Рекомбинантные биспецифические антитела к рецептору ErbB2 и интерферону-β человека

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

ErbB2 – рецептор эпидермального фактора роста;

ИФНβ – интерферон-β человека;

Tz – трастузумаб;

мАТ – моноклональные антитела;

БсАт – биспецифические антитела;

 L и Н – легкая и тяжелая цепи антитела соответственно;

VL и VH – вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антител;

 С_H1–С_Н3 – константные домены тяжелой цепи антитела;

SOE-PCR – ПЦР с перекрывающимися областями;

ЕС₅₀ – полумаксимальная эффективная концентрация;

PBS – фосфатно-солевой буфер.

Рак молочной железы является основной причиной онкологической смертности среди женщин. Он составляет почти 11% от числа всех онкологических заболеваний и занимает первое место в мире по распространенности. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения России в 2017 г. рак молочной железы составил 21.1%, число пациенток с I–II стадиями заболевания составило 69.9% [1]. В значительной части опухолей выявлена сверхэкспрессия рецептора эпидермального фактора роста ErbB2. Амплификация и/или сверхэкспрессия ErbB2 наблюдается в 20–34% случаев инвазивного рака молочной железы [2, 3], она ассоциирована с повышенной клеточной пролиферацией, усиленным ангиогенезом, сниженным апоптозом опухолевых клеток и, как следствие, с высоким потенциалом метастазирования [4, 5]. Сверхэкспрессия ErbB2 считается независимым прогностическим фактором повышенного риска рецидива заболевания. В случае ErbB2-положительного рака молочной железы I–II стадии риск местного рецидивирования в 2.7 раза, а риск отдаленного метастазирования — в 5.3 раза выше, чем ErbB2-отрицательного [2]. Кроме того, ErbB2 может сверхэкспрессироваться на опухолях мочевого пузыря, поджелудочной железы, яичника, матки, толстой кишки, почки, головы и шеи, желудка, пищевода и предстательной железы [6]. Сверхэкспрессию HER2 выявляют преимущественно при злокачественных новообразованиях эпителиального происхождения [7]. Статус гена HER2/neu (ErbB2) является одним из основных показателей, используемых для идентификации подтипов опухолей молочной железы, прогноза заболевания и выбора методов лечения пациентов. Таким образом, взаимосвязь между сверхэкспрессией и/или амплификацией ErbB2 и плохим клиническим прогнозом дает основание рассматривать ErbB2 как важное звено в молекулярно-биологической классификации рака молочной железы, а также как важную терапевтическую мишень. В настоящее время имеются препараты, действие которых направлено на ErbB2. Прорыв в противоопухолевой терапии произошел благодаря появлению препарата Герцептин (трастузумаб), представляющего собой гуманизированное антитело к внеклеточному домену ErbB2 [8–10], которое подавляет пролиферацию опухолевых клеток. Эффективность трастузумаба в случае монотерапии ранее леченных больных метастатическим ErbB2-положительным раком молочной железы составляет 26–35%, а больных, не получавших ранее терапии по поводу диссеминации процесса – 12–15% [11]. В настоящее время трастузумаб в комбинации с химиотерапией считается основным препаратом при ErbB2-положительном раке молочной железы [12]. Однако в ряде случаев наблюдается резистентность к этому препарату. Поэтому поиск новых путей терапии ErbB2-позитивных опухолей остается важным направлением исследований.

Интерферон-β человека (ИФНβ) – иммуномодуляторный цитокин, обладающий антивирусной, антипролиферативной, проапоптотической и антиангиогенной активностью. Эффективность антипролиферативного и апоптотического действия интерферонов варьирует в зависимости от типа опухолевых клеток, однако ИФНβ считается более эффективным, чем ИФНα и ИФНγ, например, в случае ингибирования гепатоклеточной карциномы [13], глиомы [14], опухолей поджелудочной [15] и молочной железы [12, 16]. ИФНβ стимулирует остановку опухолевых клеток в фазах S-G2-M клеточного цикла, а также стимулирует в них апоптоз [15]. Кроме того, в экспериментальных исследованиях показано, что ИФНβ индуцирует экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости класса I (МНС-I), что рассматривается как один из универсальных механизмов усиления противоопухолевого ответа за счет Т-клеточной цитотоксичности [17]. Подробно механизм действия интерферонов типа I (ИФНα и ИФНβ), а также современные представления о применении интерферонов в терапии рака рассмотрены в обзоре [18].

Потенциально перспективная и привлекательная цитокиновая терапия направлена на активацию клеток иммунной системы для борьбы с опухолями, однако ее применение сдерживается возникновением побочных эффектов, тяжесть которых варьирует в зависимости от дозы и типа цитокина. В настоящее время изучают возможность уменьшения системного действия ИФНβ при его применении в терапии опухолей. В большинстве этих исследований используют вирусные векторы, несущие ген ИФНβ. В ряде работ показано, что интерфероны типа I, конъюгированные с моноклональными антителами к белкам, ассоциированным с опухолевыми клетками, могут индуцировать антипролиферативный эффект, вызванный как конъюгированным интерфероном, так и антителами [19–23]. Би- и мультиспецифические производные антител можно рассматривать как следующее и очень многообещающее поколение биологических препаратов для направленной терапии рака. Общая концепция таких антител представляет собой объединение двух рекомбинантных антител с различными специфичностями, т.е. реагирующими, по меньшей мере, с двумя антигенами или эпитопами.

Мы планируем создать иммуноцитокиновый комплекс, в котором одна из частей биспецифического антитела должна связывать ИФНβ и нейтрализовать его действие, вторая должна быть способна связывать рецептор ErbB2 на поверхности опухолевой клетки. Предполагается, что в местах локализации опухоли и метастатических узлов будет достигнуто локальное накопление ИФНβ, что приведет к отсутствию нежелательных системных реакций, обуславливающих клиническую картину побочных эффектов, характерных для ИФНβ как монопрепарата.

Цель нашей работы состояла в создании на основе полученных ранее рекомбинантных химерных нейтрализующих мАТ к ИФНβ [24] и антитела к ErbB2 биспецифических полноразмерных антител как компонента иммуноцитокинового комплекса с ИФНβ, предназначенного для терапии ErbB2-позитивных опухолей, а также изучение их биохимических и иммунохимических свойств.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали линию клеток аденокарциномы яичников человека SKOV3-ErbB2 (ATCC^® HTB-77^™), экспрессирующую ErbB2; линию клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ29 (ATCC^® HTB-38^™) с низким уровнем экспрессии или не экспрессирующую ErbB2с и линию клеток аденокарциномы яичников человека SKOV3, утратившую сверхэкспрессию ErbB2.

Использовали фармацевтическую субстанцию глико­зили­рован­ного ИФНβ 1a производства ООО «Фармапарк»; аптечный препарат ИФНβ 1b «Бетаферон»; нитроцеллюлозную мембрану (нитроцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор 0.45 мкм, S045A330R), Advantec MFS, Inc., США; мембрану Vivaflow 200, Sartorius Stedim Biotech, Германия; 96-луночные планшеты с высокой связывающей способностью (Corning-Costar, Нидерланды); Tвин 20.

 

Получение нуклеотидных последовательностей, кодирующих L- и Н-цепи антитела к ErbB2b человека с мутациями knob* и hole

Нуклеотидные последовательности, кодирующие VL- и VH-антитела к ErbB2, синтезированы химико-ферментативным путем из перекрывающихся олигонуклеотидов на основе аминокислотных последовательностей антитела трастузумаб [25] с учетом оптимизации частоты встречаемости кодонов в геноме китайского хомячка. На 5’-концы последовательностей VL- и VH-антител поместили последовательность Козак и последовательности лидерных пептидов для секреции антител в культуральную жидкость. Также для последующей состыковки последовательностей VL- и каппа-домена, VH- и константных доменов C_H1–C_H3 на 3’-конец последовательностей V-доменов вводили участки, комплементарные 5’-части константных доменов. VH- и VL-последовательности объединяли с помощью SOE-PCR. Мутации knob-type* и hole-type вводили в CH3-домен Н-цепи с использованием мутагенизирующих праймеров.

 

Получение последовательностей, кодирующих L- и H-цепи антитела В16, нейтрализующего ИФНβ, с кроссовером

Для получения генов антител с кроссоверами в последовательности VL- и VH-антител с помощью ПЦР вводили дополнительные последовательности. Дизайн праймеров планировали исходя из VL- и VH-последовательностей. Для получения гена L-цепи, содержащего кроссовер, на 5’-конец последовательности VL-цепи вводили «локтевой» участок и небольшой фрагмент последовательности H-цепи, содержащий сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции Bsp120I. После этого в последовательность VH-цепи антитела В16 с помощью ПЦР вводили участок, перекрывающийся с последовательностью константного домена L-цепи каппа. Последовательность каппа-домена состыковывали с модифицированными VH-доменами с помощью SOE-PCR.

Для получения гена Н-цепи, содержащего кроссовер, на 3’-конец последовательности VL-цепи вводили последовательность, содержащую часть последовательности С_Н1-домена H-цепи, а также сайт рестрикции Bsp120I. После чего полученные последовательности клонировали по сайтам рестрикции NheI и Bsp120I в экспрессионный вектор, который получали рестрикцией по сайтам NheI и Bsp120I плазмиды, содержащей ген H-цепи антитела к ErbB2 с мутацией knob-type*.

 

Конструирование бицистронных экспрессионных плазмид, содержащих гены антитела B16 с кроссовером и мутациями KiH-star

Бицистронные экспрессионные векторы получали путем лигирования в плазмиды, содержащие ген L-цепи, последовательность IRES-элемента и гена H-цепи. Такой вектор получали для каждой составляющей биспецифического антитела. Последовательность IRES-элемента, фланкированную сайтами рестрикции BamHI и NheI, после обработки рестриктазами BamHI и NheI и выделения фрагмента размером 630 п.н. из 1% агарозного геля, лигировали с векторной частью, содержащей ген L-цепи антител с кроссовером (BamHI–XhoI) и фрагментом, содержащим ген H-цепи c кроссовером и мутациями knob-type*.

 

Получение экспериментальных образцов биспецифических антител

Для наработки тест-образца антител использовали метод транзиентной экспрессии. За 24 ч до трансфекции CHO-клетки пересевали в концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл в колбу Эрленмейера, содержащую 30 мл культуральной среды CD OptiCHO (Invitrogen, США), дополненную 8 мМ L-глутамина (Invitrogen), 0.1% Pluronic F68 (Gibco, США). Трансфекцию клеток проводили с использованием липофектамина (Invitrogen) согласно рекомендациям производителя и пар бицистронных векторов, содержащих гены L- и H-цепей антитела Tz и антитела В16. Для трансфекции использовали 18 мкг ДНК и 15 мкл трансфектагента FreeStyle MAX (Invitrogen). Культивирование продолжали в течение 10–14 сут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 8% CO₂, при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере ELMI S3.20L со скоростью 130 об/мин до снижения количества живых клеток в культуре до уровня 0.3 × 10⁶ клеток/мл. Для получения необходимых количеств белка трансфекцию выполняли в шести колбах для каждой из пар плазмид. После завершения культивирования клетки осаждали центрифугированием при скорости вращения 1200 об/мин в течение 10 мин, затем супернатант, содержащий антитела, центрифугировали в течение 15 мин при скорости вращения 4000 об/мин, раствор антител стерилизовали фильтрованием через мембрану с размером пор 0.22 мкм. До выделения антител супернатант хранили при 4°С.

 

Выделение БсАт с помощью аффинной хроматографии

Образцы культуральной жидкости диализовали против PBS и концентрировали для дальнейшей очистки на хроматографической колонке MabSelect SuRe LX Protein A Resin (GE Healthcare) объемом 5 мл. Антитела выделяли по протоколу, предложенному производителем. После очистки на аффинной колонке и при необходимости концентрирования образца проводили гель-фильтрационное хроматографирование в аналитическом режиме на носителе Superdex 200-10/300 GL для того, чтобы установить наличие и соотношение мономерных и олигомерных форм антител. Концентрацию целевых белков определяли спектрофотометрически с использованием NanoPhotometer P300 (IMPLEN, Германия).

 

Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА)

Способность полученных белков взаимодействовать с ИФНβ или рекомбинантным внеклеточным доменом ErbB2 определяли с использованием непрямого ИФА. Антигены в буфере PBS (0.5 мкг/мл) сорбировали на планшет, блокировали 5% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и промывали. Затем добавляли исследуемые белки, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали раствором 0.05% Tвин 20 в PBS. После промывки добавляли конъюгат моноклонального антитела 4G7 к каппа-домену легкой цепи Ig человека (ООО «Биалекса», Россия) с пероксидазой хрена в разведении 1 : 75000, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали раствором 0.05% Tвин 20 в PBS и добавляли проявляющий субстрат (тетраметилбензидин). После развития окраски реакцию останавливали, добавляя 10% серной кислоты. Измеряли оптическое поглощение при 450 нм.

Иммуноблотинг интерферона-β человека, гликозилированного и негликозилированного, с использованием биспецифических антител

 

После электрофоретического разделения препаратов ИФНβ в 15% ПААГ в невосстанавливающих условиях осуществляли электроблотинг белков на нитроцеллюлозную мембрану (размер пор 0.45 мкм, Advantec MFS, Inc., США). Перенесенные белки выявляли с помощью непрямого ИФА (иммуноблотинг) после блокировки 5% казеином в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере и отмывки PBS-T (10 мM K₂HPO₄, pH 7.5, 0.145 M NaCl, 0.05% Tвин 20). Мембрану разрезали на полоски и помещали в растворы антител (5 мкг/мл), инкубировали в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. После трехкратной промывки инкубировали с антивидовым пероксидазным конъюгатом мАТ 4G7 против каппа-цепи Ig человека в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. После повторной трехкратной промывки в PBS-T и окончательной однократной промывки в PBS добавляли субстрат (3,3-диаминобензидин, 4-хлор-1-нафтол и пероксид водорода), инкубировали в течение 10 мин и останавливали реакцию, промывая полоски водой.

 

Непрямой ИФА с использованием клеточных лизатов

Для приготовления лизатов культуральные флаконы или чашки Петри помещали на лед, промывали 1 раз холодным PBS, затем снимали клетки при помощи культурального скребка. Клеточный осадок дважды промывали холодным PBS, центрифугируя со скоростью 2000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Клеточный осадок лизировали буфером RIPA с добавлением ингибиторов протеаз 1 мM PMSF и 1 мM апротинина. Состав буфера RIPA: 20 мM Tрис-HCl (pH 7.5), 150 мM NaCl, 1 мM Na₂EDTA, 1 мM EGTA, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 2.5 мM пирофосфат натрия, 1 мM β-глицерофосфат, 1 мM Na₃VO₄, 1 мкг/мл леупептина. Осадок обрабатывали ультразвуком для наиболее полной экстракции мембранных белков, затем центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин и температуре 4°С. Супернатанты отбирали, измеряли в них концентрацию белка, аликвоты супернатантов хранили при -20°С. Для проведения ИФА использовали процедуру, описанную выше, с некоторыми вариациями. Клеточные лизаты сорбировали на планшет в концентрации 10 мкг/мл в PBS (0.01 М КН₂РО₄, 0.1 М NaCl), pH 7.2–7.4 по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для ИФА в течение ночи при 4°C. Планшет трижды отмывали PBS-Т (0.1% Твин 20) по 200 мкл в лунку. Образцы БсАт титровали от 800 нг/мл с шагом 2 в PBS–АТ (0.01 М КН₂РО₄, 0.1 М NaCl, 0.2% BSA, 0.1% Твин 20). Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Отмывки, реакцию с конъюгатом, проявление и измерение оптического поглощения проводили как описано выше. В качестве положительного контроля использовали антитело трастузумаб (Герцептин) в концентрации 10 мкг/мл.

 

Определение одновременного связывания интерферона-β и ErbB2 методом сэндвич-ИФА

Биспецифический характер связывания полученного антитела подтверждали с помощью сэндвич-ИФА в двух вариантах. В первом варианте на твердую фазу сорбировали ИФНβ (1 мкг/мл) в количестве 100 мкл/лунку, затем после блокировки инкубировали с БсАт (1 мкг/мл) в 3-кратных серийных разведениях. После отмывки несвязавшихся антител добавляли биотинилированный рекомбинантный ErbB2 (200 нг/мл) и конъюгат авидин-пероксидаза хрена (150 нг/мл). Во втором варианте на твердую фазу сорбировали рекомбинантный внеклеточный домен ErbB2 (200 нг/мл), затем БсАт (также в серийных разведениях), биотинилированный ИФНβ (250 нг/мл) и конъюгат авидин-пероксидаза хрена (150 нг/мл). В качестве контроля использовали полноразмерное антитело В16 к ИФНβ, моноспецифичные антитела к ErbB2: аптечный препарат Герцептин и полученное нами рекомбинантное антитело трастузумаб (аналог Герцептина).

 

Определение нейтрализующей активности БсАт

Для анализа использовали клеточную линию аденокарциномы толстой кишки НТ29 человека, не экспрессирующую ErbB2. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МПК) выделяли из цельной крови здорового донора в градиенте фиколла-1077 по методике [26]. Готовили серийные разведения БсАт, а также контрольных антител: мышиного антитела В16, химерного и гуманизированного антител на основе В16, нейтрализующих ИФНβ (положительный контроль). К антителам добавляли рекомбинантный гликозилированный ИФНβ производства ООО «Фармапарк» в концентрации 3 нг/мл. Все растворы готовили в полной ростовой среде с 2% сывороткой крупного рогатого скота. Опухолевые клетки культивировали в течение 5 сут в смеси с МПК в присутствии ИФНβ и антител в различных концентрациях. Конечные концентрации активных веществ и клеток составили: антитела – от 0 до 100 мкг/мл; ИФНβ – 1 нг/мл (0 в контрольных лунках); МПК – 50×10³ клеток/лунку; опухоли: 3000 клеток/лунку. Количество живых клеток оценивали в тесте МТТ [27]. Каждое измерение проводили в четырех повторах.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование биспецифических антител и их экспрессия

При совместной экспрессии двух разных генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (H₁ и H₂) могут образовываться три вида димеров тяжелых цепей: H₁–H₁, H₂–H₂ и H₁–H₂. При этом H₁–H₁ и H₂–H₂ являются частью моноспецифических антител, а H₁–H₂ – биспецифических. При одинаковой эффективности образования димеров максимально возможный выход БсАт составляет 50% от всего количества продуцируемых иммуноглобулинов. Для увеличения продукции БсАт можно ввести мутации, увеличивающие свободную энергию образования моноспецифических антител. Такой подход делает энергетически более выгодным образование БсАт, что должно привести к увеличению продукции БсАт по сравнению с моноспецифическими антителами. Одним из возможных подходов является создание мутаций, известных как knob-into-hole [28]. При таком подходе в CH3-домен H-цепи одного антитела вводят мутацию T366W, а в CH3-домен H-цепи другого антитела – мутации T366S, L3638A, Y407V. Мутация T366W приводит к появлению большого гидрофобного основания на поверхности интерфейса образования димера CH3-доменов Н-цепей. Эта мутация в дальнейшем будет обозначаться как knob-type. Мутации T366S, L3638A, Y407V приводят к образованию стерически комплементарного для Т366W углубления (hole-type). Для облегчения очистки БсАт с помощью аффинной хроматографии в CH3-домен H-цепи, содержащей мутации knob-type, вводят мутации H457R, Y458F. Такие мутации изменяют константу образования комплекса антитела с белком А стафилококка, что делает возможным разделение смеси биспецифического и моноспецифических антител при элюции буфером с градиентом pH с аффинного носителя [29]. В дальнейшем мутации H457R, Y458F будут обозначаться как «star», либо «*».

Для того чтобы предотвратить неправильное спаривание L- и H-цепей, относящихся к разным антителам, Schaefer W. и соавт. [30] предложено элегантное решение, названное «кроссовером» вариабельных доменов антител. VL-домен антитела присоединяется к СН1-домену Н-цепи, а VH-домен – к каппа-домену L-цепи в так называемом «локтевом» участке (рис. 1). Более подробно аминокислотные последовательности в участке, соответствующем кроссоверу, описаны в [30].

 

Рис. 1. Схематическое изображение кроссовера аминокислотных последовательностей вариабельных доменов H- и L-цепей антитела («локтевой» участок) [30]

 

В нашей работе кроссовер спланирован для части БсАт, соответствующей антителу В16, нейтрализующему ИФНβ. Мутации типа hole поместили в Н-цепь, соответствующую антителу к ErbB2, мутации типа knob* находятся в Н-цепи антитела В16. Это делает возможным преимущественное связывание Н-цепей в виде пар knob-hole, тем самым обеспечивая образование биспецифического антитела. Схематически структура биспецифического антитела с кроссовером вариабельных доменов, мутациями в СН3-домене Н-цепи knob*-hole и мутациями, уменьшающими связывание с белок-А-сефарозой, представлена на рис. 2.

 

Рис. 2. Структура биспецифического антитела с кроссовером вариабельных доменов в части, относящейся к связыванию с ИФНβ, c мутациями knob-hole и мутациями, уменьшающими связывание с белком А Staphylococcus aureus

 

Для одновременного получения четырех цепей – L и H антитела к ErbB2 и L и H к ИФНβ – использовали бицистронные векторы, в которых гены тяжелой и легкой цепей каждого антитела экспрессировались под контролем одного промотора. В качестве экспрессионного вектора для получения БсАт в клетках эукариот была выбрана плазмида pcDNA3.4 Poly40 (собственная модификация вектора pcDNA3.4 Invitrogen со встроенным полилинкером). Эта плазмида имеет среднеранний цитомегаловирусный промотор-энхансер для обеспечения биосинтеза целевого белка. Исходя из результатов наших предшествующих исследований, после промотора сначала был помещен ген L-цепи антитела, затем после регуляторного элемента IRES ген Н-цепи. В качестве регуляторного элемента для обеспечения экспрессии гена Н-цепи антитела использован внутренний сайт посадки рибосом IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV)  (рис. 3).

 

Рис. 3. Схема бицистронного вектора для экспрессии БсАт. pCMV – промотор цитомегаловируса; VH и VL – гены вариабельных доменов антител; CH1–CH3 – последовательности, кодирующие константные домены Н-цепи антитела; IRES – участок внутренней посадки рибосомы; WPRE – последовательность регуляторного элемента; Tkterm – сигнальная последовательность полиаденилирования мРНК тимидинкиназы вируса простого герпеса

 

Получены два таких вектора, в одном из которых клонированы последовательности, кодирующие L-цепь и H-цепь с мутациями типа hole антитела трастузумаб, в другом – L-цепь и H-цепь с мутациями типа knob* антитела к ИФНβ-1а человека в формате кроссовер. Для облегчения очистки биспецифического антитела с помощью аффинной хроматографии в кодирующую последовательность CH3-домена гена H-цепи, содержащей мутации knob-type, вводили мутации H457R, Y458F. Сочетания двух векторов использовали для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, что позволяет получить биспецифические антитела к двум разным антигенам.

Антитела нарабатывали с использованием системы транзиентной экспрессии. Транзиентная система экспрессии в CHO-клетках позволяет получать за короткий промежуток времени рекомбинантные антитела в количестве, достаточном для иммунохимического анализа, определения аффинности и изучения нейтрализующей активности. При этом белки имеют правильную пространственную укладку и правильно гликозилированы. После очистки на аффинной колонке с белок-A-сефарозой проводили гель-фильтрацию в аналитическом режиме на носителе Superdex 200-10/300 GL, чтобы выявить антитела и определить соотношение их мономерных и олигомерных форм. С помощью аналитической ВЭЖХ показано, что введение второй хроматографической стадии позволяет повысить уровень чистоты препаратов рекомбинантных антител до 96–98% и провести очистку от агрегатных форм рекомбинантных антител (рис. 4А).

Чистоту и гомогенность БсАт подтверждали с помощью электрофореза по Лэммли [31] в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с последующей денситометрией электрофореграммы (рис. 4Б). По результатам денситометрии чистота БсАт составила 97.8 ± 1.0%.

 

Рис. 4. Хроматограмма БсАт В16 формата CrossMab (А). Электрофореграмма БсАт В16 в 12% SDS-ПААГ (Б): 1 – в невосстанавливающих условиях, 4 – в восстанавливающих условиях, 2, 3 – стандарты молекулярных масс: 2 – 200.0, 150.0, 120.0, 100.0, 85.0, 70.0, 60.0, 50.0, 40.0, 30.0, 25.0, 14.4 кДа; 3 – 116.0, 66.2, 45.0, 35.0, 25.0, 14.4 кДа

 

Исследование БсАт иммунохимическими методами

Связывание БсАт с ИФНβ. Связывание БсАт с гликозилированной и негликозилированной формами ИФНβ тестировали методом непрямого ИФА. Установлено, что как гликозилированная (ИФНβ-1а), так и негликозилированная (ИФНβ-1б) формы ИФНβ, сорбированного на твердой фазе, связываются с БсАт  (рис. 5). Характер связывания БсАт с ИФНβ оказался сходным с характером связывания мышиного антитела В16, прототипного для получения БсАт.

 

Рис. 5. Связывание биспецифических (А) и прототипных моноклональных мышиных антител (Б) с гликозилированным (ИФНβ-1а) и негликозилированным (ИФНβ-1б) ИФНβ. Герцептин – аптечный препарат, антитело к ErbB2 (отрицательный контроль)

 

Связывание БсАт с ИФНβ было проверено также методом иммуноблотинга (вестерн-блотинга). Этот метод позволяет визуализовать иммунные комплексы антиген–антитело после электрофоретического разделения препарата антигена в денатурирующих условиях с последующим переносом на мембрану. Главное отличие иммуноблотинга от непрямого ИФА заключается в возможности дискриминировать иммунные комплексы с различной молекулярной массой, например, мономерные и олигомерные формы антигена, а также интактный антиген и продукты его деградации. На первом этапе иммуноблотинга проводили электрофоретическое разделение препаратов ИФНβ в 15% SDS-ПААГ в невосстанавливающих условиях. Ранее было показано, что в восстанавливающих условиях ИФНβ теряет способность связываться с антителами (данные не приведены), поэтому иммуноблотинг в восстанавливающих условиях не проводили. Методом иммуноблотинга подтверждена специфичность анализируемых БсАт, показанная методом непрямого ИФА, – образцы антител взаимодействуют с препаратами гликозилированного ИФНβ («Фармапарк») и негликозилированного ИФНβ («Бетаферон») и окрашивают полосы, соответствующие молекулярным массам 18.5 кДа (негликозилированный ИФНβ) и 20–22 кДа (гликозилированный ИФНβ)  (рис. 6).

 

Рис. 6. Иммуноблот ИФНβ-1б (негликозилированного) «Бетаферон» (А) и ИФНβ-1а (гликозилированного) «Фармапарк» (Б) с БсАт в невосстанавливающих условиях после 15% SDS-ПААГ. Дорожки: 1 – БсАт В16/1, 2 – БсАт В16/2, 3 – Герцептин, 4 – отрицательный контроль (гуманизированные антитела против шига-токсина), 5 – контроль антивидового пероксидазного конъюгата антитела 4G7 к каппа-цепи Ig человека, 6 – трастузумаб, 7 – стандарты молекулярных масс

 

Связывание БсАт с ErbB2. Полученные БсАт должны обладать реактивностью не только по отношению к ИФНβ, но и к поверхностной молекуле опухолевых клеток – ErbB2. Связывание БсАт с ErbB2 исследовали методом непрямого ИФА с использованием клеточных лизатов. В качестве положительного контроля использовали аптечный препарат трастузумаб – Герцептин. ИФА проводили на лизатах линий опухолевых клеток как экспрессирующих, так и не экспрессирующих ErbB2 (рис. 7А,Б). Уровень экспрессии ErbB2 оценивали методом непрямого ИФА с использованием клеточных лизатов и препарата Герцептин (данные не приведены). Точка перегиба (ЕС₅₀) кривой титрования антитела Герцептин на ErbB2-экспрессирующей линии SKOV3 составила 15 нг/мл и более 3000 нг/мл на ErbB2-негативной линии SKOV3.

Биспецифические антитела взаимодействовали с клеточными лизатами ErbB2-позитивной линии SKOV3 (рис. 7А) и не взаимодействовали с лизатами клеток SKOV3 со слабой экспрессией HER2 (рис. 7Б). Также связывание БсАт с ErbB2 показано методом ИФА с сорбцией на твердую фазу рекомбинантного внеклеточного домена ErbB2, полученного в нашей лаборатории, по сравнению с аптечным препаратом Герцептин, специфичным к данному рецептору. Характер связывания БсАт в формате CrossMab с рецептором оказался таким же, как при связывании антитела Герцептин (рис. 7В).

 

Рис. 7. Кривые титрования БсАт В16 и контрольного антитела Герцептин на лизатах HER2-сверхэкспрессирующей линии SKOV3 (А), HER2-слабоэкспрессирующей линии SKOV3 (Б), на рекомбинантном внеклеточном домене ErbB2-рецептора (В)

 

Определение одновременного связывания интерферона-β и рецептора ErbB2 методом сэндвич-ИФА

Биспецифический характер связывания полученного антитела подтверждали с помощью сэндвич-ИФА в двух вариантах  (рис. 8). В первом варианте на твердую фазу сорбировали ИФНβ (антиген 1), затем после блокировки инкубировали с БсАт в серийных разведениях. После отмывки несвязавшихся антител добавляли биотинилированный рекомбинантный ErbB2 (антиген 2) и конъюгат авидин-пероксидаза хрена. Во втором варианте на твердую фазу сорбировали рекомбинантный ErbB2 (антиген 1), затем БсАт также в серийных разведениях, биотинилированный ИФНβ (антиген 2) и конъюгат авидин-пероксидаза хрена. В качестве контроля использовали моноспецифичные антитела: химерное нейтрализующее антитело В16 к ИФНβ и антитела к ErbB2 – аптечный препарат Герцептин и полученное нами рекомбинантное антитело трастузумаб (аналог Герцептина). В случае моноспецифичных антител сигнал ИФА не наблюдался. Биспецифичное антитело связывалось с ИФНβ и ErbB2 в обоих вариантах  (рис. 9).

 

Рис. 8. Схема проведения сэндвич-ИФА для исследования одновременного связывания БсАт с ИФНβ и ErbB2-рецептором

Рис. 9. Кривые титрования БсАт в сэндвич-ИФА по сравнению с прототипным химерным моноспецифичным антителом В16 против ИФНβ и моноспецифичными антителами против ErbB2-рецептора. CrossMabB16 – полноразмерное биспецифическое антитело против ErbB2-рецептора и ИФНβ

 

Биспецифичный характер полученных БсАт подтвержден результатами сэндвич-ИФА.

Интерферон-β-нейтрализующая активность биспецифических антител

Биологическую активность образцов БсАт оценивали в опытах по нейтрализации антипролиферативного действия ИФНβ. Биспецифические антитела, используемые в качестве средства доставки ИФНβ к опухолевым клеткам, должны обладать нейтрализующими свойствами по отношению к цитокину, чтобы избежать развития нежелательных системных реакций во время транспортировки. Предполагается, что присоединение иммуноцитокинового комплекса к клеткам опухоли приведет к высвобождению ИФНβ и началу его антипролиферативного действия в дополнение к действию антитела к ErbB2. Способность антитела нейтрализовать ИФНβ оценивали с использованием клеточной модели, не содержащей ErbB2. Из-за влияния антипролиферативной активности части БсАт, ответственной за связывание с ErbB2, не представлялось возможным проанализировать антипролиферативную активность ИФНβ другим методом. Эксперименты проводили на линии аденокарциномы кишечника НТ29, наиболее чувствительной, согласно предварительным экспериментам, к антипролиферативному действию ИФНβ (результаты не приведены). К серийным разведениям БсАт, а также контрольных антител: мышиного антитела В16, нейтрализующего ИФНβ, химерного и гуманизированного антител на основе В16 в качестве положительного контроля, добавляли рекомбинантный гликозилированный ИФНβ. Опухолевые клетки культивировали в смеси с МПК в присутствии ИФНβ и антител в различных концентрациях. Культивирование проводили в течение 5 сут. Количество живых клеток оценивали в тесте МТТ [27]. Нейтрализующую активность антител выражали в процентах от скорости пролиферации клеток без ИФНβ и вычисляли по формуле:

% нейтрализации = (A_i – A₀) / (A₁₀₀ – A₀) × 100%,

где A_i – среднее значение оптической плотности в лунках с i-й концентрацией антитела, A₀ – среднее значение оптической плотности в лунках с ИФНβ без антител, A₁₀₀ – среднее значение оптической плотности в лунках без ИФНβ и антител.

По результатам анализа  (рис. 10)) определен показатель нейтрализации IС₅₀ для БсАт В16 – 50 мкг/мл, что в 2.5 раза выше, чем для прототипного антитела В16 мыши. Это может быть объяснено тем, что БсАт содержит только один интерферонсвязывающий сайт, тогда как мышиное антитело – два. Кроме того, у БсАт В16 отсутствует эффект кооперативности связывания, так что его нейтрализующая активность соответствует теоретически предполагаемой.

 

Рис. 10. Нейтрализация антипролиферативного действия интерферона-β биспецифическими антителами в формате CrossMab по сравнению с прототипными мышиными антителами В16, химерными (В16chim) и гуманизированными (В16hum) антителами

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе нейтрализующего антитела В16 к ИФНβ и антитела трастузумаб (Tz), специфичного к ErbB2, нами получены биспецифические антитела в формате CrossMab с мутациями knob и hole в CH3-домене Н-цепей. Показано, что эти белки связывают и нейтрализуют ИФНβ, а также ErbB2 в лизатах опухолевых клеток и в виде рекомбинантного внеклеточного домена. Такие молекулы могут использоваться в качестве компонента иммуноцитокинового комплекса для доставки ИФНβ к клеткам ErbB2-ассоциированных опухолей, что позволит избежать побочных эффектов, вызванных введением ИФНβ в виде монопрепарата. Планируется проверить такой подход к терапии ErbB2-ассоциированных опухолей на моделях животных.

Об авторах

А. А. Панина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

В. С. Рыбченко

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

О. Н. Солопова

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения; Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

Д. С. Балабашин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

С. А. Якимов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

Т. К. Алиев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

Д. А. Долгих

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

П. Г. Свешников

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

М. П. Кирпичников

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: paniann07@yandex.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы