A Sorbent with Synthetic Ligand for Removing Pro-atherogenic and Pro-inflammatory Components from Human Blood Plasma

Oksana A. Dmitrieva; Дмитриева Оксана А.; Ekaterina D. Ovchinnikova; Овчинникова Екатерина Д.; Elena A. Utkina; Уткина Елена А.; Pavel A. Levashov; Левашов Павел А.; Olga I. Afanasieva; Афанасьева Ольга И.; Irina Y. Adamova; Адамова Ирина Ю.; Sergey N. Pokrovsky; Покровский Сергей Н.

doi:10.32607/actanaturae.11292

Сорбент с синтетическим лигандом для удаления провоспалительных и проатерогенных компонентов из плазмы крови человека

Авторы: Дмитриева О.А.¹, Овчинникова Е.Д.¹, Уткина Е.А.¹, Левашов П.А.², Афанасьева О.И.¹, Адамова И.Ю.¹, Покровский С.Н.¹
Учреждения:
1. Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии Минздрава РФ
2. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Выпуск: Том 13, № 4 (2021)
Страницы: 47-52
Раздел: Экспериментальные статьи
Дата подачи: 07.12.2020
Дата принятия к публикации: 22.03.2021
Дата публикации: 15.12.2021
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11292
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.11292
ID: 11292

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Часто выявляемые у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями повышенные концентрации атерогенных ароВ-100-содержащих липопротеидов и маркеров системного воспаления снижают с использованием медикаментозных либо экстракорпоральных методов. Сорбент для сочетанного удаления С-реактивного белка (СРБ) и атерогенных липопротеидов обеспечивает одновременное уменьшение уровней этих компонентов в кровотоке. Исследованы эффективность и селективность разработанного сорбента, рассчитаны константы десорбции СРБ (Kd = 4.2 × 10-8 M) и липопротеидов низкой плотности (Kd = 7.7 × 10-7 M), коэффициенты распределения СРБ (Kc = 101) и липопротеида (а) (Kc = 38). Показано, что сорбент способен связывать большие количества атерогенных липопротеидов – до 32 мг общего холестерина/мл геля сорбента. Разработанный сорбент может быть рекомендован для комплексного удаления СРБ и атерогенных липопротеидов из плазмы крови пациентов при терапии рефрактерных гиперлипидемий и сердечно-сосудистых заболеваний, сопровождающихся повышением уровня СРБ.

Ключевые слова

C-реактивный белок, атерогенные липопротеиды, липопротеид а, атеросклероз, терапевтический аферез

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СРБ – С-реактивный белок; мСРБ – мономерная форма СРБ; нСРБ – пентамерная форма СРБ; Лп(а) – липопротеид (а); ароВ-100 – аполипопротеин В-100; ЛНП – липопротеиды низкой плотности; ЛВП – липопротеиды высокой плотности; окЛНП – окисленные ЛНП; ОХС – общий холестерин; ТГ – триглицериды; ЧСА – сывороточный альбумин человека; IgG – иммуноглобулины класса G; ХС ЛНП холестерин липопротеидов низкой плотности; ХС ЛВП – холестерин липопротеидов высокой плотности; ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания.

ВВЕДЕНИЕ

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) по-прежнему остаются основной причиной смертности в развитых странах, несмотря на новые гиполипидемические препараты и высокотехнологичные инвазивные методы диагностики и лечения. Нарушения липидного обмена считаются основной причиной возникновения и развития атеросклероза, лежащего в основе ССЗ, в то время как С-реактивный белок (СРБ) служит маркером системного воспаления. Все больше данных свидетельствует в пользу того, что СРБ может быть не только маркером воспаления, но и одним из патогенетических компонентов развития ССЗ [1]. Наиболее патогенная, обладающая провоспалительными и протромбогенными свойствами мономерная форма СРБ (мСРБ) образуется при диссоциации нативной пентамерной формы (нСРБ) на поверхности активированных тромбоцитов и поврежденных клеток [2, 3]. мСРБ выявлена в зонах некроза при остром инфаркте миокарда и в атеросклеротических бляшках [4]. Высокий уровень СРБ после перенесенного инфаркта миокарда связан с риском последующего развития дисфункции миокарда и сердечной недостаточности [5, 6]. Концентрация СРБ в плазме крови ассоциирована с прогнозом течения заболевания при атеросклерозе, хронической сердечной недостаточности, мерцательной аритмии, миокардите, недостаточности аортального клапана и после трансплантации сердца [7]. Исследование CANTOS, проведенное на пациентах высокого риска с повышенным уровнем нСРБ (медиана 4.1 мг/л), показало, что подавление воспаления без влияния на концентрацию холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП) приводит к значимому снижению риска сердечно-сосудистых осложнений и может представлять собой новую терапевтическую стратегию в случае пациентов с ССЗ [8].

В ряде исследований выявлена связь повышенной концентрации нСРБ и атерогенных апоВ-100-содержащих липопротеидов. Увеличение уровней нСРБ и окисленных липопротеидов низкой плотности (окЛНП) отмечено у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) при нарастании тяжести атеросклероза, оцениваемой по количеству пораженных коронарных артерий [9]. Повышенные уровни нСРБ и липопротеида (а) (Лп(а)) наблюдали в группе пациентов моложе 45 лет, перенесших острый инфаркт миокарда [10]. Grønholdt M. и соавт. установили, что повышенная концентрация маркеров острой фазы воспаления прочно ассоциирована с высоким уровнем триглицерид-богатых липопротеидных частиц, повышенным объемом атеромы и эхогенностью бляшек в сонных артериях, что также говорит о роли маркеров воспаления как возможных предикторов тяжести поражения и формирования нестабильной атеросклеротической бляшки [11].

В настоящее время возможности медикаментозной коррекции уровня СРБ ограничены препаратами, воздействующими на пути его синтеза в печени [12], при этом ведется интенсивный поиск способов влияния непосредственно на концентрацию этого белка. Один из таких способов – удаление СРБ из кровотока с помощью экстракорпоральных методов терапевтического афереза. Наиболее эффективными и селективными являются методы на основе сорбционных технологий. В качестве активных ингредиентов сорбционных колонок используют специфические антитела или синтетические миметики природных лигандов и сайтов связывания молекул СРБ.

Удаление СРБ привело к достоверному уменьшению зоны некроза в животной модели острого инфаркта миокарда [13]. Снижение уровня СРБ (до 50% за процедуру) наблюдали при использовании колонки PentraSorb^® CRP (Pentracor, Германия) у пациентов с острым инфарктом миокарда [14]. В настоящее время продолжается накопление данных о клинической эффективности таких процедур.

Ранее нами был синтезирован сорбент с синтетическим лигандом-миметиком, способный одновременно связывать СРБ и атерогенные липопротеиды [15]. Одновременное снижение уровней этих компонентов в кровотоке позволит уменьшить их провоспалительное и проатерогенное действие и таким образом воздействовать на оба важных звена патогенеза атеросклероза.

Цель данной работы состояла в изучении эффективности и селективности связывания провоспалительных и проатерогенных компонентов плазмы крови человека синтезированным сорбентом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали растворы очищенных препаратов: липопротеидов низкой плотности, сывороточного альбумина человека (ЧСА), иммуноглобулинов класса G (IgG), СРБ, а также плазмы/сыворотки крови: плазмы здоровых доноров, стабилизированной антикоагулянтом цитрат-фосфат-декстроза, гепаринсодержащей плазмы, полученной после проведения процедур плазмообмена, сыворотки больных ИБС. Растворы ЛНП с концентрациями общего холестерина (ОХС) 500 и 800 мг/дл получены из плазмы крови здоровых доноров методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности нейтральной соли NaBr [16]. Раствор ЧСА с концентрацией 29 мг/мл готовили с использованием лиофилизированного препарата (Calbiochem, США). Раствор СРБ с концентрацией 1 мг/мл содержал 1% ЧСА в качестве стабилизатора («Имтек», Россия). Использовали препарат иммуноглобулина G человека для внутривенного введения (Octapharma, Швейцария) с концентрацией 50 мг/мл.

При проведении сравнительного анализа использовали иммуносорбенты c иммобилизованными поликлональными антителами: к ЛНП – активный ингредиент колонки ЛНП-Липопак®, к IgG – активный ингредиент колонки Ig Адсопак^® (оба сорбента НПФ «ПОКАРД», Россия) и к препарату нСРБ. Сорбент с синтетическим лигандом получен иммобилизацией ароматического альдегида на перешитую агарозную матрицу через молекулярный спейсер в соответствии с модифицированной методикой, описанной ранее [17]. При проведении синтеза не требовалось присутствие глутарового альдегида.

Свойства сорбентов изучали с использованием метода бетч-хроматографии (хроматографии в объеме) при комнатной температуре и соотношении объемов геля сорбента и исследуемого препарата (раствора белка, плазмы или сыворотки крови человека) 1 : 10, если не оговорено иначе. Для построения изотерм адсорбции хроматографию проводили в буферной смеси, содержащей 10 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl (рН 7.0), в течение 1 ч. На основании изотерм рассчитывали максимальную сорбционную емкость (Smax) и константу десорбции (Kd). Распределение компонентов плазмы в процессе хроматографии, характеризуемое отношением концентраций связанного с сорбентом и свободного вещества или величиной коэффициента распределения (Kc), оценивали при постоянной нагрузке и разведении плазмы в 1–5 раз. Для определения максимальной ЛНП-связывающей способности проводили хроматографию с концентрированными растворами ЛНП (300 и 500 мг/дл), контролируя количество свободного холестерина (в течение 0.5–20 ч).

Для определения в плазме концентрации ОХС, ХС ЛВП, ЧСА, ТГ использовали наборы реагентов Analiticon Biotechnologies AG (Германия) и «Вектор Бест» (Россия). Концентрацию IgG и ЧСА в растворе определяли спектрофотометрически с использованием коэффициентов молярной экстинкции 1.4 и 0.6 соответственно. Концентрацию СРБ и IgG определяли с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бест»). Концентрацию Лп(а) измеряли при помощи иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека как описано ранее [18]. Концентрацию ХС ЛНП рассчитывали по формуле Фридвальда: ХС ЛНП = ОХС–ХС ЛВП–ТГ/5 (мг/дл) [19]. В образцах с повышенной концентрацией Лп(а) рассчитывали уровень коррегированного ХС ЛНП (ХС ЛНП_корр), учитывающего холестерин, входящий в состав Лп(а), по модифицированной формуле Фридвальда: ХС ЛНП_корр= ХС ЛНП–Лп(а)×0.33, где Лп(а) – концентрация Лп(а), мг/дл [20].

Процессы адсорбции СРБ, IgG, ЧСА и ЛНП на сорбенте удовлетворительно описываются уравнением Ленгмюра: S = Smах × [Cр-р]/(Kd+[Ср-р]), где S – количество связанного с сорбентом компонента, Smax – максимальная сорбционная емкость, [Ср-р] – концентрация свободного компонента в растворе, Kd – константа десорбции. При пересчете Kd в константы десорбции, выраженные в количестве частиц (Kd М), использовали соответствующие молекулярные массы. При пересчете концентрации ХС ЛНП в концентрацию ЛНП учитывали процентное содержание холестерина в данной липопротеидной частице.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработанный нами сорбент представляет собой полимерную агарозную матрицу, к которой посредством молекулярного спейсера ковалентно присоединен синтетический лиганд, содержащий ароматическую группу. Сорбент имеет значительную удельную поверхность и развитые поры, доступные для всех исследуемых в нашей работе компонентов плазмы крови человека. Размер гранул матрицы варьирует от 40 до 180 мкм, размер пор (предел исключения по молекулярной массе) составляет 6.3 × 10⁵ кДа [21].

Возможными функциональными группами на поверхности синтезированного сорбента являются гидроксильные группы моносахаридных остатков агарозы, первичные и вторичные аминогруппы спейсера и бензольные группы лиганда (рис. 1А). Адсорбция компонентов плазмы может осуществляться посредством ионообменных, ароматических и гидрофобных взаимодействий.

Рис. 1. Структурные компоненты разработанного сорбента (А) и участок молекулы СРБ (AFTV), ответственный за связывание с рецептором лейкоцитов (Б) [22]

При изучении пептидов – ингибиторов взаимодействия СРБ с клетками линии U937, Zen и соавт. показали, что критическое значение для взаимодействия молекулы СРБ с СРБ-связывающим сайтом рецептора имеет аминокислотная последовательность TKPLKAFTVCLH [22]. Эта последовательность содержит участок из трех гидрофобных аминокислот, в том числе одну ароматическую (рис. 1Б). При разработке сорбента было сделано допущение, что ароматические и аминогруппы будут участвовать в связывании СРБ по принципу комплементарности и гидрофобных взаимодействий. Адсорбция атерогенных липопротеидов, происходящая на данном сорбенте, позволяет также считать его миметиком рецептора LOX-1 [23].

Сорбционные характеристики – максимальная сорбционная емкость (Smax) и константа десорбции (Kd) – представлены в табл. 1 в сравнении с соответствующими параметрами иммуносорбентов IgG-Адсопак^® и сорбента с иммобилизованными поликлональными антителами против нСРБ человека. Значение константы десорбции (4.2 × 10^-8 М) свидетельствует о специфичном связывании синтетического сорбента с СРБ и показывает, что набор функциональных групп сорбента способен выполнять роль миметика СРБ-связывающего сайта. Взаимодействие синтетического сорбента с такими основными белковыми компонентами плазмы крови человека, как IgG и ЧСА, существенно менее специфично (Kd для IgG и ЧСА равны 2.9 × 10^-5 и 1.4 × 10^-5 M соответственно). Взаимодействие с ЛНП характеризуется значением константы десорбции, равным (7.7 ± 3.6) × 10^-7 М и соизмеримым со значением для высокоспецифичного к ЛНП иммуносорбента ЛНП-Липопак^® ((8.0 ± 2.2) × 10^-7 М). Большое количество активных функциональных групп в составе синтетического сорбента обуславливает высокие значения Smax, подтвержденные в опытах in vitro с плазмой/сывороткой крови.

Таблица 1. Параметры изотерм адсорбции белков плазмы крови человека – СРБ, IgG, ЧСА

	Белки плазмы крови
	СРБ	IgG	ЧСА
Мол. масса, кДа	115	146	64
Сорбционные характеристики
Константа десорбции, Kd, М
Синтетический сорбент	4.2 × 10^-8	2.9 × 10^-5	1.4 × 10^-5
Иммуносорбент*	1.3 × 10^-8	7.5 × 10^-7	Н.о.^#
Сорбционная емкость, Smax, мг/мл геля
Синтетический сорбент	34.4	45.2	46.6
Иммуносорбент*	0.9	16.1	Н.о.^#

*Для сорбции СРБ использовали сорбент с иммобилизованной сульфатной фракцией поликлональных антител козла к нСРБ человека; для сорбции IgG – сорбент с иммобилизованными поликлональными антителами барана к IgG человека IgG-Адсопак^®.

^#- Н.о. – не определяли.

Липопротеиды плазмы крови являются лигандами разнообразных рецепторов, присутствующих на поверхности эндотелиальных и гладкомышечных клеток, макрофагов и тромбоцитов. Эти многочисленные рецепторы, способные связывать нативные и/или модифицированные ЛНП, участвуют не только в транспорте холестерина, но и во множестве физиологических и патофизиологических процессов, включая процессы воспаления, репарации и атеросклероза [24]. Семейство скавенджер-рецепторов (рецепторов-мусорщиков) способно связывать широкий спектр различных лигандов, включая апоВ-100-содержащие модифицированные липопротеиды, Лп(а) и СРБ [25, 26], что предполагает существование возможных общих эпитопов для взаимодействия.

Липопротеид (а) представляет собой ЛНП-подобную частицу, в которой молекула апоВ-100 связана ковалентной дисульфидной связью с высокомолекулярным гликозилированным апобелком (а). Несмотря на то что Лп(а) является независимым генетическим фактором риска широкого спектра ССЗ, медикаментозных способов коррекции его уровня до сих пор не существует [27, 28]. Разработанные с этой целью терапевтические антисмысловые олигонуклеотиды проходят в настоящее время клинические испытания [29].

Адсорбцию Лп(а), ТГ и ХС ЛНП_корр на сорбенты изучали методом хроматографии с плазмой крови человека при варьировании концентрации исследуемых компонентов (разведение от 1 до 5 раз) с постоянной нагрузкой, равной 1 мл плазмы на 0.1 мл синтетического либо иммунносорбента. Значения коэффициентов распределения (Kc) представлены в табл. 2, сорбционной емкости и эффективности сорбции (% удаления) – на рис. 2. Обнаружена более выраженная адсорбция Лп(а) по сравнению с ТГ и ЧСА, причем максимальное различие по значениям Kc у синтетического сорбента. Иммуносорбент ЛНП-Липопак^® лучше взаимодействует с ЛНП, что подтверждается большими величинами эффективности сорбции.

Таблица 2. Значения коэффициентов распределения (Kc) компонентов плазмы крови человека – Лп(а), ТГ и ЧСА

Сорбент	Коэффициенты распределения, Кс
Сорбент	Лп(а)	ТГ	ЧСА
Синтетический сорбент	38 ± 7	7 ± 1	6 ± 5
ЛНП-Липопак^®	23 ± 6	6 ± 1	5 ± 4

Рис. 2. Значения сорбционной емкости (А); эффективности сорбции (% удаления) исследуемых компонентов плазмы на синтетическом сорбенте и иммуносорбенте ЛНП-Липопак^® (Б). Исследуемые компоненты плазмы – ТГ (1), Лп(а) (2), ХС ЛНП_корр(3). Исходные концентрации в плазме (мг/дл): ОХС – 149, ХС ЛВП – 48, ТГ – 108, Лп(а) – 109, ХС ЛНП_корр – 42 (расчетное значение)

Адсорбцию СРБ изучали в опытах in vitro с сывороткой крови пациента с экстремально высокой концентрацией СРБ (1330 мг/л). Специфичность взаимодействия синтетического сорбента с СРБ убедительно доказана высокой эффективностью связывания, равной 91%, а также высоким значением коэффициента распределения СРБ, равным 101, тогда как для ЧСА и IgG значение Кс составило 2. По результатам данного эксперимента сорбционная емкость синтетического сорбента достигла 12 мг СРБ/мл геля.

Как показывают результаты длительной инкубации сорбента с синтетическим лигандом с концентрированными растворами ЛНП (300 и 500 мг/дл), максимальная ЛНП-связывающая способность сорбента достигается не ранее 6-го ч инкубации, что, по-видимому, можно объяснить стерическими затруднениями при взаимодействии активных функциональных групп сорбента с таким крупным надмолекулярным комплексом, как частица ЛНП. При более высокой нагрузке сорбционная емкость через 6 ч инкубации составляет 32 мг ОХС/мл геля, а эффективность связывания 64%. При более низкой нагрузке через 20 ч инкубации наблюдали меньшую сорбционную емкость (26 мг ОХС/мл геля) при большей эффективности связывания (86%). Зависимость сорбционной емкости синтетического сорбента от нагрузки и времени хроматографии представлена на рис. 3.

Рис. 3. Зависимость сорбционной емкости синтетического сорбента от нагрузки и времени хроматографии (от 30 мин до 20 ч). 1 – нагрузка 30 мг ОХС/мл геля, 2 – нагрузка 50 мг ОХС/мл геля

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов получены данные, свидетельствующие о высокой специфичности взаимодействия сорбента с синтетическим лигандом с СРБ – константа десорбции (Кd), равная 4.2 × 10^-8 М, в 1000 раз превышает Кd таких основных белков плазмы, как ЧСА и IgG, и коэффициент распределения (Kc), равный 101, в 50 раз превышает Kc ЧСА и IgG. Показана способность сорбента связывать большие количества атерогенных липопротеидов; максимальное значение сорбционной емкости, полученное на растворе ЛНП, составляет 32 мг ОХС/мл геля сорбента. Разработанный нами сорбент можно рекомендовать для комплексного удаления СРБ и атерогенных липопротеидов из плазмы крови пациентов при рефрактерных гиперлипидемиях и ССЗ, сопровождающихся повышенным уровнем СРБ.

Ограничения исследования

Изотерма адсорбции СРБ была построена с использованием раствора, содержащего СРБ в концентрации 1 мг/мл и ЧСА в концентрации 10 мг/мл. Коэффициент распределения холестерина ЛНП (ХС ЛНП_корр) не был рассчитан из-за низкой исходной концентрации ЛНП в плазме. Время проведения хроматографии, равное 1 ч, было меньше времени, необходимого для насыщения синтетического сорбента при высоких концентрациях ЛНП.

Работа выполнена в рамках программы исследований ФГБУ НМИЦ Кардиологии МЗ РФ – НИР ГЗ АААА-А18-118030690076-7 «Разработка новых поколений аффинных сорбентов для процедур терапевтического афереза при лечении больных сердечно-сосудистыми и другими заболеваниями, резистентных к лекарственной терапии».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или животных в качестве объектов.