Метод оценки эффективности работы системы эксцизионной репарации нуклеотидов ex vivo

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ЭРН – эксцизионная репарация нуклеотидов; ОДН – олигодезоксирибонуклеотид; ATP – аденозинтрифосфат; nFlu – N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол; nAnt – N-[6-(9-антраценилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол; MCS – сайт множественного клонирования.

ВВЕДЕНИЕ

Система эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) с высокой эффективностью удаляет из ДНК объемные повреждения, возникающие в результате воздействия различных факторов – химически активных соединений, УФ- и рентгеновского излучения. Существуют два типа ЭРН. Общегеномная ЭРН отвечает за поиск и удаление объемных повреждений во всем геноме, независимо от его функционального состояния, используя для первичного распознавания места повреждения комплексы фактора XPC [1]. ЭРН, связанная с транскрипцией, активируется при блокировании продвижения транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II объемным повреждением в транскрибируемой цепи ДНК [2]. Примерно 30 белковых факторов и ферментов, одинаковых для обоих типов ЭРН, формируют затем на ДНК ряд комплексов, осуществляющих удаление повреждения, репаративный синтез и лигирование.

Использование подходов, ориентированных на изучение структуры и функций белков-участников ЭРН, позволило выяснить механизм процесса, определить основные этапы, влияющие на эффективность его протекания, а также состав и структуру мультибелковых комплексов, возникающих и функционирующих на разных этапах ЭРН [1, 3]. Активность эукариотической системы ЭРН in vitro в большинстве работ оценивают с использованием протяженных ДНК, содержащих в заданной позиции природные объемные повреждения, либо их синтетические аналоги, а также фракционированные экстракты клеток, содержащие набор белков ЭРН (ЭРН-компетентные экстракты) [4, 5]. Тем не менее, актуальной как для фундаментальных, так и для прикладных исследований остается разработка подходов, нацеленных на исследование и сравнение эффективности протекания репарации объемных повреждений в живых клетках (ex vivo).

В данной работе приведено описание разработанного нами метода, который позволяет проводить такие оценки с использованием модельных плазмид с объемным повреждением вблизи промоторной области гена, кодирующего флуоресцентный белок TagRFP. Схема создания модельных плазмид с объемным повреждением и оценки эффективности ЭРН ex vivo путем наблюдения за результатом восстановления репаративным аппаратом эукариотических клеток экспрессии репортерного флуоресцентного белка, нарушенной присутствием объемного повреждения в ДНК, представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема метода оценки эффективности работы системы ЭРН ex vivo

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки НЕК 293Т культивировали в среде IMDM (Gibco) с добавлением 10% FBS (Gibco), 1% GlutaMAX™ Supplement (Gibco), 10⁵ ед. /л пенициллина, 100 мг/л стрептомицина, 2.5 мг/л амфотерицина β, при температуре 37°С и 5% СО₂.

ОДН для создания вставок синтезированы в лаборатории биомедицинской химии (ИХБФМ СО РАН) по методике, описанной в работе [5]. Последовательности ОДН приведены в таблице.

 

Последовательности ОДН

№	ОДН
1	5’-P-agctgctgctcatctcgagatctgagtacattggattgccattctccgagtgtattaccgtgacg-3’
2	5’-P-gatccgtcacggtaatacactcggagaatggcaatccaatM1tactcagatctcgagatgagcagc-3’, где M1 – nFlu
3	5’-P-gatccgtcacggtaatacactcggagaatggcaatccaatM2tactcagatctcgagatgagcagc-3’, где M2 – nAnt

 

Из плазмиды pTagRFP-N с помощью эндонуклеаз рестрикции HindIII и BamHI («СибЭнзим») вырезали участок длиной 38 п.н. (622–660 п.н., MCS) путем инкубации 1 мкг плазмиды с 1 ед. HindIII и 1 ед. BamHI в буфере W («СибЭнзим») в течение 1 ч при 37°С. После инактивации ферментов (70°С, 20 мин) и осаждения ДНК по стандартной методике [6], линеаризованную плазмиду растворяли в воде и добавляли 40-кратный молярный избыток ДНК-вставки, 2 ед. Т4-ДНК-лигазы («СибЭнзим») в SE-буфере и 5 мМ ATP. Лигирование плазмиды проводили при температуре 12°С в течение 16 ч, затем реакционную смесь прогревали (65°С, 20 мин), а ДНК, содержащуюся в реакционной смеси после лигирования, разделяли в 0.8% агарозном геле. Кольцевую плазмиду с введенными вставками элюировали из агарозного геля с использованием набора для элюции ДНК (diaGene) согласно протоколу производителя.

Трансфекцию клеток плазмидой проводили с помощью Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Клетки рассаживали на 24-луночный планшет в количестве 2.5 × 10⁴ клеток на лунку в 500 мкл культуральной среды, не содержащей антибиотиков. По достижению 50–70% конфлюентности среду удаляли и добавляли к клеткам комплекс плазмиды (150 нг) с реагентом Lipofectamine™ 2000 в среде, не содержащей сыворотки. Флуоресценцию регистрировали с использованием системы для длительного прижизненного наблюдения за клетками Cell-IQ MLF (Chip-Man Technologies, Финляндия) в ЦКП клеточных технологий ФИЦ ИЦиГ СО РАН. Съемку клеток проводили с интервалом 10 мин в режимах фазового контраста и флуоресценции с использованием ×10 объектива Nikon CFI Plan Fluorescence DL. Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageJ и программного обеспечения Cell-IQ Analyser.

Статистический анализ осуществляли с помощью программы Statistica10. Все эксперименты проведены минимум 3 раза, а статистическую значимость определяли, используя t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Подход, основанный на реактивации экспрессии флуоресцентных белков после удаления повреждения из ДНК, блокирующего их экспрессию, ранее успешно применяли в исследованиях ЭРН [7, 8]. Мы решили модифицировать этот подход и регистрировать флуоресцентный сигнал в живых клетках с помощью оборудования для прижизненных исследований Cell-IQ MLF, которое сочетает в себе микроскоп с фазово-контрастным и флуоресцентным режимами съемки, а также систему для подачи СО₂ и поддержания температуры, обеспечивающую создание оптимальных для клеток условий при достаточно длительном процессе съемки. Прилагаемое к оборудованию программное обеспечение позволяет анализировать изображения и извлекать информацию об общем количестве и количестве клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки, интенсивности флуоресцентного сигнала, подвижности клеток, а также анализировать другие параметры.

Для создания ДНК с объемными повреждениями использовали вектор pTagRFP-N (4.7 т.п.н.), который содержит ген tagrfp, кодирующий мономерный флуоресцентный белок RFP морских актиний Entacmaea quadricolor [9]. Преимущества использования TagRFP заключаются в генерируемом ярком флуоресцентном сигнале, стабильности белка при высоких значениях рH, быстром созревании, а также в отсутствии токсического влияния на клетки. Ген tagrfp находится под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Pcmv ie), вблизи которого находится сайт множественного клонирования (MCS) с участками узнавания различных эндонуклеаз рестрикции, что дает возможность клонирования необходимой ДНК-вставки в данную область.

Синтезированы рекомбинантные плазмиды, содержащие объемные повреждения nFlu и nAnt (далее nFlu- и nAnt-ДНК соответственно). Выраженные субстратные свойства данных повреждений, выявленные в реакции специфической эксцизии, катализируемой белками ЭРН различных клеточных экстрактов in vitro [5, 10], учитывали при использовании nFlu и nAnt для создания модельных плазмид.

Проанализирована эффективность протекания ЭРН nFlu- и nAnt-ДНК в клетках эмбриональной почки человека HEK 293T. Оценено время появления клеток, флуоресценция которых свидетельствовала о восстановлении экспрессии белка TagRFP (рис. 2). В качестве контроля использовали плазмиду, содержащую ДНК-вставку без объемного повреждения. Оценка количества флуоресцентных клеток в общей популяции клеток с помощью Cell-IQ Analyser и ImageJ выявила различия в эффективности репарации nAnt- и nFlu-ДНК. В случае клеток, для трансфекции которых использовали nAnt-ДНК, первые флуоресцентные клетки можно было наблюдать через 10 ч после трансфекции, в то время как в случае nFlu-ДНК время появления первых флуоресцентных клеток составило 8 ч (рис. 3А). Через 12 ч после трансфекции клеток nAnt-ДНК количество флуоресцентных клеток составило 1.56 ± 0.39%, в то время как в случае nFlu-ДНК количество флуоресцентных клеток составило 4.59 ± 0.76% (рис. 3Б). Для достижения близкого количества флуоресцентных клеток, трансфицированных nAnt-ДНК, потребовалось еще 2 ч, и через 14 ч оно составило 4.27 ± 0.67%.

 

Рис. 2. Экспрессия TagRFP в клетках HEK 293T, трансфицированных плазмидными ДНК. Представленные изображения получены путем наложения флуоресцентных и фазово-контрастных снимков с помощью ImageJ. Слева указаны типы плазмидных ДНК-субстратов; сверху – время после трансфекции клеток

 

Рис. 3. Анализ эффективности ЭРН плазмидных ДНК ex vivo в клетках HEK 293T. А – график изменения количества флуоресцентных клеток (%) во времени после трансфекции плазмидными ДНК; Б – репрезентативная диаграмма, демонстрирующая различия в количестве флуоресцентных клеток, трансфицированных nFlu- или nAnt-ДНК, через 12 и 16 ч после трансфекции. Статистические уровни значимости соответствуют *p < 0.01 и **p < 0.05

 

Репарация nFlu-ДНК проходит быстрее, чем nAnt-ДНК, что согласуется с результатами изучения репарации nAnt- и nFlu-содержащих ДНК-дуплексов in vitro в присутствии белков ЭРН-компетентных экстрактов различных линий раковых клеток (HeLa, SiHa, C33A) [5].

Существует много факторов, определяющих разницу в эффективности удаления объемных повреждений системой ЭРН. Это могут быть структурные различия повреждений, определяющие характер первичного узнавания поврежденного участка и эффективность последующей верификации повреждения белками комплекса TFIIH [11], а также скорость и эффективность ответа системы ЭРН различных клеток на повреждающее воздействие. Дальнейшее изучение ЭРН с использованием комбинации методов in vitro и ex vivo может способствовать значительному прогрессу в понимании функционирования данного процесса в клетках эукариот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, предложенный нами метод позволил определить эффективность удаления объемных повреждений nAnt и nFlu из модельных плазмид системой ЭРН клеток HEK 293T. Метод является перспективным инструментом изучения ЭРН, он позволяет сравнивать как репаративный статус различных клеток, так и эффективность репарации повреждений различной структуры.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-74-10056), получение и анализ изображений частично выполнены в рамках бюджетного проекта № 0259-2021-0011.

Об авторах

Алексей Алексеевич Попов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: depolice@mail.ru
Россия, 630090, Новосибирск

Константин Евгеньевич Орищенко

Институт цитологии и генетики СО РАН; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: OrishchenkoKE@icg.sbras.ru
Россия, 630090, Новосибирск; 630090, Новосибирск

Константин Николаевич Науменко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: k-naumenko@mail.ru
Россия, 630090, Новосибирск

Алексей Николаевич Евдокимов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: an_evdokimov@mail.ru
Россия, 630090, Новосибирск

Ирина Олеговна Петрусева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, 630090, Новосибирск

Ольга Ивановна Лаврик

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы