Полиморфный локус SNCA-Rep1: связь с риском болезни Паркинсона и метилированием гена SNCA

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона (БП) – второе по распространенности нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера, затрагивающее 2% лиц старше 60 лет [1]. При БП наблюдается дегенерация дофаминергических нейронов черной субстанции, накопление в них альфа-синуклеина и образование внутриклеточных включений – телец Леви [2]. Клиническая картина БП представлена сочетанием гипокинезии с ригидностью, тремором покоя и постуральной неустойчивостью, а также широким спектром немоторных проявлений (психических, вегетативных, сенсорных, когнитивных и др.) [3, 4].

БП по своей этиологии можно разделить на две группы: наследственные и спорадические. Наследственные формы БП характеризуются наличием генетически детерминированной патологии (мутации в гене), связанной с развитием заболевания. Уже сейчас определено более 20 каузальных генов БП, основные из которых – SNCA, PARK2 (Parkin), LRRK2 и GBA [5]. Однако моногенные формы с различными типами наследования составляют только около 10–20% БП [6]. Остальные случаи представлены многофакторными, полигенными формами, в патогенез которых вносят вклад как генетическая составляющая в виде предрасположенности к развитию нейродегенерации, так и различные экзогенные факторы (интоксикация гербицидами, черепно-мозговая травма, контакт с тяжелыми металлами, особенности питания, уровень загрязнения воздуха), а также физиологическое старение [7].

К настоящему моменту с помощью полногеномных ассоциативных исследований (GWAS, genome-wide association study) обнаружено множество генов предрасположенности к развитию БП [8–10]. Эти исследования выявили локусы риска как в генах, ранее не считавшихся связанными с патогенезом БП, так и в давно известных генах предрасположенности к данному заболеванию. Среди них значительный интерес представляет ген SNCA, расположенный на 4-й хромосоме, поскольку он кодирует белок альфа-синуклеин. Миссенс-мутация Ala53Thr в гене SNCA, описанная в 1997 году в итальянской семье с аутосомно-доминантным типом наследования, была первой мутацией, обнаруженной при наследственных формах БП [11]. Среди мутаций в гене SNCA выделяют как дупликации и трипликации определенных участков гена, так и точковые мутации [12, 13]. При патоморфологическом исследовании областей головного мозга пациентов с мультипликациями в SNCA обнаружено повышение экспрессии альфа-синуклеина, что может свидетельствовать о прямой связи между дозой гена и уровнем его экспресcии [14, 15]. Сверхэкспрессия альфа-синуклеина обнаружена также в образцах головного мозга пациентов со спорадической формой БП. Таким образом, полученные данные указывают на универсальную роль повышенной экспрессии альфа-синуклеина в патогенезе большинства форм БП [16].

Помимо мутаций в SNCA, приводящих к наследственным формам БП, в гене альфа-синуклеина обнаружено множество полиморфизмов, повышающих предрасположенность к спорадической форме БП. Среди них можно выделить ряд однонуклеотидных полиморфизмов, находящихся в основном на 3’-конце гена SNCA, а также полиморфный локус SNCA-Rep1 в 5’-концевой области SNCA [17]. Локус SNCA-Rep1, расположенный примерно за 10 т.п.н. до старта транскрипции, представляет собой полиморфный микросателлит с различным числом динуклеотидных повторов. Впервые этот полиморфизм, состоящий из динуклеотидных повторов (ТС)x(TT)1(TC)y(TA)­z­(CA)w, число которых варьирует от 8 до 13, был описан Xia и соавт. в 1996 году [18]. В зависимости от количества повторов выделяют шесть аллелей гена SNCA. Короткие аллели (с меньшим количеством повторов) считаются протективными, в то время как более длинные аллели могут увеличивать риск развития БП [19, 20]. Однако, несмотря на прогресс в обнаружении полиморфизмов, ассоциированных с предрасположенностью к БП, многие механизмы их влияния на развитие заболевания до сих пор остаются нераскрытыми.

В последние годы важная роль в развитии разных многофакторных заболеваний (в основном онкологических, как наиболее изученных) отводится эпигенетическим механизмам, регулируют уровень экспрессии генов в различных системах организма без изменения собственно нуклеотидной последовательности ДНК. Основными эпигенетическими механизмами являются метилирование генов, модификации гистонов и экспрессия некодирующих РНК [21]. Эпигеном неразрывно связан с факторами окружающей среды, в отличие от генома он может изменяться в течение жизни под воздействием изменения образа жизни, питания, сопутствующей патологии [22, 23].

Эпигенетические механизмы, связанные с патогенезом БП, стали изучать относительно недавно. Изучали, главным образом, метилирование ДНК – процесс, при котором к цитозину в составе CpG-динуклеотида (CpG-сайт) присоединяется метильная группа. CpG-сайты часто концентрируются в транскрипционно значимых областях гена (промоторные и регуляторные области), образуя так называемые CpG-островки (CpG-богатые области). CpG-островки содержатся в промоторных областях 60% генов, кодирующих белки. CpG-островки преимущественно неметилированы, в то время как на уровне полного генома метилировано до 70–80% всех CpG-сайтов. Установлено, что гиперметилирование CpG-сайтов нарушает связывание этих областей с ДНК-полимеразами и транскрипционными факторами, угнетая экспрессию гена, и, наоборот, гипометилирование обычно ассоциировано с повышенной транскрипцией соответствующей мРНК и экспрессией гена [21]. CpG-островки находятся в промоторной области и интроне 1 гена SNCA. Учитывая, что экзон 1 гена альфа-синуклеина является нетранскрибируемым, транскрипция начинается с экзона 2, расположенного сразу за интроном 1, предположили, что уровень метилирования именно этих областей может влиять на транскрипцию, уровень экспрессии альфа-синуклеина и, возможно, риск развития спорадической формы БП [24].

Нами изучено влияние длины полиморфного локуса SNCA-Rep1 на риск развития БП, а также на уровень метилирования CpG-сайтов в гене SNCA.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В исследование ассоциации длины полиморфного локуса SNCA-Rep1 с риском развития БП вошли 460 пациентов (212 мужчин и 248 женщин). Средний возраст пациентов составил 55.1 ± 13.5 лет, средний возраст к моменту начала заболевания – 49.9 ± 12.5 лет, средняя длительность – 5.5 ± 4.3 лет; все пациенты были на II и III стадиях болезни по функциональной шкале Хен–Яра (средняя – 2.3 ± 0.4). Все включенные в исследование пациенты получали противопаркинсоническую терапию (как правило, двумя и более препаратами), при этом более 80% больных принимали дофаминергическую терапию (агонисты дофаминовых рецепторов и/или препараты леводопы). Диагноз «болезнь Паркинсона» выставляли согласно критериям Международного общества по изучению болезни Паркинсона и расстройствам движений. Группа контроля, сопоставимая по полу и возрасту, состояла из 460 здоровых лиц.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). Генотипирование динуклеотидных повторов проводили методом фрагментного анализа на капиллярном генетическом анализаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems/HITACHI). Амплификацию фрагментов ДНК, содержащих тандемные повторы, проводили с помощью праймеров: прямого (5’-(Fam) CCTGGCATATTTGATTGCAA-3’) и обратного (5’-GACTGGCCCAAGATTAACCA-3’). Полученные результаты обрабатывали при помощи программного обеспечения GeneMapper (v. 4.0 Applied Biosystems).

В исследование ассоциации длины полиморфного локуса SNCA-Rep1 и уровня метилирования промотора и интрона 1 гена SNCA вошли 44 пациента с БП, отобранных случайным образом из основной группы (18 мужчин, 26 женщин, средний возраст 58.2 ± 9.7 лет, начало заболевания – 50.5 ± 10.9 лет) и 20 сопоставимых по полу и возрасту здоровых лиц в качестве группы контроля.

В работе проведен анализ уровня метилирования шести CpG-сайтов в промоторной области гена SNCA (CpG-сайты с 4–9, нумерация от начала промоторной области) и 22 CpG-сайта на 3’-конце интрона 1 (CpG-сайты с 27–48, нумерация от начала интрона 1). Паттерн метилирования определяли методом прямого секвенирования соответствующих участков ДНК после бисульфитной конверсии с помощью набора EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, США). Результаты визуализировали с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis Software (v. 5.2 Applied Biosystems). Степень метилирования рассчитывали путем анализа первичных результатов секвенирования по Сэнгеру. При этом процент метилирования каждого конкретного CpG-сайта в каждом образце ДНК рассчитывали по отношению высоты пика С (пик электрофореграммы, положение которого соответствует анализируемому CpG-сайту, указывающий на наличие метилированного цитозина) относительно суммарной высоты пиков С + Т данного положения (метилированный и неметилированный цитозин).

Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 10 (Statsoft Russia). Аллельные варианты сравнивали с помощью критерия хи-квадрат (многопольная таблица сопряженности), при множественных сравнениях использовали поправку Бонферрони. Связь между длиной полиморфизма и уровнем метилирования оценивали с помощью множественной линейной регрессии. Критический уровень значимости принимали равным 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В работе исследован полиморфный микросателлит, локализованный в промоторной области гена альфа-синуклеина, – SNCA-Rep1. Матрицы генотипов группы БП и контрольной группы представлены в табл. 1. Фрагментный анализ показал, что наиболее частым аллелем в группе БП и в контрольной группе является Rep1-261 (66.4 и 66.2% соответственно).

Таблица 1. Матрица генотипов в группе БП и в контрольной группе по аллельным вариантам полиморфизма SNCA-Rep1

Условное разделение аллельных вариантов на короткие (SNCA-Rep1-255, -257 и -259), промежуточный (SNCA-Rep1-261) и длинные (SNCA-Rep1-263 и -265) показало, что длинные аллели при БП встречаются чаще, чем короткие. Распределение частоты встречаемости аллелей в подгруппах представлено в табл. 2.

Таблица 2. Частота встречаемости подгрупп аллелей полиморфизма SNCA-Rep1

Примечание. Результаты представлены в виде абсолютного числа аллелей, в скобках – процент к общему числу в группе. * – р <0.05. ^# – значимые с поправкой Бонферрони.

В работе определена ассоциация длины полиморфного локуса SNCA-Rep1 с уровнем метилирования промоторной области и интрона 1 гена SNCA. Проанализирована связь между уровнем метилирования отдельного CpG-сайта и длиной обоих аллельных полиморфизмов SNCA-Rep1 у каждого больного (первый аллель меньшей длины, второй – большей или равной длины).

Ассоциации между уровнем метилирования CpG-сайтов промоторной области и длиной SNCA-Rep1 не выявлено ни в группе БП, ни в контрольной группе.

В группе БП в области интрона 1 гена SNCA локализованы четыре близкорасположенных CpG-сайта, при этом большая длина полиморфизма SNCA-Rep1 коррелировала с гипометилированием этих сайтов. Результаты представлены в табл. 3. У лиц контрольной группы не обнаружено статистически значимых ассоциаций между исследуемыми параметрами.

Таблица 3. Взаимосвязь метилирования CpG-сайтов и длины полиморфных аллелей SNCA-Rep1 у пациентов с БП

Примечание. Первый аллель SNCA-Rep1 – аллель меньшей длины, второй аллель SNCA-Rep1 – аллель большей или равной длины. *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001. ^# – значимые с поправкой Бонферрони.

Необходимо также отметить, что в состав группы БП вошел гетерозиготный носитель редкого «длинного» аллеля SNCA-Rep1-265. Этот пациент имел низкий уровень метилирования CpG-сайтов по сравнению с остальными пациентами. В группе пациентов с БП средний уровень метилирования в интронной области составил 15.8 ± 5.4% по всем CpG-сайтам, тогда как средний уровень метилирования у носителя «длинного» аллеля SNCA-Rep1-265 равен 10.7%. Самый высокий уровень метилирования (33.9%) наблюдался у одного из гомозиготных носителей «короткого» аллеля SNCA-Rep1-259.

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашей работе выявлена связь полиморфного аллеля SNCA-Rep1 с риском развития БП. Связь длинных аллелей SNCA-Rep1 с повышенным риском развития БП показана в ряде исследований, тогда как более короткие аллели были ассоциированы с пониженным риском заболевания соответственно [19, 20]. В нашей выборке «протективный» характер коротких аллелей подтвердить не удалось, тогда как длинные аллели SNCA-Rep1 были значимо ассоциированы с развитием БП. Кроме того, пациенты с длинным аллелем SNCA-Rep1-263 предрасположены к более раннему дебюту заболевания, а у пациентов с коротким аллелем SNCA-Rep1-259, наоборот, заболевание начинается в более позднем возрасте [25], что также подтверждает «предрасполагающий» характер длинных аллелей и «протективный» – коротких.

Влияние длины SNCA-Rep1 на риск развития БП связывают с изменением экспрессии гена. В нескольких работах обнаружено повышение экспрессии SNCA в периферической крови и в центральной нервной системе при БП. При этом уровень экспрессии мРНК SNCA и белка альфа-синуклеина зависят от длины полиморфизма SNCA-Rep1: большему количеству динуклеотидных повторов полиморфизма соответствует большая экспрессия гена [26–30]. Объяснение того, что длинные аллели SNCA-Rep1 предрасполагают к БП посредством увеличения экспрессии SNCA, может лежать как в самом полиморфизме, изменяющем связывание транскрипционных факторов, так и в эпигенетических модификациях, например, в метилировании регуляторных областей гена SNCA, которые, в свою очередь, также могут непосредственно влиять на транскрипцию.

Результаты исследования уровня метилирования гена альфа-синуклеина у пациентов с БП неоднозначны: в некоторых работах обнаружено значимое гипометилирование SNCA при БП в сравнении с контролем [24, 30–34], тогда как в других не найдено разницы между группами [35–37]. Уровень метилирования изучали как в клетках головного мозга (компактная часть черной субстанции, фронтальная кора, мозжечок), так и в лейкоцитах периферической крови. При этом уровень метилирования в центральной нервной системе был сопоставим с уровнем в периферической крови, что позволяет использовать паттерн метилирования в лейкоцитах крови в качестве аналога метилирования в головном мозге [34, 38].

Изучена также ассоциация между уровнем метилирования и различными генетическими полиморфизмами. Обнаружено, что некоторые однонуклеотидные полиморфизмы ассоциированы с гипометилированием SNCA у пациентов с БП [39, 40]. Выявлена также корреляция между уровнем метилирования SNCA и длиной полиморфного локуса SNCA-Rep1: так у носителей генотипа с длинным аллелем SNCA-Rep1-263 гипометилирование интрона 1 SNCA было более выраженным по сравнению с носителями коротких аллелей [30].

В нашей работе оценено влияние длины полиморфного локуса SNCA-Rep1 на уровень метилирования различных CpG-сайтов в промоторной области и интроне 1 гена SNCA. Мы не выявили разницы в уровне метилирования промоторной области. В то же время показана четкая ассоциация между уровнем метилирования интрона 1 гена SNCA и длиной SNCA-Rep1. В группе БП меньшая длина аллеля SNCA-Rep1 была связана с большим уровнем метилирования четырех близкорасположенных CpG-сайтов, и, наоборот, большая длина – с меньшим уровнем метилирования. Полученные нами данные согласуются с результатами более ранних работ, при этом в других исследованиях также выявлена разница в уровнях метилирования именно в интроне 1 SNCA, что может свидетельствовать о его высокой транскрипционной значимости [30]. Таким образом, гипометилирование именно этой области характерно для длинных аллелей SNCA-Rep1, которые предрасполагают к заболеванию.

Учитывая изменяемость эпигенетических феноменов, паттерн метилирования SNCA представляется вторичным по отношению к генетическим вариантам SNCA-Rep1, однако для подтверждения данного предположения необходимы дальнейшие исследования. На настоящий момент именно эпигенетическими феноменами большинство исследователей пытаются объяснить влияние множества полиморфизмов в некодирующих областях, ассоциированных с многофакторными заболеваниями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведен анализ взаимосвязи длины полиморфного локуса SNCA-Rep1 с риском развития БП и уровнем метилирования промоторной и интронной областей гена SNCA, ключевого для данного заболевания. Полученные результаты позволяют подтвердить ассоциацию между носительством длинных аллелей SNCA-Rep1 и повышенным риском развития БП, а также взаимосвязь между длинными аллелями SNCA-Rep1 и гипометилированием интрона 1 гена SNCA. Таким образом, прослежена взаимосвязь фенотипа, генотипа и эпигенотипа в ряду «БП–длинные аллели SNCA-Rep1–гипометилирование SNCA». Необходимы дальнейшие исследования с анализом вклада эпигенетических модификаций в молекулярный патогенез заболевания, что будет способствовать разработке принципиально новых технологий эпигенетической коррекции, которая представляется одним из наиболее перспективных направлений таргетной терапии нейродегенеративного процесса.

Об авторах

Е. В. Яковенко

Email: ekfedotova@gmail.com
Россия, Москва

Н. Ю. Абрамычева

Email: ekfedotova@gmail.com
Россия, Москва

Е. Ю. Федотова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekfedotova@gmail.com
Россия, Москва

С. Н. Иллариошкин

Email: ekfedotova@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы