Адоптивный перенос сингенных спленоцитов подавляет иммунный ответ сублетально облученных мышей

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Пул периферических Т-лимфоцитов состоит из нескольких функционально различающихся популяций CD8⁺ Т-клеток. Основными поверхностными маркерами этих популяций являются CD44 и CD62L, экспрессия которых определяет активационный фенотип и особенности миграции Т-клетки. Молекула CD62L опосредует взаимодействие Т-лимфоцита с клетками венул с высоким эндотелием и его миграцию в лимфоидной системе. CD44, рецептор гиалуроновой кислоты во внеклеточном матриксе, позволяет Т-клетке покидать лимфоидную систему и мигрировать в периферические ткани [1]. Профиль экспрессии этих маркеров зависит от функционального состояния Т-лимфоцита. Наивные Т-клетки имеют фенотип CD62L^hiCD44^lo; клоны CD8⁺ клеток, активированные в ходе первичного иммунного ответа, теряют экспрессию CD62L и приобретают фенотип CD62L^loCD44^hi. Большинство CD8⁺ эффекторов погибает по завершении иммунного ответа, небольшая их доля формирует пул долгоживущих Т-клеток памяти, способных поддерживать стабильный пул и ускоренно отвечать на специфический антиген.

Долгоживущие CD8⁺ Т-клетки памяти имеют фенотип CD44^hiCD62L^hi, который, однако, не всегда коррелирует с «антигенным опытом» Т-лимфоцита. Известно, что пул периферических Т-клеток неиммунизированных животных – гнотобионтов содержит виртуальные клетки памяти, специфичные к модельному антигену [2, 3]. В условиях лимфопении периферические Т-клетки гомеостатически пролиферируют и приобретают поверхностный фенотип клеток памяти CD44⁺CD62L⁺ (T_ML, суррогатные клетки памяти) [4–7]. T_ML-клетки не способны подавить экспрессию поверхностных активационных молекул и вновь приобрести фенотип наивных клеток [8, 9]. Таким образом, данная популяция фенотипически аналогична истинным клеткам памяти.

Экспериментальные данные о функциональных особенностях T_ML-клеток остаются противоречивыми. В ряде работ показано, что адоптивный перенос наивных CD8⁺ Т-клеток в условиях лимфопении приводит к формированию популяции Т-лимфоцитов с функциональными особенностями истинных клеток памяти [10, 11]. Тем не менее, локализация и профиль экспрессии хемокиновых рецепторов отличают данную популяцию от истинных клеток памяти [12]. Описана популяция T_ML-клеток с супрессорной активностью [13]. Кроме того, при лимфопении наблюдается гомеостатическая пролиферация клонов Т-клеток с высокой аффинностью Т-клеточного рецептора к собственным молекулам МНС (потенциально аутореактивных клонов), которые приобретают фенотип клеток памяти [14, 15]. В ряде исследований описана популяция CD8⁺CD44⁺CD122⁺ Т-лимфоцитов с супрессорной активностью [13, 16–18].

Эти данные позволяют утверждать, что поверхностный фенотип Т-лимфоцитов не всегда отображает их истинный функциональный статус, и исследуемая популяция может быть ошибочно отнесена к долгоживущим CD8⁺ Т-клеткам памяти. Мы проанализировали связь между экспрессией поверхностных маркеров CD44 и CD62L и функциональными особенностями популяций CD8⁺ Т-клеток в условиях лимфопении. Оказалось, что адоптивный перенос сингенных лимфоцитов сублетально облученным мышам приводит к подавлению иммунного ответа у этих животных, что может быть, по крайней мере отчасти, обусловлено действием T_ML CD8⁺ Т-клеток с фенотипом CD122⁺СD5⁺CD49d^hiCXCR3⁺, сформированных из популяции донорских лимфоцитов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мыши

Мышей линий C57BL/6 (K^bI-A^bD^b), B10.D2(R101) (K^dI-A^dI-E^dD^b), FVB (K^qI-A^qI-E^qD^q) и C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb (K^bI-A^bD^b) (далее B6.GFP) получали из разведения вивария Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения Российской Федерации. Экспериментальные протоколы одобрены этической комиссией НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина и Института биологии гена РАН (Москва, Россия).

Клеточные линии

Клетки лимфомы EL4 получены из коллекции НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. EL4 прививали внутрибрюшинно (в/б) сингенным мышам C57BL/6 (3.0–5.0 × 10⁶ клеток/мышь) и наращивали в асцитной форме в течение 10–14 дней. Опухолевые клетки стерильно отбирали из брюшного асцита и 3 раза отмывали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7.4) центрифугированием (200 g) при 4°C. Жизнеспособные клетки подсчитывали в смеси трипанового синего и эозина в камере Горяева и использовали для иммунизации мышей.

Бактериальные штаммы и условия культивирования

Вирулентный штамм Salmonella typhimurium IE 147 и вирулентный штамм Listeria monocytogenes EGD получены из коллекции Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Россия). Штамм S. typhimurium выращивали в среде LB (Amresco, США) в течение ночи при 37^оС, затем высевали серийные 10-кратные разведения культуры на SS-агар (Condalab, Испания) и подсчитывали количество колоний по стандартной методике. Штамм L. monocytogenes выращивали в среде BHI (BD, США) в течение ночи при 37^оС в термостатируемом шейкере (Shaker-thermostat ES 20 Biosan, Латвия) при 185 об/мин. Полученную культуру разводили в соотношении 1 : 100 в 200 мл среды BHI и инкубировали в термостатируемом шейкере при 37^оС и 85 об/мин до достижения оптической плотности культуры (OD₆₀₀) 1.5–1.8. Титр бактерии (КОЕ/мл) определяли на спектрофотометре ULTROSPEC 10 (General Electric, США). Свежие культуры S. typhimurium и L. monocytogenes инактивировали нагреванием (1 ч, 60^оС и 90 мин, 74°C соответственно) и использовали в in vitro экспериментах.

Иммунизация

Мышей линии B10.D2(R101) иммунизировали в/б 2.0 × 10⁷ клеток EL4/мышь. Контрольным неиммунизированным животным вводили PBS. Через 60 дней мышей умерщвляли цервикальной дислокацией, извлекали селезенки и готовили суспензии клеток.

Облучение мышей

Самок мышей линий B10.D2(R101) и C57BL/6 сублетально облучали в дозе 4.5 Гр (терапевтический аппарат «Агат-Р» (Россия), источник γ-излучения Co⁶⁰ с начальной мощностью 1.9 × 10¹⁴ Бк). Мышей умерщвляли на 10 день после облучения, и их спленоциты анализировали методом проточной цитофлуориметрии и функциональных тестов ex vivo.

Подготовка суспензии клеток

Селезенки гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера с коническим пестиком в PBS при 4°C, спленоциты осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин). Эритроциты лизировали в лизирующем буфере (BD Pharmingen, США). Мононуклеары 3 раза промывали PBS центрифугированием при 4°C. Клетки ресуспендировали в PBS для окрашивания моноклональными антителами и адоптивного переноса или в полной ростовой среде для in vitro тестов.

Адоптивный перенос

Неиммунизированных мышей линии B10.D2(R101) облучали в дозе 4.5 Гр. Через 24 ч после облучения мышам внутривенно (в/в) вводили 1.5 × 10⁷ спленоцитов неиммунизированных и иммунизированных сингенных животных. Контрольным облученным мышам вводили PBS в качестве плацебо. Через 10 дней после адоптивного переноса спленоциты мышей-реципиентов использовали как респондеры в in vitro тестах. Аналогичным образом облучали мышей C57BL/6 и в/в вводили спленоциты неиммунизированных мышей B6.GFP. Через 10 дней после адоптивного переноса спленоциты этих мышей использовали для цитофлуориметрического анализа. На 10 день после адоптивного переноса в селезенке облученных мышей-реципиентов обнаруживали около 5% GFP⁺ клеток (рис. 1).

Смешанная культура лимфоцитов (MLR)

Клетки селезенки мышей FVB (K^qI-A^qI-E^qD^q) и C57BL/6 (K^bI-A^bD^b) использовали в качестве неспецифических и специфических стимуляторов соответственно. Спленоциты мышей B10.D2(R101) использовали в качестве сингенного контроля. Клетки-стимуляторы обрабатывали митомицином С (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Япония) (25 мкг/мл, 37°C, 30 мин) и 3 раза отмывали PBS центрифугированием (200 g, 5 мин, 4°C). Респондеры (3.0 × 10⁵ клеток/лунку) и стимуляторы (5.0 × 10⁵ клеток/лунку) помещали (3 : 5) в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning Costar, Sigma Aldrich, США) и культивировали в 200 мкл среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), обогащенной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, GE Healthcare, США), 0.01 мг/мл ципрофлоксацина (KRKA, Novo Mesto, Словения), 0.01 M HEPES («ПанЭко») и 10 мM 2-меркаптоэтанола (Merck, Германия) при 37^оС, 5% CO₂ в течение 72 ч. Уровень пролиферации клеток измеряли по включению ³Н-тимидина («Изотоп», Россия), который вносили за 8 ч до окончания культивирования. Уровень пролиферативной активности клеток выражали в количестве импульсов в минуту (cpm).

Рис. 1. Относительное количество GFPhi CD3+ донорских клеток в селезенке сублетально облученных мышей-реципиентов. Цитофлуориметрический анализ GFPhi CD3+ клеток в селезенке мышей-реципиентов линии C57BL/6 на 10 день после адоптивного переноса. Относительное количество GFPhi CD3+ (GFP+) клеток в селезенке облученных мышей (слева) и облученных мышей после адоптивного переноса спленоцитов сингенных мышей BL6.GFP (справа). Данные представлены для 2.5 × 106 событий. Представлены данные одного из трех независимых репрезентативных экспериментов, три мыши в группе

Ex vivo иммунный ответ на патогены

5.0 × 10⁵ спленоцитов облученных мышей B10.D2(R101) и облученных мышей B10.D2(R101) через 10 дней после адоптивного переноса сингенных спленоцитов от неиммунизированных мышей помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning Costar, Sigma Aldrich) с 10⁶–10⁷ КОЕ/мл прогретых клеток L. monocytogenes (штамм EGD) или 10⁵ КОЕ/мл прогретых клеток S. typhimurium (штамм IE 147), подготовленных как описано выше. Клетки культивировали в 200 мкл среды RPMI-1640 («ПанЭко»), обогащенной как описано выше, при 37^оС, 5% CO₂ в течение 72 ч. Для оценки фоновой пролиферации спленоциты культивировали без бактерий. Уровень пролиферации клеток определяли описанным выше образом. Индекс патоген-индуцированной пролиферации вычисляли как соотношение уровня пролиферации клеток в присутствии бактерий к фоновой пролиферации.

Динамика роста и отторжения клеток лимфомы EL4 in vivo

Сублетально облученным мышам B10.D2(R101) (с или без адоптивного переноса сингенных спленоцитов) прививали подкожно 0.25 мл суспензии клеток лимфомы EL4 (8.0 × 10⁷ кл/мл). Опухоль измеряли на 7, 14 и 21 день после прививки. Полное отторжение лимфомы EL4 устанавливали по отсутствию подкожных опухолевых узлов при пальпации.

Антитела

В работе использовали моноклональные антитела: анти-CD8α – Percp-Cy5.5 (клон 53–6.7, BD Biosciences, США), анти-CD62L – APC-Cy7 (клон MEL-14, eBioscience, США), анти-CD44 – APC (клон IM7, eBioscience), анти-CD3 – PE-Cy7 (клон 145-2C11, eBioscience), анти-CD122 – PE (клон TM-β1, BD Biosciences), анти-CD49d – PE (R1-2, BD Biosciences), анти-CD5 – BV421 (клон 53–7.3, BD Biosciences) и анти-CXCR3 – BV421 (клон CXCR3-173, BD Biosciences).

Цитофлуориметрический анализ

Пробы клеток (3.0 × 10⁶) инкубировали с блокирующими антителами Fc block (клон 2.4G2, BD Pharmingen, США) (10 мин, 4°C) и окрашивали флуоресцентно меченными антителами (40 мин, 4°C). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD Biosciences) в программе FACSDiva 6.0 (BD Bioscience). Мертвые клетки исключали из анализа по параметрам прямого и бокового светорассеяния и по включению пропидий йодида (BD Bioscience) или 7-AAD (BioLegend, США). Минимум 10⁶ событий/образец анализировали при характеристике популяций периферических Т-клеток. Данные обрабатывали в программе Flow Jo 7.6 (TreeStar Inc., США).

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M ± SEM). Статистический анализ проводили с использованием непарного критерия Стьюдента. Различия признавали значимыми при p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Адоптивный перенос сингенных спленоцитов подавляет иммунный ответ сублетально облученных мышей

В исследовании влияния адоптивного переноса сингенных спленоцитов на функциональное состояние иммунной системы сублетально облученных мышей в качестве доноров спленоцитов использовали неиммунизированных и иммунизированных животных (рис. 2А,Б). Облучение иммунизированных мышей приводит к незначительному (в 1.6 раза) подавлению специфического иммунного ответа по сравнению с контрольной группой иммунизированных необлученных мышей, при этом уровень неспецифического аллогенного иммунного ответа остается без изменений (рис. 2А). У облученных мышей с адоптивно перенесенными спленоцитами неиммунизированных или иммунизированных животных наблюдалось сильное подавление и специфического, и неспецифического аллогенного иммунного ответа ex vivo (рис. 2Б). В соответствии с этими данными, у облученных мышей после адоптивного переноса также отмечена более длительная динамика отторжения лимфомы EL4 in vivo по сравнению со всеми контрольными группами (рис. 3).

Обнаружено также значительное подавление иммунного ответа на L. monocytogenes и S. typhimurium у сублетально облученных мышей после адоптивного переноса по сравнению с контрольной группой облученных мышей (рис. 2В). Стоит особо отметить, что ex vivo иммунный ответ на патогены у облученных мышей без адоптивного переноса не отличался от значений в группе необлученного контроля (рис. 2В).

Фенотипические характеристики CD3⁺CD8⁺ Т-клеток донора и реципиента у сублетально облученных мышей после адоптивного переноса

Мы предположили, что наблюдавшееся подавление иммунного ответа у сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов могло быть обусловлено снижением абсолютного количества клеток и относительного количества CD3⁺ Т-лимфоцитов в селезенке этих животных. Для проверки данной гипотезы мы перенесли спленоциты мышей B6.GFP сублетально облученным мышам C57BL/6 и проанализировали отдельно популяции Т-клеток реципиента (GFP^-) и донора (GFP⁺). Доля GFP⁺-клеток донора в селезенке облученных реципиентов составляла 5% (рис. 1).

Абсолютное количество клеток в селезенке облученных мышей было снижено в 4.9 раза по сравнению с необлученными мышами (рис. 4А). При адоптивном переносе сингенных спленоцитов отмечено увеличение клеточности селезенки в 1.5 раза по сравнению с контрольными облученными мышами (p≤ 0.01; рис. 4A).

Сублетальное облучение привело к снижению относительного количества CD3⁺ клеток в селезенке по сравнению с необлученным контролем (рис. 4Б). На 10 день после адоптивного переноса относительное количество GFP^- CD3⁺ клеток в селезенке облученных мышей практически достигало уровня CD3⁺ клеток в селезенке необлученных животных (рис. 4Б). Доля CD3⁺ клеток донора (GFP⁺) в 2 раза превышала относительное количество GFP^- Т-клеток реципиента в селезенке облученных мышей после адоптивного переноса (рис. 4Б).

Популяция CD8⁺ Т-клеток у облученных мышей и среди лимфоцитов реципиента (GFP) облученных мышей после адоптивного переноса не была изменена по сравнению с необлученным контролем (рис. 4В). Однако популяция донорских (GFP⁺) Т-лимфоцитов в селезенке облученных мышей после адоптивного переноса на 70% состояла из CD8⁺ клеток, что в 1.8 раза превышало относительное количество CD3⁺CD8⁺ клеток реципиента (рис. 4В). Мы предположили, что при адоптивном переносе тотальных спленоцитов облученному реципиенту выживают и гомеостатически пролиферируют преимущественно CD8⁺ Т-клетки донора. Это согласуется с результатами ранних работ, в которых показано, что CD8⁺ клетки нуждаются в меньшем наборе стимулов для гомеостатической пролиферации по сравнению с CD4⁺ Т-лимфоцитами [19].

Рис. 2. Анализ функциональной активности ex vivo спленоцитов мышей в условиях лимфопении. А – уровень пролиферации in vitro спленоцитов сублетально облученных мышей в MLR. Мышей B10.D2(R101) – неиммунизированных (Неиммунизированные облученные) или иммунизированных (Иммунизированные облученные) – сублетально облучали. Через 10 дней спленоциты этих мышей использовали в качестве респондеров в MLR. Спленоциты мышей B10.D2(R101) (KdDb) (Сингенные стимуляторы), C57BL/10 (KbDb) (Аллогенные/специфические стимуляторы) и FVB (H-2q) (Аллогенные/неспецифические стимуляторы), обработанные митомицином С, использовали в качестве стимуляторов. Клетки культивировали in vitro в течение 72 ч. Пролиферативную активность спленоцитов оценивали по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру за последние 8 ч. Относительный уровень пролиферации определяли как соотношение аллогенного и сингенного ответа. Относительный уровень пролиферации Неиммунизированных необлученных и Иммунизированных необлученных мышей использовали в качестве референсного. Данные получены в трех независимых экспериментах, три мыши в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (*p ≤ 0.05). Б – уровень пролиферации in vitro спленоцитов сублетально облученных мышей после адоптивного переноса. Неиммунизированных мышей B10.D2(R101) облучали сублетально и в/в вводили спленоциты неиммунизированных (Облученные + Неиммунизированные клетки) или иммунизированных (Облученные + Иммунизированные клетки) сингенных мышей. Через 10 дней после адоптивного переноса спленоциты этих мышей использовали в качестве респондеров в MLR. Спленоциты мышей B10.D2(R101) (KdDb) (Сингенные стимуляторы), C57BL/10 (KbDb) (Аллогенные/специфические стимуляторы) и FVB (H-2q) (Аллогенные/неспецифические стимуляторы), обработанные митомицином С, использовали в качестве стимуляторов. Клетки культивировали in vitro в течение 72 ч. Пролиферативную активность спленоцитов оценивали по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру за последние 8 ч. Относительный уровень пролиферации определяли как соотношение аллогенного и сингенного ответа. Относительный уровень пролиферации Неиммунизированных необлученных и Иммунизированных необлученных мышей использовали в качестве референсного. Данные получены в трех независимых экспериментах, три мыши в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (*p≤0.05, **p≤0.01). В – уровень патоген-индуцированной пролиферации in vitro спленоцитов сублетально облученных мышей после адоптивного переноса. Неиммунизированных мышей B10.D2(R101) сублетально облучали и в/в вводили тотальные спленоциты неиммунизированных сингенных мышей. Через 10 дней после адоптивного переноса спленоциты этих мышей помещали в культуру in vitro с 106 КОЭ/мл (LM 106) или 107 КОЭ/мл (LM 107) инактивированных прогреванием клеток бактерии Listeria monocytogenes (штамм EGD) или с 105 КОЭ/мл (ST 105) инактивированных прогреванием клеток бактерии Salmonella typhimurium (штамм IE 147) на 72 ч. Пролиферативную активность спленоцитов оценивали по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру за последние 8 ч. Индекс патоген-индуцированной пролиферации определяли как отношение уровня пролиферации клеток в присутствии бактерии к фоновой пролиферации. Относительный уровень пролиферации Неиммунизированных необлученных и Неиммунизированных облученных мышей B10.D2(R101) использовали в качестве референсного. Данные получены в трех независимых экспериментах, 3–6 мышей в группе

При сублетальном облучении в популяции CD8⁺ Т-клеток реципиента (GFP^-) снизилось относительное количество наивных клеток и увеличилась доля клеток памяти и эффекторных клеток по сравнению с необлученным контролем (рис. 4Г). Среди донорских (GFP⁺) CD8⁺ Т-лимфоцитов в селезенке облученных мышей после адоптивного переноса 60% клеток имели фенотип клеток памяти (рис. 4Г).

В ряде исследований обнаружены регуляторные CD8⁺CD122⁺ Т-клетки с супрессорной активностью [15]. Мы проанализировали экспрессию маркера CD122 в популяции CD8⁺ Т-лимфоцитов реципиента (GFP^-) и донора (GFP⁺) в селезенке облученных мышей после адоптивного переноса (рис. 4Д,Е). Более 97% донорских CD8⁺ Т-лимфоцитов приобрели фенотип CD8⁺CD122⁺ (рис. 4Д), при этом относительное количество CD8⁺CD122⁺ Т-клеток среди лимфоцитов реципиента не отличалось от контрольных значений в группах облученных и необлученных мышей (рис. 4Д). Уровень экспрессии CD122 в субпопуляциях клеток памяти (CD44⁺CD62L⁺) и эффекторных клеток (CD44⁺CD62L^-) среди Т-лимфоцитов донора (GFP⁺) был значимо выше, чем в данных субпопуляциях среди клеток реципиента (GFP^-) (рис. 4Е).

Для определения потенциально аутореактивных Т-клеток среди донорских лимфоцитов мы проанализировали экспрессию маркера CD5 в популяции CD8⁺CD44⁺ Т-клеток (рис. 5 А,Б,В). Практически все GFP⁺ CD8⁺CD44⁺ Т-клетки экспрессировали CD5 (рис. 5А), при этом соотношение CD5⁺/CD5^- клеток в популяции CD8⁺CD44⁺ лимфоцитов реципиента (GFP^-) не было изменено по сравнению со значениями в группах облученных и необлученных мышей (рис. 5А,Б). Уровень экспрессии CD5 в субпопуляции CD44⁺CD62L⁺ клеток был сопоставимым во всех экспериментальных группах (рис. 5В).

Рис. 3. Динамика отторжения лимфомы EL4 у сублетально облученных мышей B10.D2(R101) после адоптивного переноса. Неиммунизированных мышей B10.D2(R101) сублетально облучали и через 10 дней прививали подкожно 20.0 × 106 клеток EL4. Одновременно с прививкой опухоли проводили адоптивный перенос сингенных спленоцитов. Экспериментальные группы: неиммунизированные необлученные мыши B10.D2(R101) (неиммунизированные), иммунизированные необлученные мыши B10.D2(R101) (иммунизированные), неиммунизированные облученные мыши B10.D2(R101) (неиммунизированные облученные), иммунизированные облученные мыши B10.D2(R101) (иммунизированные облученные) и неиммунизированные облученные мыши с адоптивным переносом B10.D2(R101) (облученные + АП). Представлены данные одного репрезентативного эксперимента, три мыши в группе

Рис. 4. Абсолютное количество клеток и профиль экспрессии активационных маркеров в популяции CD8+ Т-клеток донора (GFP+) и реципиента (GFP-) у сублетально облученных мышей после адоптивного переноса. А – абсолютное количество лейкоцитов в селезенке необлученных мышей (Необлученные мыши), мышей через 10 дней после сублетального облучения (Облученные мыши) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (Облученные мыши + АП). Данные получены в трех независимых экспериментах, 6–9 мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (*p ≤0.05, **p ≤0.01). Б – относительное количество CD3+ клеток в селезенке необлученных мышей (Необлученные мыши), мышей через 10 дней после сублетального облучения (Облученные мыши) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (Облученные мыши + АП). Данные получены в трех независимых экспериментах, 4–6 мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (*p ≤0.05, **p ≤0.01). В – относительное количество CD3+CD8+ клеток в селезенке необлученных мышей (Необлученные мыши), мышей через 10 дней после сублетального облучения (Облученные мыши) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (Облученные мыши + АП). Данные получены в трех независимых экспериментах, 4–6 мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (**p ≤0.01). Г – относительное количество CD8+ Т-клеток с фенотипом наивных клеток (Naive, CD44-CD62L+), эффекторных клеток памяти (ЕM, CD44+CD62L-) и центральных клеток памяти (CM, CD44+CD62L+) в селезенке необлученных мышей (Необлученные мыши), мышей через 10 дней после сублетального облучения (Облученные мыши) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (Облученные мыши + АП). Данные получены в трех независимых экспериментах, шесть мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (**p ≤0.01). Д – относительное количество CD8+CD122+ Т-клеток в селезенке необлученных мышей (верхняя левая панель), мышей через 10 дней после сублетального облучения (верхняя правая панель) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (популяция лимфоцитов донора (GFP+) и реципиента (GFP-)) (нижние панели). Представлены данные одного репрезентативного эксперимента. Данные получены в трех независимых экспериментах, шесть мышей в группе. Е – уровень экспрессии CD122 в популяции CD8+CD44+CD62L+ клеток (левая панель) и CD8+CD44+CD62L- клеток (правая панель) в селезенке необлученных мышей (Необлученные мыши), мышей через 10 дней после сублетального облучения (Облученные мыши) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (Облученные мыши + АП; популяция лимфоцитов донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, шесть мышей в группе. Представлены данные одного репрезентативного окрашивания

В отдельных работах обнаружены супрессорные функции CD8⁺CD122⁺CD49d^low Т-клеток [18]. Мы оценили экспрессию маркера CD49d в популяции CD8⁺CD44⁺ Т-клеток реципиента (GFP^-) и донора (GFP⁺) в селезенке облученных мышей после адоптивного переноса (рис. 5Г,Д,Е). Практически 100% донорских CD8⁺CD44⁺ лимфоцитов приобрели фенотип CD49d^hi (рис. 5Г,Д), при этом соотношение CD49d^low/CD49d^hi клеток среди CD8⁺CD44⁺ лимфоцитов реципиента было таким же, как в этой популяции Т-клеток облученных и необлученных мышей (рис. 5Г,Д). Выявлено значительное повышение уровня экспрессии данного маркера в субпопуляции CD44⁺CD62L⁺ донорских GFP⁺ CD8⁺ Т-клеток (рис. 5Е).

Кроме того, более 85% донорских CD8⁺CD44⁺ Т-клеток имели фенотип CXCR3⁺ (рис. 5Ж,З). Уровень экспрессии CXCR3 в субпопуляции CD44⁺CD62L⁺ был сопоставимым во всех экспериментальных группах, а в субпопуляции донорских CD44⁺CD62L^- Т-клеток он соответствовал значениям в группе необлученных животных (рис. 5И).

Таким образом, при адоптивном переносе сингенных спленоцитов реципиенту с лимфопенией наблюдается преимущественная гомеостатическая пролиферация CD8⁺ клеток донора, большая часть которых приобретает фенотип клеток памяти CD44⁺CD62L⁺, при этом большинство донорских CD44⁺ Т-клеток имеет фенотип CD122⁺СD5⁺CD49d^hiCXCR3⁺.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования последних лет показали, что нет строгой корреляции между поверхностным фенотипом и функциональными свойствами Т-клетки памяти (способность к длительному самоподдержанию, устойчивость к апоптозу, упрощенные условия активации, усиленная пролиферация и приобретение эффекторных функций в ответ на специфический антиген). Известно, что популяция CD8⁺CD44⁺CD62L⁺CD122⁺ клеток может проявлять иммуносупрессорные свойства [13, 16–18, 20]. Для этой популяции характерны высокий уровень экспрессии рецептора хемокинов CXCR3 [17] и низкий – молекулы CD49d (CD8⁺CD122⁺CD49d^low) [18]. Аналогичные популяции супрессорных CD8⁺ Т-клеток обнаружены у человека [21].

Мы показали, что адоптивный перенос сингенных лимфоцитов облученным мышам приводит к подавлению иммунного ответа на аллоантигены и бактериальные патогены. Данный эффект может быть обусловлен гомеостатической пролиферацией клонов Т-клеток, отличных от клонотипов, вовлеченных в эти иммунные ответы. Это подтверждается тем, что сниженный ответ ex vivo на аллоантигены наблюдался у Т-лимфоцитов облученных мышей независимо от адоптивного переноса спленоцитов неиммунизированных или иммунизированных мышей (рис. 2Б).

Лимфопения может индуцировать гомеостатическую пролиферацию потенциально аутореактивных клонов. Стоит особо отметить, что в наших исследованиях практически все донорские CD8⁺CD44⁺ Т-клетки экспрессировали маркер CD5. В ряде работ показано, что уровень экспрессии CD5 коррелирует с аффинностью Т-клеточного рецептора (ТКР) к собственными МНС/пептидным комплексам [22–24]. Взаимодействие Т-клеток с собственными МНС необходимо для их пролиферации в условиях лимфопении [25, 26], и Т-лимфоциты с самым высоким уровнем экспрессии CD5 (т.е., наивные Т-клетки) обладают наибольшим потенциалом гомеостатической пролиферации [3]. Таким образом, наивные Т-клетки могут служить основным источником суррогатных клеток памяти (T_ML) при лимфопении [15, 27]. В соответствии с этими данными, в нашем исследовании наблюдалось повышенное относительное количество донорских CD8⁺CD44⁺CD62L⁺CD5⁺ Т-клеток, в 1.5 раза превышающее это значение во всех контрольных группах (рис. 5А,Б).

Рис. 5. Относительное количество и профиль экспрессии маркеров CD49d, CD5 и CXCR3 в популяции CD8+CD44+ Т-клеток селезенки необлученных мышей (Необлученные мыши), мышей через 10 дней после сублетального облучения (Облученные мыши) и мышей через 10 дней после сублетального облучения и адоптивного переноса (Облученные мыши + АП). А – профиль экспрессии CD5 в популяции CD8+CD44+ Т-клеток селезенки Необлученных мышей (верхняя левая панель), Облученных мышей (верхняя правая панель) и Облученных мышей + АП (среди лимфоцитов донора (GFP+) и реципиента (GFP-)) (нижние панели). Представлены данные одного репрезентативного окрашивания. Данные получены в трех независимых экспериментах, 4–6 мышей в группе. Б – относительное количество CD8+CD44+ Т-клеток с фенотипов CD5low и CD5hi в селезенке Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, 4–6 мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (**p ≤0.01). В – профиль экспрессии CD5 в популяции CD8+CD44+CD62L+ (слева) и CD8+CD44+CD62L- (справа) Т-клеток селезенки Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, 4–6 мышей в группе. Представлены данные одного репрезентативного окрашивания. Г – профиль экспрессии CD49d в популяции CD8+CD44+ Т-клеток селезенки Необлученных мышей (левая верхняя панель), Облученных мышей (верхняя правая панель) и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)) (нижние панели). Представлены данные одного репрезентативного окрашивания. Данные получены в трех независимых экспериментах, 5–6 мышей в группе. Д – относительное количество CD8+CD44+ Т-клеток с фенотипом CD49d- и CD49d+ в селезенке Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, 5–6 мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (**p ≤0.01). Е – профиль экспрессии CD49d в популяции CD8+CD44+CD62L+ (слева) и CD8+CD44+CD62L- (справа) Т-клеток селезенки Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, 5–6 мышей в группе. Представлены данные одного репрезентативного окрашивания. Ж – профиль экспрессии CXCR3 в популяции CD8+CD44+ Т-клеток селезенки Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Представлены данные одного репрезентативного окрашивания. Данные получены в трех независимых экспериментах, шесть мышей в группе. З – относительное количество CD8+CD44+ Т-клеток с фенотипом CXCR3- и CXCR3+ в селезенке Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клети донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, шесть мышей в группе. Для статистического анализа использовали непарный критерий Стьюдента (**p ≤0.01). И – профиль экспрессии CXCR3 в популяции CD8+CD44+CD62L+ (слева) и CD8+CD44+CD62L- (справа) Т-клеток селезенки Необлученных мышей, Облученных мышей и Облученных мышей + АП (клетки донора (GFP+) и реципиента (GFP-)). Данные получены в трех независимых экспериментах, шесть мышей на группу. Представлены данные одного репрезентативного окрашивания

Наивные Т-лимфоциты обладают высокой радиочувствительностью [28], и полное облучение организма может сократить пул данных клеток (рис. 4Г). Поэтому мы предполагаем, что в условиях лимфопении в отсутствие конкуренции за собственные МНС/пептидные комплексы адоптивно перенесенные донорские наивные Т-клетки быстро получают тонические сигналы для пролиферации [29, 30] и приобретают фенотип центральных клеток памяти (рис. 4Г). Таким образом, в условиях лимфопении приобретение Т-лимфоцитом фенотипа клеток памяти может быть следствием взаимодействия ТКР с МНС/пептидными комплексами и гомеостатической пролиферации, а не отображением истинного антигенного опыта этого Т-лимфоцита. Так, ранее мы показали, что у мышей, трансгенных по β-цепи ТКР, Т-лимфоциты, несущие трансгенную β-цепь ТКР, преимущественно имеют фенотип наивных клеток из-за значительной конкуренции за взаимодействие с собственными комплексами MHC/пептид, а Т-клетки с эндогенными β-цепями ТКР обладают фенотипом эффекторов и клеток памяти вследствие избытка лигандов, доступных для распознавания [31].

Интересно, что в реципиенте с лимфопенией донорские CD8⁺ Т-клетки приобретают фенотип, значительно отличающийся от фенотипа CD8⁺ лимфоцитов хозяина. CD8⁺ Т-клетки составляют 70% донорских CD3⁺ лимфоцитов и имеют преимущественно фенотип центральных клеток памяти CD44⁺CD62L⁺. Кроме того, практически все CD8⁺ лимфоциты донора являются CD49d^hi и экспрессируют CD122. При этом уровень экспрессии этих маркеров в популяции донорских CD44⁺CD62L⁺ клеток значительно превышает значения в соответствующей популяции CD8⁺ лимфоцитов реципиента.

Таким образом, нами показано, что при гомеостатической пролиферации в облученном организме донорские CD8⁺ Т-клетки приобретают фенотип CD44⁺CD62L⁺ CD122⁺CD49d^hi, который сочетает фенотипические характеристики истинных клеток памяти (CD44⁺CD62L⁺CD49d^hi) и супрессорных CD8⁺ Т-лимфоцитов (CD44⁺CD62L⁺CD122⁺) [18]. Более того, донорские Т-клетки также экспрессируют рецептор хемокинов CXCR3 – еще один маркер супрессорных CD8⁺CD122⁺ клеток [17]. Учитывая полученные данные, мы предполагаем, что в условиях лимфопении при адоптивном переносе сингенных лимфоцитов может формироваться уникальная популяция донорских CD8⁺ клеток с супрессорной активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе получено новое подтверждение того, что экспрессия CD44 на поверхности Т-клеток не всегда отображает их истинный антигенный опыт и не обязательно приводит к приобретению функциональных свойств истинных Т-клеток памяти. Следовательно, некорректно идентифицировать популяцию CD8⁺ клеток памяти исключительно по их поверхностному фенотипу без проведения подтверждающих функциональных тестов. В данной работе при адоптивном переносе сингенных лимфоцитов в облученный организм с лимфопенией происходила конверсия донорских CD8⁺ Т-клеток в T_ML-клетки, которые сочетали фенотипические характеристики истинных клеток памяти и супрессорных CD8⁺ Т-лимфоцитов. При этом наблюдалось значительное ухудшение функционального состояния иммунной системы реципиента, Т-лимфоциты которого слабо отвечали на аллоантигены и бактериальные антигены. Показано, что в организме человека существуют T_ML CD8⁺ Т-клетки [32] и супрессорные CD8⁺CD44⁺CXCR3⁺ Т-лимфоциты [17]. Таким образом, проведение адоптивного переноса с целью восстановления клеточности периферических лимфоидных органов может иметь клинически неблагоприятный побочный эффект – повышение предрасположенности или чувствительности к инфекционным заболеваниям вследствие ухудшения иммунного ответа на антигены.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МНС – главный комплекс гистосовместимости; T_ML – суррогатные клетки памяти; MLR – смешанная культура лимфоцитов; cpm – импульсы в минуту; АП – адоптивный перенос; ТКР – Т-клеточный рецептор.

Данное исследование проведено при финансовой поддержке Мегагранта (договор № 14.W03.31.0020 между Министерством науки и высшего образования Российской Федерации и Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Институт биологии гена» Российской академии наук). Работу проводили с использованием оборудования Центра коллективного пользования ФГБУН ИБГ РАН при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Авторы выражают благодарность Нестеренко Л.М. и Ермолаевой С.А. (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва) за предоставление вирулентных штаммов сальмонеллы и листерии.

Об авторах

Анастасия А. Калинина

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: aakalinina89@gmail.com
Россия, Москва

Людмила М. Хромых

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: lkhromykh@list.ru
Россия, Москва

Дмитрий Б. Казанский

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: kazansky1@yandex.ru
Россия, Москва

Алексей В. Дейкин

Центр коллективного пользования Института биологии гена РАН; Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Института биологии гена РАН

Email: deikin@rambler.ru
Россия, Москва; Москва

Юлия Ю. Силаева

Центр коллективного пользования Института биологии гена РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: yulya.silaeva@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы