Полиморфизм rs1800470 гена TGFB1 связан с фиброзом миокарда у реципиентов сердца

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

TGFβ1 – трансформирующий фактор роста β1; ДКМП – дилатационная кардиомиопатия; ИБС – ишемическая болезнь сердца; ОНП – однонуклеотидный полиморфизм; ОШ – отношение шансов; ПЦР – полимеразная цепная реакция.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время на фоне увеличения средней продолжительности жизни и снижения смертности от острых заболеваний в молодом и среднем возрасте отмечается увеличение количества больных с синдромом сердечной недостаточности. Трансплантация сердца является эффективным методом лечения терминальной сердечной недостаточности, способствующим улучшению прогноза и качества жизни обреченных больных. Наблюдаемое в последние годы увеличение продолжительности жизни реципиентов сердца достигнуто в основном за счет снижения смертности в раннем посттрансплантационном периоде. Один из факторов, оказывающих негативное влияние на отдаленный прогноз после трансплантации сердца, – фиброз миокарда, развитие которого сопровождается нарушением структуры и функции сердечного трансплантата [1].

Фиброз миокарда сердечного трансплантата – это многофакторный процесс, к развитию и прогрессированию которого предрасполагает ряд клеточных и молекулярных факторов [2]. Исследования последних лет показали, что одним из патогенетических факторов фиброза является трансформирующий фактор роста β1 (TGFβ1) – профибротический медиатор, вовлеченный в продукцию внеклеточного матрикса [3].

Получены данные о генетической детерминированности уровня TGFβ1 в периферической крови. Показано, что некоторые виды генетического полиморфизма гена TGFB1 ассоциированы c тяжестью коронарного атеросклероза и предрасположенностью к инфаркту миокарда, и эта связь различается в разных этнических группах [4, 5].

Белок TGFβ1 кодируется геном TGFB1, расположенным на хромосоме 19. На сегодняшний день в гене TGFB1 идентифицированы восемь однонуклеотидных полиморфизмов и один делеционно-инсерционный полиморфизм, влияющие на экспрессию и активность TGFβ1 [6]. Среди полиморфизмов гена TGFB1, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, выделяют три: rs1800469, локализованный в промоторной области; rs1800470 (замена лейцина на пролин в кодоне 10) и rs1800471 (замена аргинина на пролин в кодоне 25) расположены в кодирующем регионе. Данные о влиянии полиморфизмов гена TGFB1 на отдаленные результаты трансплантации сердца и предрасположенность к развитию посттрансплантационных осложнений у реципиентов сердца – острого и хронического (болезнь коронарных артерий пересаженного сердца) отторжения трансплантата – немногочисленны и неоднозначны [7–9].

Цель настоящего исследования состояла в выявлении связи полиморфизмов rs1800469, rs1800470, rs1800471 гена TGFB1 с фиброзом миокарда трансплантата у реципиентов сердца.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В исследование включено 110 случайно отобранных реципиентов, которым в Национальном медицинском исследовательском центре трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова в период с 2017 по 2019 год была выполнена трансплантация донорского сердца; все этнически русские, среди них мужчин – 99 (84%), средний возраст реципиентов составил 44 ± 14 (от 16 до 70) лет. У 57 пациентов причиной развития терминальной сердечной недостаточности, определившей показания к трансплантации, была дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), у 53 – ишемическая болезнь сердца (ИБС). Срок наблюдения после трансплантации сердца до 4 (2.3 ± 1.3) лет.

Обследование и лечение пациентов проведены в соответствии с клиническими рекомендациями Российского трансплантологического общества. Эндомиокардиальную биопсию у реципиентов сердца выполняли по протоколу при плановом клинико-лабораторном обследовании или по показаниям; эндомиокардиальные биоптаты оценивали на основании результатов гистологического и иммуногистохимического исследования. Для верификации фиброза сердечного трансплантата тонкие срезы ткани эндомиокарда окрашивали трихромом по Массону [10].

Геномную ДНК выделяли из периферической крови согласно протоколу с помощью коммерческого набора QIAamp DNA Blood Mini Kit на автоматическом анализаторе QIAcube™ (Qiagen, Германия). Полиморфные варианты rs1800469, rs1800470, rs1800471 гена TGFB1 анализировали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с помощью зондов TaqMan (Applied Biosystems, США) на амплификаторе CFX96™ (Bio-Rad, США). Зонды с флуоресцентными метками по каналам VIC (аллель 1)/FAM (аллель 2) детектировали на каждом цикле амплификации. Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения BioRad CFX manager 3.0 software.

Статистический анализ проводили с помощью пакета прикладных программ для научно-технических расчетов IBM SPSS STATISTICS 20 (IBM SPSS Inc., США). Для подтверждения независимого распределения аллелей в изучаемых полиморфизмах проверяли их соответствие закону Харди–Вайнберга [11]. Частоты генотипов или отдельных аллелей в различных группах сравнивали с использованием критерия χ² Пирсона. Возможное влияние генотипа на признак оценивали, определяя отношение шансов и 95%-ные доверительные интервалы. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведено геномное типирование полиморфных участков rs1800469, rs1800470, rs1800471 гена TGFB1 у реципиентов сердца. Не выявлено отклонений в распределении аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов от равновесия Харди–Вайнберга в группе сравнения, в которую вошли здоровые лица (43), не отличающиеся значимо по полу и возрасту от группы реципиентов сердца. У реципиентов сердца равновесие Харди–Вайнберга для всех трех полиморфизмов не соблюдалось (табл. 1).

 

Таблица 1. Анализ данных на соответствие закону Харди–Вайнберга

ОНП Группы	rs1800469	rs1800470	rs1800471
Здоровые лица	χ2 = 1.0 p = 0.31	χ2 = 0.02 p = 0.81	χ2 = 0.006 p = 0.93
Реципиенты сердца	χ2 = 4.32 p = 0.03*	χ2 = 9.3 p = 0.002*	χ2 = 5.73 p = 0.01*

*p <0.05 – не соответствует закону Харди–Вайнберга.

ОНП – однонуклеотидный полиморфизм.

 

Отклонение от закона Харди–Вайнберга в группе реципиентов сердца может быть связано с сердечно-сосудистой патологией, хотя нельзя исключить и влияния небольшого размера выборки, что необходимо проверить на более многочисленной выборке.

Распределение аллелей и генотипов гена TGFB1 у реципиентов сердца и в группе сравнения представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей полиморфных участков гена TGFB1 у реципиентов сердца и здоровых лиц

Генотип/аллель	Реципиенты сердца, n (%)	Здоровые лица, n (%)	р
rs1800469
AA AG GG А G	22 (20) 42 (38) 46 (42) 64 (58) 88 (80)	6 (14) 16 (37) 21 (49) 22 (51) 37 (86)	0.38 0.91 0.43 0.43 0.38
rs1800470
AA AG GG А G	91 (83) 14 (13) 4 (4) 105 (96) 18 (17)	40 (93) 3 (7) - 43 (100) 3 (7)	0.12 0.30 0.20 0.20 0.12
rs1800471
GG GC CC G C	3 (3) 14 (13) 92 (84) 17 (16) 106 (97)	- 1 (2) 42 (98) 1 (2) 43 (100)	0.27 0.051 0.023* 0.023* 0.27

*p <0.05.

 

Сравнительный анализ распределения генотипов и аллелей полиморфизмов rs1800469, rs1800470 гена TGFB1 не выявил различий между здоровыми лицами и реципиентами сердца. Однако обнаружены различия в распределении аллелей и генотипов полиморфизма rs1800471 гена TGFB1 (рис. 1).

 

Рис. 1. Частотное распределение генотипов и аллелей полиморфизма rs1800471 гена TGFB1 у реципиентов сердца и здоровых лиц. *p <0.05 в сравнении со здоровыми лицами

 

Среди реципиентов сердца носители генотипа CC rs1800471 гена TGFB1 встречались реже, чем среди здоровых лиц (р = 0.023, ОШ = 0.12, 95% ДИ: 0.017–1.0), а аллель G – чаще (в составе генотипов GG и GC) (р = 0.023, ОШ = 7.76, 95% ДИ: 1.0–60.2).

Анализ связи частот распределения исследованных полиморфизмов с демографическими и клиническими характеристиками реципиентов сердца позволил выявить статистически значимые ассоциации с полом, диагнозом и фиброзом миокарда трансплантированного сердца.

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма rs1800470 гена TGFB1 у мужчин и женщин в группе реципиентов сердца различалось статистически значимо (рис. 2).

 

Рис. 2. Частотное распределение генотипов и аллелей полиморфизма rs1800470 гена TGFB1 у мужчин и женщин, *p <0.05 в сравнении с женщинами

 

У мужчин – реципиентов сердца, носительство генотипа GG встречалось реже, чем у женщин (р ≤ 0.05). Сравнение частот отдельных аллелей показало, что частота носительства аллеля A rs1800470 гена TGFB1 у мужчин выше (р = 0.007, ОШ = 10.6, 95% ДИ: 1.34–85.01). Не выявлено различий в распределении генотипов и аллелей полиморфизмов rs1800469, rs1800471 гена TGFB1 у мужчин и женщин.

При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфизмов гена TGFB1 в зависимости от заболевания, приведшего к развитию сердечной недостаточности и последующей трансплантации донорского сердца, установлено, что у пациентов с ДКМП генотип GG rs1800469 встречался чаще, чем у пациентов с ИБС (р = 0.03, ОШ = 2.68, 95% ДИ: 1.061–6.793) (рис. 3).

 

Рис. 3. Частотное распределение генотипов и аллелей полиморфизма rs1800469 гена TGFB1 у пациентов с ДКМП и ИБС, *p <0.05 в сравнении с ДКМП

 

Частота встречаемости аллеля А у пациентов с ИБС выше, чем с ДКМП (р = 0.01, ОШ = 0.37, 95% ДИ: 0.148–0.942).

При исследовании эндомиокардиального биоптата у 49 из 110 реципиентов сердца верифицирован фиброз интерстиция миокарда трансплантата. Окраска позволяла четко различать соединительную ткань, которая (в зависимости от ее зрелости) окрашивалась в различные оттенки синего и отличалась от других тканей миокарда. При анализе учитывали все виды фиброза: диффузный, очаговый и диффузно-очаговый.

На рис. 4 представлены примеры гистологических препаратов биоптата трансплантированного сердца, в котором обнаружены фибротические изменения.

 

Рис. 4. Гистологические препараты эндомиокардиальных биоптатов. Окраска трихромом по Массону ×400 (синим цветом окрашена соединительная ткань, розовым – кардиомиоциты). А – диффузное разрастание рыхлой волокнистой соединительной ткани с единичными клетками фибропластического ряда, очаговая белковая зернистая дистрофия кардиомиоцитов. Б – очаговое разрастание неоформленной соединительной ткани с единичными клетками соединительно-тканного ряда, умеренная белковая дистрофия кардиомиоцитов. В – диффузно-очаговое разрастание рыхлой волокнистой соединительной ткани, в которой отмечается пролиферация клеток соединительно-тканного ряда. Очаговая белковая дистрофия кардиомиоцитов

 

Сравнительный анализ распределения частот и генотипов позволил выявить различия во встречаемости генотипа AA полиморфизма rs1800470 гена TGFB1 у реципиентов с фиброзом миокарда и без такового (рис. 5).

 

Рис. 5. Частотное распределение генотипов и аллелей полиморфизма rs1800470 гена TGFB1 у реципиентов с фиброзом миокарда трансплантата и без такового, *p < 0.05 в сравнении с реципиентами без фиброза

 

У реципиентов сердца c генотипом АА полиморфизма rs1800470 гена TGFB1 фиброз наблюдался чаще, нежели у носителей аллеля G (ОШ = 10.4, 95% ДИ: 1.152–94.538, р = 0.013).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании проанализировано распределение аллелей и генотипов трех функционально значимых полиморфных участков гена TGFB1 у пациентов с трансплантированным сердцем. У реципиентов сердца выявлены отличия по частоте встречаемости генотипов и аллелей полиморфизма rs1800471 гена TGFB1 в сравнении со здоровыми лицами. В ряде работ показано, что аллель G rs1800471 связан с более высоким уровнем экспрессии гена и повышением уровня цитокина TGFβ1 в крови. Дисрегуляция сигнального пути TGFβ1, возникающая в результате мутации, может быть связана с повышенным риском развития сердечно-сосудистых заболеваний [12, 13].

При анализе предрасположенности к первичному заболеванию, приведшему к развитию терминальной сердечной недостаточности и трансплантации сердца, в настоящем исследовании наблюдали значимую ассоциацию ишемической болезни сердца с однонуклеотидным полиморфизмом rs1800469. Схожие данные получены Барсовой и соавт. [4], которые обнаружили положительную ассоциацию аллеля TGFB1*-509T (rs1800469) c предрасположенностью к раннему инфаркту миокарда (пациенты до 50 лет). Механизмы, лежащие в основе ассоциации полиморфизма с развитием терминальной стадии сердечной недостаточности, пока остаются неясными. Возможно, полиморфизм rs1800469, изменяя сродство транскрипционных факторов к промотору, подавляет экспрессию TGFβ и активирует таким образом провоспалительные цитокины – фактор некроза опухоли α и интерлейкин-1, что может способствовать прогрессированию ИБС [4]. В ряде исследований получены противоречивые данные: так в группе немецких пациентов не выявлена ассоциация полиморфизма 509C/T с ИБС [14]. Liu и соавт. провели метаанализ восьми исследований и показали статистически значимую связь rs1800469 (ТТ) с повышенным риском развития ИБС [15].

Анализируя предрасположенность к фиброзу миокарда у реципиентов сердца, мы выявили значимые ассоциации данного признака с полиморфным участком rs1800470. Известно, что аллель A данного полиморфизма связан с высоким уровнем TGFβ1 в периферической крови. TGFβ1 – мощный стимулятор продукции внеклеточного матрикса, гиперпродукция которого связана с фибротическими нарушениями и развитием фиброза миокарда. В работе Leask A. показано, что TGFβ, при его добавлении в культуру фибробластов in vitro, индуцирует экспрессию генов, связанных с продукцией внутриклеточного матрикса, и таким образом способствует увеличению накопления матрикса и сопутствующему подавлению матриксной металлопротеиназы за счет повышения уровня ингибиторов экспрессии ее гена [16].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании выявлены различия во встречаемости аллелей и генотипов гена TGFB1: rs1800471 у реципиентов сердца и здоровых лиц, rs1800469 – у пациентов с ДКМП и ИБС, rs1800470 – у пациентов с фиброзом миокарда трансплантированного сердца и без такового. Полученные результаты позволяют предполагать участие гена TGFB1 и его полиморфизмов в формировании предрасположенности к фиброзу миокарда у реципиентов сердца. Дальнейшие исследования на большем количестве пациентов позволят получить более подробные характеристики влияния однонуклеотидных полиморфизмов на формирование фиброза в трансплантированном сердце.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Исследование проведено при частичной поддержке гранта Президента Российской Федерации НШ-2598-2020.7 для государственной поддержки ведущих научных школ.

Об авторах

Ольга Евгеньевна Гичкун

Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: gichkunoe@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3475-3161
SPIN-код: 2631-3782
Scopus Author ID: 57192154138

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела регуляторных механизмов в трансплантологии

Россия, 123182, Москва, ул. Щукинская, 1; 119435, Москва

Ольга Павловна Шевченко

Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: transplant2009@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6964-6465
SPIN-код: 5480-7422
Scopus Author ID: 7103114290

доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела регуляторных механизмов в трансплантологии

Россия, 123182, Москва, ул. Щукинская, 1; 119435, Москва

Ривада Мусабековна Курабекова

Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России

Email: kourabr@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8369-1086
SPIN-код: 2802-1376
Scopus Author ID: 6602135024
ResearcherId: AAF-8994-2019

доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела регуляторных механизмов в трансплантологии

Россия, 123182, Москва, ул. Щукинская, 1

Наталья Павловна Можейко

Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России

Email: npm_72@mail.ru
SPIN-код: 7625-2590

доктор медицинских наук, заведующая патологоанатомическим отделением

Россия, 123182, Москва, ул. Щукинская, 1

Алексей Олегович Шевченко

Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: alxxshevchenko@aol.com
ORCID iD: 0000-0003-4719-9486
SPIN-код: 3923-9795
Scopus Author ID: 14065642200

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, руководитель Центра Персонифицированных трансляционных технологий лечения критических состояний 

Россия, 123182, Москва, ул. Щукинская, 1; 119435, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы