых пятен гели окрашивали нитратом серебра.

Белковые пятна на гелях анализировали с помощью программы PDQuest v.8.01 (Bio-Rad). Вырезали пятна, соотношение содержания белка в которых в контроле и опыте было больше 1.5. Кусочки геля промывали в смеси ацетонитрил : 200 мМ NH₄HCO₃ (1 : 1). Затем инкубировали с ДТТ и йодацетамидом. Дегидратацию гелей проводили с помощью ацетонитрила. К гелю добавляли рабочий раствор трипсина, инкубировали в течение 60 мин при 4°С. Трипсинолиз проводили при 37°С в течение ночи. Пептиды экстрагировали с помощью 0.5% раствора ТФУ. Идентификацию белков с помощью MALDI-времяпролетно-времяпролетного масс-спектрометра Ultraflextreme проводили согласно протоколу [8]. Образцы пептидов смешивали с раствором матрицы (1% 2,5-дигидроксибензойная кислота, 20% ацетонитрил, 0.5% ТФУ), наносили на мишень и высушивали на воздухе. Масс-спектрометрию проводили в режиме положительных ионов в диапазоне 500–4000 Да. Точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.007% с учетом возможного окисления метионинов и модификации цистеинов акриламидом. Белки идентифицировали с использованием программы Mascot в режиме Peptide Mass Fingerprint (Matrix Science) и базы UniProt. При score ≥ 44 идентификацию белка считали надежной (p < 0.05).

Для функциональной аннотации идентифицированных белков использовали базу данных DAVID (The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery). Определяли метаболические пути и клеточные процессы, в которых эти белки участвуют (согласно KEGG); генную онтологию определяли с помощью GO (молекулярная функция, биологический процесс, локализация продукта).

Вестерн-блотинг

Таргетное количественное определение белков проводили с помощью Вестерн-блотинга. Белки из лизатов HSF разделяли в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond C. Использовали антитела (Sigma, США) к p53, HSP7C и β-актину, а также вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Мембраны инкубировали последовательно с первичными и вторичными антителами, а затем окрашивали 3,3′-диаминобензидином (Sigma). Гели анализировали в программе ImageJ, используя в качестве контроля β-актин для нормирования интенсивности сигналов исследуемых образцов.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трех повторностях. Образцы анализировали через 4 ч после инкубации HSF с ВВ микоплазмы во всех случаях, а также дополнительно через 48 ч при анализе экспрессии цитокинов. Статистический анализ проводили с использованием пакета RStudio. Значения р < 0.05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее с помощью ПЦР и RNA-Seq нами было показано, что изолированные ВВ A. laidlawii PG8B содержат ДНК и РНК [9]. В данной работе установлено, что содержащие РНК ВВ A. laidlawii способны проникать в фибробласты кожи человека, культивируемые in vitro: ВВ микоплазмы обнаруживаются как в цитоплазме, так и в ядре эукариотических клеток при их совместном инкубировании. На рис. 1Ж–И показаны ВВ A. laidlawii, визуализируемые внутри клеток эукариот; на рис. 1К, Л представлены фотографии изолированных ВВ A. laidlawii, полученные с помощью трансмиссивной электронной и сканирующей микроскопии соответственно; на рис. 2 – детекции ДНК A. laidlawii в фибробластах с помощью ПЦР.

 

Рис. 1. Взаимодействие фибробластов кожи человека с ВВ A. laidlawii. Визуализация изолированных ВВ A. laidlawii (А–Е, К, Л) и инкубированных с HSF (Ж–И). Конфокальная лазерная микроскопия (А–Г, Ж): А – трейсер DiI (окрашивание липидов везикул, красный цвет); Б – Hoechst (окрашивание ДНК везикул, синий цвет); В – акридиновый оранжевый (АО) (окрашивание РНК везикул, зеленый цвет); Г – совмещенная микрофотография (DiI, Hoechst, AO). Темнопольная (Д, З) и флуоресцентная (Е, И) микроскопия: (Д) агрегат везикул в темном поле и (Е) при флуоресценции трейсера DiI; Ж – флуоресценция ВВ A. laidlawii, окрашенных DiI (красный цвет), в полости HSF. Ядро клеток окрашено DAPI, актиновые филаменты – антителами, конъюгированными с красителем Alexa Fluor 488 (зеленый цвет); З – ВВ A. laidlawii в полости HSF в темном поле и при флуоресценции трейсера DiI (И), актиновые филаменты HSF окрашены антителами, конъюгированными с красителем Alexa Fluor 488 (зеленый цвет). Трансмиссивная электронная (К) и сканирующая (Л) микроскопия ВВ A. laidlawii (стрелки показывают индивидуальные везикулы)

 

Рис. 2. Детекция ДНК A. laidlawii в ВВ микоплазмы и HSF с помощью ПЦР. ДНК экстрагирована из клеток A. laidlawii (А), ВВ A. laidlawii (Б), фибробластов (HSF), инкубированных без/с ВВ A. laidlawii (В, Г соответственно). M – маркер длин ДНК. В ПЦР использовали праймеры, специфичные к нуклеотидным последовательностям генов pnp, tuf, ftsZ (кодирующих полирибонуклеотид-нуклеотидилтрансферазу, фактор элонгации Tu, белок деления клетки FtsZ соответственно), а также спейсерному региону 16S–23S рРНК A. laidlawii

 

Использование разных флуоресцентных красителей позволяет визуализировать ДНК (Hoechst) и РНК (акридиновый оранжевый), а также мембранные липиды (DiI) ВВ A. laidlawii (рис. 1А–В). Если объект имеет и липидную мембрану, и ДНК, и РНК, то при совмещении соответствующих фотографий регистрируется характерное изменение цветового сигнала, обусловленное наложением флуоресценции, что и наблюдается в случае ВВ микоплазмы (рис. 1Г).

Поскольку размеры везикул у A. laidlawii (диаметр большинства менее 120 нм) не позволяют визуализировать отдельные везикулы с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, для анализа везикулярных препаратов мы использовали также варианты микроскопии более высокого разрешения. Так, изображения ВВ A. laidlawii получены нами с помощью трансмиссивной электронной (рис. 1К) и сканирующей (рис. 1Л) микроскопии. Индивидуальные везикулы имеют характерную морфологию. Они представляют собой сферические, окруженные мембраной наноструктуры, размер которых варьирует от 30 до 120 нм.

При использовании темнопольной флуоресцентной микроскопии везикулы микоплазмы регистрируются в виде агрегатов (рис. 1Д,Е). Аналогичные изображения получены и для ВВ Pseudomonas aeruginosa [10] – окрашенные флуоресцентными красителями (DiO и EdU) изолированные и интернализованные эпителиальными клетками легких A549 ВВ этой бактерии визуализировались при использовании конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в виде скоплений. Это может быть связано с наложением эмиссии используемых красителей от индивидуальных объектов, расположенных рядом друг с другом. Связано ли это также и с особенностями путей интернализации бактериальных ВВ, еще предстоит выяснить.

Короткие РНК бактерий в везикулах могут функционировать как эукариотические микроРНК и подавлять трансляцию за счет связывания с мРНК-мишенями [11]. Это предположение верифицировано в модельных экспериментах с содержащимися в везикулах P. aeruginosa короткими РНК, гомологичными тРНК^Мет. Взаимодействие соответствующих везикулярных РНК бактерий приводило к подавлению экспрессии ИЛ-8 и угнетению врожденного звена иммунного ответа, способствующее персистенции микроорганизмов. Ранее мы показали, что ВВ A. laidlawii также содержат короткие РНК, в том числе гомологичные тРНК^Мет [9]. Однако достоверные изменения в экспрессии ИЛ-8, а также другого критичного провоспалительного цитокина – ИЛ-6 – при заражении HSF везикулами микоплазмы в настоящем исследовании не обнаружены (22.71 ± 0.89 и 19.69 ± 2.86 пг/мл в контроле и опыте для ИЛ-8, p < 0.05; 11.14 ± 0.22 и 11.42 ± 0.78 пг/мл в контроле и опыте для ИЛ-6, p < 0.05).

Время и уровень изменения экспрессии цитокинов могут существенно варьировать в зависимости от среды, клеточной линии, бактериального штамма, продуцирующего везикулы, количественного соотношения эукариотических клеток и бактериальных везикул. Времязависимая реакция фибробластов человека на интернализацию A. laidlawii и экспрессия цитокинов при этом практически не изучены. Известна только одна работа [12], посвященная анализу времязависимого изменения транскриптомного профиля клеток человека (HeLa) при интернализации и персистенции клеток микоплазмы (Mycoplasma hominis). В этой работе выявлены значимые изменения экспрессии генов цитокинов через 4 и 48 ч после начала совместной инкубации бактериальных и эукариотических клеток: и в том, и в другом случае в стресс-реактивном пуле оказался ген ИЛ-6, но не ИЛ-8. В этой связи мы проанализировали образцы не только через 4 ч, но также через 48 ч от начала совместной инкубации ВВ микоплазмы и HSF. Обнаружено статистически значимое изменение экспрессии ИЛ-6 (6.42 ± 0.6 и 5.13 ± 0.28 пг/мл в контроле и опыте соответственно; p < 0.05), но не ИЛ-8 (8.59 ± 3.23 и 17.64 ± 5.88 пг/мл в контроле и опыте соответственно; p < 0.05). Полученные нами данные указывают на различия в молекулярных механизмах индукции иммунокомпромисса у микоплазм и классических бактерий.

Толерантность врожденного звена иммунитета, ассоциированная с отсутствием оперативной модуляции экспрессии провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-8), не отменяет клеточную реактивность на инфекционный агент – молекулярную сигнатуру заражения можно выявить с помощью современных методов высокого разрешения, в том числе вариантов иммунной электронной микроскопии, а также омикс-профилирования [13]. В результате применения комбинации 2D-DIGE и MALDI-TOF/TOF – технологии протеомного анализа, основанной на использовании двумерного гель-электрофореза полипептидов, окрашенных разными (в контроле и опыте соответственно) флуоресцентными красителями, и последующей идентификации дифференциально представленных белков с помощью MALDI-TOF/TOF и программы Mascot в режиме Peptide Mass Fingerprint, а также инструмента функциональной аннотации DAVID, нами установлено, что заражение HSF внеклеточными везикулами A. laidlawii приводит к модуляции протеома фибробластов – изменение представленности белков регистрируется через 4 ч после начала инкубации ВВ микоплазмы с эукариотическими клетками, т.е. когда изменение секреции цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 не обнаруживается. Дифференциально экспрессируемые белки фибробластов (депонированы нами в базу данных ProteomeXchange, № PXD027040) участвуют в фолдинге, формировании цитоскелета, биогенезе ВВ (экзосомы и микровезикулы), иммунореактивности и пролиферации клеток. Большинство идентифицированных белков являются стресс-реактивными, они могут участвовать в клеточном ответе на бактериальные и/или вирусные инфекции [14]. Среди них оказались белки, связанные как с позитивной, так и с негативной регуляцией апоптоза (TERA, LEG1 и ENPL, CH60, ANXA5, GRP78, HSPB1, CRYAB соответственно).

Известные ограничения варианта протеомного анализа 2D-DIGE и MALDI-TOF/TOF (низкокопийные белки не визуализируются при окрашивании гелей, высококопийные белки накладываются и «скрывают» расположенные рядом пятна, сильнощелочные белки плохо изоэлектрофокусируются, высокомолекулярные белки не проходят через поры используемых гелей, низкомолекулярные белки не могут быть эффективно разделены, гидрофобные белки не растворяются в используемом буфере), в том числе в отношении выявления пула дифференциально экспрессированных белков в эукариотической клетке (соотношение визуализируемого, анализируемого, репортируемого и теоретического протеомов существенно отстоит от соотношения в клетках бактерий с маленьким геномом – оптимального для соответствующих исследований) [15, 16], определяют пределы его возможностей – далеко не все белки, дифференциально экспрессирующиеся в эукариотической клетке, могут быть обнаружены при использовании глобального протеомного профилирования. В этой связи для оценки экспрессии актуальных конкретных белков, не вошедших в выявленный стресс-реактивный пул, необходимо проводить дополнительный таргетный анализ, например, с помощью Вестерн-блотинга, который рекомендуется использовать и для валидации данных глобального протеомного профилирования [17]. Поскольку в пуле идентифицированных белков не оказалось p53 – ключевого игрока исхода про- и антиапоптотических процессов [18], нами проведен таргетный анализ представленности этого белка в фибробластах, а также в секретируемых фибробластами внеклеточных везикулах (рис. 3). Согласно полученным данным, заражение фибробластов кожи человека везикулами A. laidlawii приводит к увеличению количества p53 в клетках и не подавляет его секрецию – p53 обнаруживается во внеклеточных везикулах фибробластов как контрольных, так и опытных образцов.

 

Рис. 3. Детекция белков в фибробластах кожи человека с помощью Вестерн-блотинга (А–В) и p53 в микровезикулах фибробластов с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Г, Д). Вестерн-блотинг белков фибробластов с антителами к β-актину (А), р53 (Б) и HSP7C (В). Дорожки 1 и 2 – белки фибробластов, инкубированных без/с ВВ A. laidlawii соответственно. Интенсивность полос определена с помощью ImageJ и указана под дорожками. Белок р53 в микровезикулах, продуцируемых фибробластами кожи человека, инкубированными с (Г) и без (Д) ВВ A. laidlawii. Стрелки указывают на сигнал р53

 

Внеклеточные везикулы эукариот включают разные группы секретируемых во внеклеточное пространство везикул, которые различаются по функциям, размеру, составу и биогенезу – экзосомы, микровезикулы, апоптотические тельца. Микровезикулы образуются при выпячивании плазматической мембраны; диаметр этих структур составляет 100–1000 нм, а плотность 1.25–1.30 г/мл. Апоптотические тельца высвобождаются из плазматической мембраны клеток на поздней стадии апоптоза; диаметр этих структур равен 1–5 мм, а плотность – 1.18–1.28 г/мл. Экзосомы образуются внутри клеток из поздних эндосом, называемых мультивезикулярными тельцами (при слиянии поздней эндосомы с плазмалеммой экзосомы оказываются за пределами клетки); диаметр этих структур составляет 30–150 нм, а плотность – 1.13–1.21 г/мл [19, 20]. Разница размеров и плотности везикул соответствующих групп определяет относительные возможности их дифференциации: апоптотические тельца можно отличить от более мелких по размеру ВВ (экзосом и микровезикул) с помощью микроскопии, а экзосомы и микровезикулы, благодаря разнице в размерах и плотности, разделяются на стадии ультрацентрифугирования и ультрацентрифугирования в градиенте плотности Optiprep. При использованном в нашей работе режиме центрифугирования экзосомы не осаждаются на дно пробирки, а в градиенте плотности находятся выше, чем микровезикулы. Визуализация образцов с помощью микроскопии высокого разрешения позволяет определить размеры структур. Структуры, соответствующие по размерам апоптотическим тельцам, в наших препаратах не были обнаружены – диаметр индивидуальных везикул, выделенных из эукариотических клеток, в исследованных образцах оказался в пределах 200–800 нм, что указывает на возможность их принадлежности к группе микровезикул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами показано, что ВВ A. laidlawii – убиквитарной микоплазмы – основного контаминанта клеточных культур, способны проникать в эукариотические клетки in vitro и модулировать клеточный протеом. Молекулярные механизмы взаимодействия везикул микоплазмы с клетками эукариот и вклад соответствующих наноструктур в молекулярную машинерию клеточной пермиссивности еще предстоит выяснить. Выяснение этих механизмов важно как для фундаментальных исследований простейших прокариот, так и практических разработок контроля гипермутабильных бактерий, инфицирующих человека, животных и растения, контаминирующих клеточные культуры и вакцинные препараты.

Работа выполнена при финансовой поддержке государственного задания ФИЦ Казанского научного центра РАН. Авторы выражают благодарность зав. лабораторией защитных механизмов клетки Института цитологии РАН д.б.н. И.В. Гужовой за помощь в проведении таргетного анализа белков.

Об авторах

Алексей А. Музыкантов

Казанский институт биохимии и биофизики – обособленное структурное подразделение ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: muzaleksei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8651-0770

старший научный сотрудник

Россия, 420111, Казань

Эльвира В. Рожина

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: elf_vei@list.ru
Россия, 420008, Казань

Равиль Ф. Фахруллин

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: kazanbio@gmail.com
Россия, 420008, Казань

Марина О. Гомзикова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: marina.gomzikova.gmo@gmail.com
Россия, 420008, Казань

Мария А. Золотых

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: maria.a.zolotykh@gmail.com
Россия, 420008, Казань

Ольга А. Чернова

Казанский институт биохимии и биофизики – обособленное структурное подразделение ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»

Email: ol.chernova2010@yandex.ru
Россия, 420111, Казань

Владислав М. Чернов

Казанский институт биохимии и биофизики – обособленное структурное подразделение ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук»

Email: chernov@kibb.knc.ru
Россия, 420111, Казань

Список литературы

Дополнительные файлы