Разнообразие и функции топоизомераз типа II

Полный текст

ТОПОЛОГИЯ ДНК

Для описания топологического состояния ДНК и уровня ее суперспирализации используют понятие «порядок зацепления» (от англ. linking number – Lk) [1]. Если представить одну из цепей ковалентно замкнутой кольцевой молекулы ДНК в качестве границы воображаемой поверхности, то порядок зацепления цепей ДНК будет равен числу пересечений этой поверхности второй цепью ДНК с учетом знака этого пересечения (рис. 1А). Lk не зависит от деформаций молекулы и может быть изменен только путем разрыва, переноса и религирования цепей ДНК (рис. 1А) [2]. Характеристикой релаксированной молекулы ДНК является теоретический порядок зацепления (Lk⁰), равный отношению длины молекулы в нуклеотидах (N) к периоду ДНК (h = 10.5 нт/виток для канонической B-формы ДНК) (1). Lk молекул ДНК, выделенных из живых организмов, отличается от Lk⁰ – он может как превышать Lk⁰ (ΔLk > 0, тогда говорят о положительной суперспирализации молекулы), так и быть меньше Lk⁰ (ΔLk < 0, отрицательно суперспирализованные молекулы) (2). Lk складывается из двух геометрических характеристик двойной спирали, называемых твист (от англ. twist – Tw) и райзинг (от англ. writhe – Wr) (3). Твист определяется как количество витков, которые совершают цепи ДНК вокруг друг друга вдоль оси двойной спирали, тогда как райзинг является мерой спирализации оси молекулы ДНК [3]. При изменении Lk относительно Lk⁰ суперспирализация распределяется между изменениями твиста и райзинга (4), которые могут переходить друг в друга. Например, согласно данным электронной микроскопии плазмид, 75% суперспирализации ДНК приходится на райзинг и 25% – на изменение твиста [3]. В природе суперспирализация ДНК в форме райзингa стабильно существует в двух формах – плектонемы (образование двойной спирали более высокого порядка) и соленоида (одинарной спирали более высокого порядка, характерной, например, для ДНК, обернутой вокруг белка) (рис. 1Б) [3]. Более подробное и всеобъемлющее обсуждение топологии ДНК можно найти, например, в книге “DNA Topology”, Bates & Maxwell, 2005 [3].

Рис. 1. Топология ДНК. Порядок зацепления кольцевой молекулы ДНК и его изменение в результате расщепления и переноса цепи (А) и пространственные структуры, возникающие в результате суперспирализации ДНК – плектонема и соленоид (Б)

СТРОЕНИЕ, ЭВОЛЮЦИЯ И КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ТОПОИЗОМЕРАЗ ТИПА II

Регуляцией уровня суперспирализации ДНК и разрешением узлов и катенанов занимаются специальные ферменты – топоизомеразы [4, 5]. На основе строения, гомологии и каталитического механизма топоизомеразы принято делить на два типа – I и II [4]. Топоизомеразы I вносят одноцепочечный разрыв в ДНК (ник) и либо за счет вращения дуплекса ДНК вокруг второй целой цепи (класс IB, меняют Lk молекулы на произвольное целое число за один акт катализа), либо переносом целой цепи сквозь ник (класс IA, меняют Lk на ±1) манипулируют суперспирализацией молекулы. Топоизомеразы II разрезают обе цепи в фрагменте ДНК, называемом G-сегментом, и переносят через этот разрыв второй дуплекс – T-сегмент ДНК, гидролизуя при этом две молекулы АТР (рис. 3) [6–8]. Эта операция топологически эквивалентна изменению Lk на ±2 [9]. Ниже мы проанализируем разнообразие, механизмы и физиологическую роль ферментов, относящихся к типу II.

Топоизомеразы II обнаружены у представителей всех доменов жизни и закодированы в подавляющем большинстве секвенированных геномов клеточных организмов за исключением нескольких экстремально редуцированных [10, 11]. Во всех изученных случаях показана необходимость топоизомеразы II для транскрипции, репликации и сегрегации хромосом при делении клетки.

На основе строения и особенностей каталитического цикла топоизомеразы II подразделяют на два класса – IIА и IIВ (рис. 2, 3) [4]. Топоизомеразы могут быть гетеротетрамерами, состоящими из двух B- и двух А-субъединиц, либо гомодимерами, в которых субъединицы B и A объединились в единый полипептид [10]. Субъединицы топоизомераз имеют интерфейсы димеризации, так называемые ворота. Консервативный АТР-гидролизующий GHKL (от англ. Gyrase, Hsp90, Histidine Kinase, MutL) домен [12] образует N-ворота, домены Toprim и WHD (от англ. Topoisomerase/Primase и Winged-helix domain) формируют ДНК-ворота [13]. В этой области фермента связывается G-сегмент ДНК, который расщепляется тирозинами активного центра WHD-доменов [14]. Третий интерфейс димеризации (С-ворота), образованный доменом coiled-coil (CC), есть только у IIA ферментов (рис. 2) [15]. На C-конце А-субъединиц или всего полипептида в случае слитых форм расположен C-концевой домен (CTD, от англ. C-terminal domain), который определяет специфичность топоизомераз к структурам ДНК (супервиткам или перекрестам молекул), взаимодействует с другими белками, и у эукариот является мишенью для посттрансляционных модификаций, за счет которых регулируется активность фермента [16–18].

Считается, что на первом этапе каталитического цикла топоизомераза IIА связывает ДНК в области ДНК-ворот (G-сегмент ДНК) [19]. Связывание вызывает изгибание ДНК, что, вероятно, является механизмом топологического сканирования ДНК ферментом – топоизомераза преимущественно свяжется с суперспирализованной областью молекулы, которая уже изогнута или может быть легко изогнута за счет энергии суперспирализации [20–22]. Затем происходит улавливание T-сегмента ДНК между GHKL-доменами и ДНК-воротами. Связывание двух молекул АТР с АТР-азными центрами приводит к димеризации GHKL-доменов, закрыванию N-ворот и надежному захвату T-сегмента [23]. Гидролиз первой молекулы АТР до АDP запускает механизм расщепления G-сегмента ДНК тирозинами нуклеазных центров WHD-доменов и открывает ДНК-ворота, в результате чего T-сегмент направленно проходит через разрыв и оказывается в полости белка у C-ворот [7, 13, 24, 25]. Для фиксации двухцепочечного разрыва гидроксильные группы тирозинов остаются связанными с 5’-концами ДНК фосфодиэфирными связями. Открытие С-ворот, которое выпускает Т-сегмент из ферментативного комплекса, происходит после закрытия ДНК-ворот и лигирования G-сегмента в результате гидролиза второй молекулы АТР [26]. Высвобождение молекул АDP, которые имеют гораздо меньшую аффинность к активным центрам, приводит к открытию N-ворот и возвращению фермента в исходное состояние [23].

Рис. 2. Строение топоизомераз типа II. Слева – варианты доменной архитектуры ферментов. Гомологичные домены показаны одним цветом. Тирозин каталитического центра WHD-домена, необходимый для расщепления ДНК, отмечен желтым кругом. Справа – положение доменов на схематичной пространственной структуре топоизомераз IIA (на примере ДНК-гиразы) и IIB (на примере Топо VI)

Рис. 3. Каталитические циклы топоизомераз IIA (А) и IIB (Б), и влияние топоизомераз на топологию ДНК (В). На схемах показано связывание сегментов ДНК – G-сегмента (синий) и T-сегмента (зеленый); связывание и гидролиз молекул АТР (АТР красный, АDP зеленый, если состояние связанного нуклеотида неизвестно (АТP/АDP), то он отмечен фиолетовым кружком); расщепление и лигирование G-сегмента и перенос T-сегмента сквозь ферментативный комплекс. В центре каталитических циклов показаны схемы расщепления G-сегмента ДНК под действием топоизомеразы (Y – каталитические тирозины WHD-доменов). Топоизомеразы II способны изменять суперспирализацию ДНК, а также разделять (декатенировать) или сцеплять (катенировать) молекулы ДНК

Считается, что связывание молекул АТР необходимо для направленного переноса Т-сегмента ДНК, поскольку сегмент не может покинуть фермент через N-ворота до тех пор, пока не гидролизованы обе молекулы АТР [24]. Следует отметить, что роль гидролиза АТР в переносе сегмента окончательно не выяснена. Согласно одной из моделей, последовательный гидролиз двух молекул АТР способствует перемещению Т-сегмента за счет конформационных перестроек [27, 28]. По другой модели гидролиз необходим только для «перезапуска» фермента и улавливания нового Т-сегмента [29]. Так, например, при добавлении в реакционную смесь негидролизуемого аналога АТР – ADPNP, топоизомераза способна провести один акт переноса Т-сегмента, после чего фермент остается в неактивном состоянии с закрытыми N-воротами [30]. Согласно недавним исследованиям, проведенным на единичных молекулах ДНК и ДНК-гиразы с использованием магнитных пинцетов, гидролиз АТР важен как для ускорения переноса Т-сегмента, так и для «перезапуска» фермента [7]. Альтернативное объяснение отводит связыванию АТР и вызванной этим событием димеризации GHKL-доменов роль предохранителя, который необходим для стабилизации двух половин ферментативного комплекса и предотвращения формирования двухцепочечных разрывов в ходе катализа за счет случайной диссоциации двух половин фермента [8].

Каталитический механизм топоизомераз IIB считается принципиально сходным с механизмом топоизомераз IIA (рис. 3Б) [31–33]. Но из-за отсутствия С-ворот Т-сегмент после прохождения ДНК-ворот и разрыва G-сегмента сразу покидает ферментативный комплекс [31]. Кроме того, поскольку остатки тирозина WHD-доменов расположены на других элементах вторичной структуры (по сравнению с гомологичными доменами топоизомераз IIA), топоизомеразы IIB при расщеплении G-сегмента ДНК оставляют дву-, а не четырехнуклеотидные липкие 5’-концы, характерные для топоизомераз IIA [34, 35]. Показано, что расщепление G-сегмента зависит от связывания АТР, которое считается необходимым для стабилизации комплекса и временного двухцепочечного разрыва [8, 32].

Эволюционные взаимоотношения внутри групп топоизомераз IIA и IIB и между этими группами остаются предметом дискуссии. Достоверно можно проследить лишь несколько событий, такие, как дупликации гена топоизомеразы IIA у предка бактерий (привела к появлению двух ферментов со специализированными функциями – ДНК-гиразы и Топо IV) и предка позвоночных (появились Top2α и Top2β), горизонтальный перенос генов гиразы из разных групп бактерий в архей Euryarchaeota и обратный перенос генов Топо VI, появление в представителях Archaeplastida бактериальной гиразы, унаследованной ими от хлоропластов при установлении первичного эндосимбиоза [10]. В случае более древних событий консенсус отсутствует.

ТОПОИЗОМЕРАЗЫ БАКТЕРИЙ

Как правило, свободноживущие быстрорастущие бактерии, такие, как Escherichia coli, Caulobacter crescentus и Bacillus subtilis, обладают широким набором топоизомераз, в который входят топоизомеразы I и III (принадлежащие к типу I), а также ДНК-гираза и топоизомераза IV (тип II, класс IIA) [4, 36–38]. Медленно растущие бактерии (например, Mycobacterium tuberculosis) или симбиотические/паразитические бактерии, для которых характерна редукция генома (например, Helicobacter pylori), напротив, часто имеют минимально необходимый набор, состоящий из одной топоизомеразы типа I (топоизомераза I) и одной топоизомеразы типа II (ДНК-гираза) [39, 40]. Более того, обнаружены несколько эндосимбиотических бактерий, например, Hodgkinia cicadicola и Tremblaya princep, геномы которых вовсе не содержат генов топоизомераз II либо в них присутствует ген только одной субъединицы, как у Carsonella rudii [41–43]. Эти организмы имеют крайне редуцированные геномы (139–160 т.п.н.), что обусловлено экстремальным приспособлением к паразитизму и эндосимбиозу.

ДНК-гираза и топоизомераза IV являются мишенями многих антибиотиков, которые по механизму действия можно разделить на две группы – яды и каталитические ингибиторы. Яды стабилизируют промежуточный ковалентный комплекс топоизомеразы с G-сегментом ДНК. В дальнейшем случайная диссоциация субъединиц фермента (например, в результате столкновения комплекса топоизомеразы с реплисомой или РНК-полимеразой) вызывает двухцепочечные разрывы ДНК и, как следствие, приводит к гибели клетки. Каталитические ингибиторы не вызывают разрывов в ДНК, однако подавляют активность ферментов, например, за счет связывания с АТР-азным центром GHKL-домена и конкуренции с АТР [44, 45].

Ядами для топоизомераз являются, например, препараты группы хинолонов и фторхинолонов (ципрофлоксацин, левофлоксацин и др.), часто используемые в клинической практике [44, 46]. С помощью структурных исследований показано, что движение ионов двухвалентных металлов (чаще всего магния) в каталитическом центре топоизомераз необходимо для расщепления и лигирования ДНК. Яды гиразы стабилизируют ион металла в положении, которое способствует расщеплению ДНК, но не лигированию разрыва [47, 48]. Последнее наблюдение позволило объяснить эффекты самых часто возникающих мутаций гиразы, приводящих к антибиотикорезистентности. Оказалось, что консервативные остатки серина и глутамина WHD-домена координируют молекулы воды и ион магния, которые необходимы для связывания фторхинолонов [47]. Замена хотя бы одного из этих остатков на неполярный приводит к устойчивости бактерий [49].

Классическими каталитическими ингибиторами являются вещества класса аминокумаринов (например, новобиоцин и кумермицин А1), которые конкурируют с АТР за взаимодействие с АТР-азным центром [44, 50]. Подавление активности гиразы приводит к ингибированию репликации и транскрипции, остановке деления клеток. Из-за малой растворимости аминокумаринов и токсичности для человека препараты на их основе в настоящее время не используются в клинической практике, однако применяются в ветеринарии [45].

Распространение устойчивости к антибиотикам делает необходимым активный поиск новых антибактериальных препаратов, проводятся также клинические испытания новых классов веществ, среди которых много ингибиторов топоизомераз [45, 51, 52].

ДНК-гираза

ДНК-гиразы бактерий консервативны и обладают схожим набором свойств (рис. 4А). Уникальная особенность ДНК-гиразы – способность вносить отрицательную суперспирализацию с затратой энергии гидролиза АТР, что показано в экспериментах in vitro для ферментов E. coli, B. subtilis, C. crescentus, M. tuberculosis и многих других бактерий. Кроме того, ДНК-гираза эффективно релаксирует положительные супервитки и способна декатенировать кольцевые молекулы ДНК [39, 53–56].

ДНК-гираза незаменима для жизнедеятельности бактерий, гены gyrA и gyrB, кодирующие субъединицы фермента, нельзя удалить, а ингибиторы, снижающие его активность, значительно уменьшают жизнеспособность клеток [57–60]. Ингибирование гиразы вызывает у разных бактерий схожий фенотип – удлиненные клетки, не способные к делению [60, 61].

Считается, что роль гиразы в клетках заключается в поддержании отрицательной суперспирализации генома, что облегчает инициацию транскрипции и репликации, а также в релаксации положительных супервитков перед движущимися полимеразами. Ранние ChIP-chip (иммунопреципитация связанной с белком ДНК с ее последующим анализом на чипе для определения сайтов связывания белка) эксперименты с E. coli выявили положительную корреляцию между связыванием гиразы и уровнем транскрипции генов [65]. В дальнейшем при помощи метода Topo-Seq, позволяющего картировать сайты активности топоизомераз с высокой точностью, было прямо показано, что каталитически активная ДНК-гираза E. coli расположена в концах активных генов и регионах за сайтом терминации транскрипции [66]. Аналогично, результаты ChIP-Seq (иммунопреципитация связанной с белком ДНК с ее последующим секвенированием для определения сайтов связывания белка) экспериментов с гиразой M. tuberculosis свидетельствуют о преимущественном связывании фермента с транскрипционно активными областями [67]. У C. crescentus обнаружен ген gapR, подавление экспрессии которого приводит к ингибированию инициации и элонгации репликации и вызывает повышенную чувствительность клеток к ингибиторам гиразы. In vitro эксперименты показали, что белок GapR предпочтительно связывается с положительно суперспирализованной ДНК и взаимодействует с гиразой, увеличивая ее способность релаксировать положительные супервитки. Возможно, GapR привлекает гиразу к положительным супервиткам, образующимся перед движущимся репликационным комплексом, способствуя их релаксации и стимулируя репликацию [55]. Эксперименты с единичными молекулами показали, что в отсутствие гиразы транскрипция на топологически закрепленных молекулах быстро замедляется и в конце концов останавливается из-за накопления положительной суперспирализации (рис. 4Б). Присоединение же гиразы к такой молекуле приводит к «транскрипционному всплеску» – быстрому восстановлению нормальной скорости транскрипции [68].

Участие гиразы в процессе транскрипции не ограничивается ее способностью релаксировать положительную суперспирализацию перед РНК-полимеразой в процессе элонгации. Показано, что отрицательная суперспирализация, образованная гиразой, может как активировать, так и подавлять инициацию транскрипции генов [69]. Обнаружено, что до половины генов E. coli отвечают изменением уровня транскрипции на релаксацию генома [70, 71]. Онтологический анализ чувствительных к суперспирализации генов E. coli выявил, что продукты генов, отвечающих повышением уровня транскрипции на релаксацию отрицательных супервитков, предпочтительно обеспечивают реакции катаболизма (например, ферменты цикла Кребса), а сами гены расположены ближе к терминатору репликации. В то же время гены, для инициации транскрипции которых необходима отрицательная суперспирализация генома, преимущественно относятся к анаболическим процессам (синтез аминокислот, нуклеотидов) и находятся в области ориджина [71, 72]. Согласно модели, во время активного роста культуры E. coli за счет работы ДНК-гиразы в геноме формируется градиент отрицательной суперспирализации с максимальным уровнем отрицательной суперспирализации в районе ориджина репликации и минимальным – в районе терминаторов репликации. Это приводит к преимущественной экспрессии генов, участвующих в процессе анаболизма, что способствует росту и делению клеток. При истощении питательных веществ в стационарной фазе роста культуры E. coli происходит уменьшение концентрации АТР, что вызывает снижение активности ДНК-гиразы. Это приводит к уменьшению уровня суперспирализации генома и, в совокупности с другими факторами, к инверсии градиента суперспирализации хромосомы бактерии, в результате чего преимущественно экспрессируются гены, участвующие в процессах катаболизма [63]. Таким образом E. coli использует суперспирализацию для глобальной модуляции транскрипции генов при истощении питательных веществ в среде [72–74] (рис. 4В).

Рис. 4. ДНК-гираза и ее функции. Схема структуры комплекса ДНК-гиразы с ДНК (А). Двухдоменная модель (от англ. twin-domain model), иллюстрирующая формирование положительной суперспирализации перед элонгирующей РНК-полимеразой и отрицательной суперспирализации – позади нее [62]. Положительная и отрицательная суперспирализации, образованные при транскрипции, диффундируют по молекуле ДНК и влияют на инициацию транскрипции с близкорасположенных промоторов (показаны в виде стрелок). В зависимости от промотора эффекты могут быть как активирующими, так и ингибирующими. ДНК-гираза способствует элонгации транскрипции, релаксируя положительные супервитки перед РНК-полимеразой (Б). Предполагается, что изменения суперспирализации генома, происходящие при переходе их экспоненциальной фазы роста культуры E. coli в стационарную фазу роста, способствуют переключению физиологического состояния клетки от преимущественно анаболитического метаболизма к катаболизму [63]. OriC – ориджин репликации бактериальной хромосомы, dif – сайт, распознающийся рекомбиназами XerC/XerD (В). Циркадные колебания суперспирализации генома цианобактерии S. elongatus (внизу) коррелируют с изменениями профиля транскрипции генов (вверху). Резкое падение суперспирализации генома, вызванное ингибитором ДНК-гиразы новобиоцином (показано оранжевой кривой), приводит к быстрому изменению транскрипционного профиля (2), делая его схожим с профилем бактерий, находящихся в фазе релаксации генома (1) [64] (Г). ДНК-гираза необходима для пространственной организации ДНК профага бактериофага Mu и его транспозиции. ДНК профага показана темно-синим, ДНК генома бактерии – голубым (Д)

Наиболее изученными промоторами, чувствительными к уровню суперспирализации, являются промоторы генов gyrA, gyrB и topA E. coli, которые кодируют субъединицы гиразы и топоизомеразу I. Эти промоторы содержат сенсоры суперспирализации: транскрипция gyrA и gyrB активируется при релаксации генома, тогда как topA лучше транскрибируется при усилении отрицательной суперспирализации [75, 76]. Таким образом может осуществляться взаимно регулируемый синтез двух топоизомераз, обладающих противоположными активностями, что служит для гомеостатирования уровня суперспирализации генома [77, 78]. Аналогичные наблюдения сделаны для генов топоизомераз S. coelicolor и C. crescentus [58, 79].

Считается, что у Salmonella typhimurium уровень суперспирализации регулирует переход от анаэробного метаболизма к аэробному дыханию [80]. У H. pylori отрицательная суперспирализация является важным регулятором синтеза жгутика [81]. Циркадные колебания суперспирализации ДНК цианобактерии Synechococcus elongatus коррелируют с изменениями в транскрипции генов. При этом искусственная релаксация отрицательной суперспирализации, вызванная добавлением ингибитора ДНК-гиразы новобиоцина, приводит к быстрому изменению транскрипции генов, схожему с физиологическими изменениями в ходе циркадного цикла (рис. 4Г) [64]. Глобальное влияние суперспирализации на активность генов у разных бактерий, отражающееся в устройстве регуляторных областей, позволяет считать ее глобальным фактором транскрипции [63, 69, 72].

Ряд наблюдений указывает на то, что гираза и вызванная ею отрицательная суперспирализация участвуют в пространственной организации генома бактерий. Так, индуцированное фторхинолонами in vivo расщепление гиразой геномной ДНК E. coli приводит к образованию фрагментов длиной 50–100 т.п.н., что примерно соответствует длине суперспирализованных доменов хромосомы [82–84]. Показано, что активность ДНК-гиразы на ее высокоаффинном сайте, расположенном в центре профага бактериофага Mu, приводит к локальному усилению отрицательной суперспирализации и компактизации участка хромосомы с профагом в виде ДНК-плектонемы, что вызывает сближение концов профага и способствует их рекомбинации вирусной транспозазой MuA [85, 86] (рис. 4Д). Считается, что избыточная отрицательная суперспирализация, накапливающаяся в клетках E. coli, мутантных по топоизомеразе I, аналогично приводит к компактизации хромосомы [87]. Ингибирование же гиразы новобиоцином, наоборот, дезорганизует пространственную структуру хромосомы и уменьшает ее компактность, как показали эксперименты Hi-C (метод определения конформации хромосом), проведенные на C. crescentus [88]. Следует отметить, что значимых ассоциаций сайтов активности гиразы с границами и расположением топологически ассоциированных доменов генома у E. coli, определенных c помощью Hi-C, не обнаружено [66].

Топоизомераза IV

Эксперименты in vitro показывают, что топоизомеразы IV (Топо IV) и гиразы, несмотря на структурное сходство, обладают разным спектром активностей. Топо IV способна эффективно релаксировать положительные и (с на порядок меньшей скоростью) отрицательные супервитки, но в отличие от гиразы не может вносить избыточную отрицательную суперспирализацию [55, 56, 89]. Вместе с тем Топо IV – это эффективная декатеназа, разделяющая сцепленные кольцевые молекулы ДНК гораздо лучше, чем гираза [90–94]. Соответственно, Топо IV, но не гираза, способна расплетать узловые структуры в молекулах ДНК in vivo [95]. Предполагается, что описанные отличия обусловлены строением CTD-доменов GyrA-субъединицы гиразы и гомологичной ей ParC Топо IV (рис. 5Б). CTD-домен гиразы обеспечивает оборачивание фрагмента ДНК вокруг фермента, так что G-сегмент ДНК непосредственно переходит в T-сегмент, чем и достигается внутримолекулярное внесение супервитков [7, 96]. CTD Топо IV не изгибает G-сегмент, однако улавливает T-сегмент таким образом, чтобы он находился перпендикулярно к G-сегменту, что преимущественно происходит с двумя разными молекулами ДНК, например, катенанами [89, 93, 97] (рис. 4А, рис. 5А).

Топо IV, как и гираза, необходима для нормального деления бактерий: мутации в генах parC и parE, кодирующих субъединицы топоизомеразы, или подавление фермента ингибиторами вызывают у ряда бактерий появление так называемого par-фенотипа – удлиненные клетки, не способные к делению и содержащие повышенное количество копий неразделенной ДНК [36, 98–101]. При этом отсутствие активности Топо IV не мешает прохождению и окончанию репликации хромосомы E. coli [99, 100]. Биохимические свойства фермента позволяют предположить, что основная функция Топо IV в клетке заключается в разделении прекатенанов во время репликации (пересечений между сестринскими молекулами ДНК, возникающими из-за вращения реплисомы) и катенанов кольцевых молекул после ее завершения [100, 102]. В соответствии с этой гипотезой Топо IV не является жизненно необходимой для Streptomyces, имеющих линейные хромосомы, однако важна для поддержания кольцевых плазмид [38]. Интересно, что E. coli с искусственно созданными линейными хромосомами тем не менее проявляют par-фенотип при инактивации Топо IV. Это, возможно, свидетельствует о важности своевременного удаления прекатенанов и узлов по всей длине хромосомы бактерии [103]. Повышение уровня экспрессии Топо IV приводит к ускоренному разделению ДНК при делении клеток E. coli [100].

Предполагается, что у бактерий, лишенных Топо IV, функцию декатенации берут на себя ДНК-гираза и топоизомеразы типа I. Так, например, гираза M. tuberculosis является эффективной декатеназой, и она, как показал ChIP-Seq-эксперимент, значительно обогащена в области терминаторов репликации на хромосоме бактерии (у гиразы E. coli такого не наблюдается [66]), что свидетельствует в пользу выполнения ею функций Топо IV [39, 67, 104]. Вовлеченность гиразы H. pylori в процесс сегрегации хромосом косвенно подтверждается тем, что бактерии с делецией гена xerH, кодирующего рекомбиназу, участвующую в разрешении димеров хромосом и, возможно, декатенации, более чувствительны к ингибитору гиразы ципрофлоксацину [99, 105].

Способность Топо IV релаксировать положительные супервитки [56, 89] позволяет рассматривать ее в качестве помощника ДНК-гиразы при удалении положительной суперспирализации, образованной во время транскрипции и репликации [55, 106] (рис. 5Г). Например, обнаружено, что обработка клеток E. coli ингибитором РНК-полимеразы рифампицином снижает активность как гиразы, так и Топо IV, по крайней мере на некоторых участках генома [83, 107]. Интересно, что увеличение копийности генов parC и parE, кодирующих Топо IV, является частой супрессорной мутацией при удалении генов topA топоизомеразы I E. coli и B. subtilis. Считается, что в данном случае Топо IV компенсирует потерю топоизомеразы I и выполняет ее функцию, удаляя отрицательную суперспирализацию [37, 98, 108].

Рис. 5. Топоизомераза IV и ее функции. Схема структуры Топо IV в комплексе с ДНК (А). Сравнение структур C-концевых доменов GyrA гиразы (PDB 1zi0) и ParC Топо IV (PDB 1zvt). Предполагаемое положение ДНК при взаимодействии показано пунктиром (Б). Белки, взаимодействующие с Топо IV. Эффекты, оказываемые белками, показаны символами + (активация), – (ингибирование) и ? (взаимодействие не доказано) (В). Топологические эффекты, возникающие при репликации ДНК (Г). Движущийся репликационный комплекс создает положительные супервитки впереди себя, которые релаксируются ДНК-гиразой и, возможно, Топо IV. Из-за избыточной суперспирализации ДНК репликационный комплекс вращается, создавая прекатенаны. У E. coli с полуметилированными сайтами GATC новореплицированной ДНК связывается белок SeqA. Метилаза Dam метилирует GATC-сайты и вытесняет SeqA, таким образом, градиент концентрации SeqA тянется на 100–400 т.п.н. за репликационным комплексом и движется вместе с ним. Топо IV не может взаимодействовать с ДНК, покрытой SeqA, этим объясняется временная когезия регионов дочерних хромосом после репликации у E. coli, однако, когда все сайты GATC метилированы и SeqA больше не связан с ДНК, топоизомераза удаляет прекатенаны, разделяя дочерние хромосомы [110]

Топо IV взаимодействует с рядом белков, имеющих совершенно разные функции и структуры и участвующих в организации и разделении реплицированных хромосом: у E. coli это белок SeqA, который связывается с полуметилированными сайтами GATC в непосредственной близости от реплисомы [109, 110], когезиновый комплекс MukBEF [111, 112], ДНК-транслоказа FtsK [113] и, вероятно, рекомбиназа XerC [107, 114] (рис. 5В). Топо IV C. crescentus взаимодействует с белками GapR и NstA, первый из которых стимулирует активность фермента, а второй ее подавляет [55, 115]. In vivo Топо IV и когезиновый комплекс MukBEF E. coli образуют в клетке кластеры, состоящие из ~15 молекул топоизомеразы и ~10 молекул когезинов [116, 117]. Данные кластеры колокализуются с ориджинами репликации, определяют их положение в клетке и необходимы для расхождения ориджинов дочерних хромосом при делении [116, 118, 119]. Топо IV C. crescentus также необходима для правильного перемещения одного из ориджинов к противоположному полюсу клетки [101].

Топоизомераза NM

У M. smegmatis обнаружена уникальная топоизомераза типа II, названная TopoNM [120]. Она состоит из двух субъединиц (TopоN и TopоM), гомологичных субъединицам ParE/GyrB и ParC/GyrA топоизомеразы IV и гиразы соответственно. Согласно филогенетическому анализу аминокислотных последовательностей, TopoNM отстоит от всех известных топоизомераз IIA, что свидетельствует о ранней дивергенции генов ферментов [120]. TopoNM обладает пониженной чувствительностью к фторхинолонам и кумаринам. Фермент релаксирует положительные и отрицательные супервитки и декатенирует кольцевые молекулы ДНК, что типично для топоизомераз типа II. TopoNM отличает способность вносить положительные супервитки в релаксированные плазмиды [120]. Кроме TopoNM, подобной активностью обладает только «обратная гираза» – топоизомераза типа I, способная вносить положительные супервитки с затратой энергии гидролиза АТР [121]. Функции и механизм внесения положительных супервитков топоизомеразой TopoNM неизвестны. Предполагается, что TopoNM необходима для сегрегации хромосом. У M. smegmatis обнаружена необычная система защиты от мобильных генетических элементов, состоящая из генов, кодирующих конденсин-подобный комплекс, который препятствует эффективной трансформации бактерий плазмидами [122, 123]. TopoNM может быть частью данной системы защиты, поскольку некоторые когезины бактерий взаимодействуют с топоизомеразами [111, 112, 124]. Отсутствие TopoNM у других, в том числе родственных, бактерий и значительная дивергенция аминокислотных последовательностей от других топоизомераз II, возможно, указывают на вирусное происхождение фермента, гены которого попали в M. smegmatis горизонтальным переносом.

ТОПОИЗОМЕРАЗЫ АРХЕЙ

Представители домена Archaea обычно содержат топоизомеразы класса IIB – Топо VI. Некоторые представители архей из группы Euryarchaeota потеряли гены Топо IV, но содержат гены ДНК-гиразы, независимо полученные от разных групп бактерий в ходе горизонтального переноса генов [11]. У гипертермофильных архей в качестве приспособления к высоким температурам есть «обратная гираза». Считается, что «обратная гираза» нужна для поддержания стабильности дуплекса ДНК при высоких температурах и участвует в процессах репарации [125–127].

Топоизомераза VI

Впервые топоизомеразу VI (Топо VI) обнаружили у гипертермофильной археи Sulfolobus shibatae [128], а затем и у большинства архей, кроме ряда представителей группы Thermoplasmatales, у которых она замещена ДНК-гиразой [11]. In vitro Топо VI способна релаксировать как положительные, так и отрицательные супервитки, а также проявляет декатеназную активность [32, 129]. На основании биохимических данных и структурного анализа предполагается, что каталитический механизм Топо VI схож с действием топоизомераз класса IIА, несмотря на значительные отличия на уровне аминокислотных последовательностей между двумя группами белков (например, каталитический остаток тирозина WHD-домена расположен на другом элементе вторичной структуры) [32, 33, 130] (рис. 2, рис. 3Б).

Физиологическая роль Топо VI не выяснена. Совокупность in vitro активностей фермента, а также принципиальная возможность заместить эту топоизомеразу ДНК-гиразой указывает на то, что Топо VI, вероятно, необходима для декатенации реплицированных хромосом, а также для релаксации супервитков, образуемых при транскрипции и репликации [129]. Замечено, что уровень Топо VI у S. islandicus увеличивается через 7 ч после перемещения культуры клеток на температуру выше оптимальной. Что, как предполагается, компенсирует рост активности «обратной гиразы» в этих условиях [131].

ДНК-гираза

Гены гиразы обнаружены у представителей нескольких групп Euryarchaeota [11]. Как и бактериальная гираза, топоизомераза архей чувствительна к кумаринам и хинолонам [132–134]. В экспериментах in vitro показано, что гираза из Thermoplasma acidophilum обладает типичным спектром активностей – она способна релаксировать положительные супервитки, вносить отрицательные супервитки и декатенировать кольцевые молекулы ДНК [134]. Подавление активности гиразы добавлением новобиоцина к культуре клеток Halobacterium halobium приводит к остановке репликации ДНК, а также к значительному снижению уровня транскрипции и трансляции [132]. Считается, что гираза архей выполняет типичные для этого фермента функции – релаксацию положительных супервитков, возникающих при транскрипции и репликации, а также декатенацию сцепленных молекул ДНК при делении.

ТОПОИЗОМЕРАЗЫ ЭУКАРИОТ

Все известные эукариоты содержат гомодимерную топоизомеразу IIA (Top2), которая у большинства видов кодируется одним геном (Top2), однако, у позвоночных обнаружены два гена-паралога – Top2α и Top2β [10]. Представители Archaeplastida, а также связанные с ними вторичным эндосимбиозом пластид группы эукариот (Apicomplexa и др.) содержат гены ДНК-гиразы. Фермент имеет бактериальное происхождение и кодируется ядерными генами, перенесенными из генома хлоропластов после установления эндосимбиоза [11, 135]. Субъединицы Топо VI Archaea гомологичны белкам эукариот, которые входят в состав комплекса, необходимого для внесения разрывов в ДНК при мейотической рекомбинации (Spo11 – гомолог A-субъединицы, Rec102/Rec6/MEI-P22 – гомологи B-субъединицы) [128, 136, 137]. Так как эти белки не относятся к топоизомеразам, мы не будем подробно их рассматривать. Отличительной особенностью Archaeplastida является полноразмерная гетеротетрамерная Топо VI, обладающая типичными для топоизомераз ферментативными активностями [138].

Большинство агентов, используемых в химиотерапии опухолей, наиболее распространенный из которых – этопозид, являются ядами топоизомераз [139–145]. Они вызывают апоптотическую гибель клетки за счет индукции двухцепочечных разрывов ДНК [146–151]. Селективное действие этих препаратов обусловлено характеристиками опухолевых клеток – неопластические клетки активно пролиферируют, и в них повышен уровень экспрессии топоизомераз [152]. Актуальная проблема химиотерапии – тяжелые побочные эффекты, вызванные повреждением ДНК нормальных клеток, особенно активно пролиферирующих [153, 154]. Разрывы ДНК, опосредованные Тор2, могут приводить к хромосомным транслокациям [155] и индуцировать вторичную малигнизацию, например, терапия с использованием этопозида часто приводит к развитию лейкозов [156–158]. Необходимо отметить, что онкогенные эффекты часто связаны с ингибированием Top2β, которая ассоциирована с промоторными областями генов и активно экспрессируется в большинстве тканей [159–163]. Возможным решением этой проблемы может быть поиск и использование селективных ингибиторов, направленных только против Top2α.

Каталитические ингибиторы Тор2 (мербарон, сурамин, производные бисдиоксипиперазина – ICRF-187) не получили широкого применения в клинической практике в качестве противоопухолевых препаратов [164], однако, некоторые из них используются в качестве кардиопротекторов при терапии ядами Тор2 [165, 166]. По одной из гипотез протекторные свойства ингибиторов связаны со снижением количества ковалентных комплексов и, соответственно, разрывов ДНК из-за подавления активности Тор2 [167, 168].

Top2

Top2 эукариот, типичный представитель класса IIA, способна релаксировать положительные и отрицательные супервитки, а также декатенировать молекулы ДНК [169–172].

Эффект инактивации Top2 чаще всего проявляется в виде нарушения конденсации хроматина, изменении морфологии хромосом, хромосомных перестройках, нарушении эмбриогенеза и развития нервной системы у позвоночных [170, 173–180].

Тор2 эукариот локализована в ядре, однако показана также локализация этого фермента в митохондриях клеток млекопитающих [181]. Повышенный уровень экспрессии гена Тор2 (Тор2α позвоночных) характерен для активно пролиферирующих тканей, в которых этот фермент необходим для конденсации и разделения хромосом в процессе митоза [182, 183]. Уровень экспрессии гена Top2β в меньшей степени зависит от типа ткани [184].

СTD Top2 наименее консервативен, он служит мишенью посттрансляционных модификаций, в частности, фосфорилирования, уровень которого меняется в течение клеточного цикла. Различия между CTD Top2α и Top2β определяют функциональную разницу паралогов и особенности их регуляции [185]. Так, CTD-домен Top2α (CTDα) необходим для связывания с хромосомами во время митоза, а топоизомераза с CTDα нужна для пролиферации клеток, что показано при изучении свойств химерных ферментов: Top2α c CTD от Top2β и vice versa [186]. Показано, что СTD-домен Top2β снижает аффинность топоизомеразы к ДНК и уменьшает эффективность катализа [187, 188].

Тоp2 необходима для транскрипции высокоактивных и, особенно, длинных генов, во время которой она, как считается, релаксирует положительные супервитки перед полимеразой (рис. 6А) [189–193]. Кроме того, Тор2 привлекает РНК-полимеразу II на промоторы генов [194, 195] и важна для инициации транскрипции некоторых индуцибельных генов дрожжей (рис. 6Б) [196]. Обнаружено, что индукция экспрессии генов, регулируемых ядерными рецепторами (андрогенов, эстрогенов, глюкокортикоидов), связана со сборкой на промоторах комплекса, в который вовлечены хроматинремоделирующие белки (BRG1), компоненты системы репарации разрывов (PARP1, Ku70), а также Top2β [197–200]. Считается, что данный комплекс в ответ на гормоны вносит двухцепочечный разрыв в ДНК за счет Top2β, и этот разрыв необходим для эффективной релаксации супервитков при транскрипции (рис. 6Г). Аналогичные данные об активирующем эффекте разрывов, внесенных Top2β, получены для ряда генов в нейронах, стимулированных NMDA [201].

Исследования пространственной организации хроматина показали, что геном эукариот, за редким исключением, организован в топологически ассоциированные домены (ТАДы) [202–204]. С границами ТАДов ассоциированы архитектурные белки, в частности CTCF и когезин [205, 206]. С помощью методов ChIP-Seq и ChIP-exo (ChIP-Seq, точность которого повышена за счет обработки ДНК-белковых комплексов экзонуклеазой) обнаружена колокализация этих белков и Top2β на границах ТАДов (рис. 6В) [207]. Кроме того, картирование сайтов расщепления ДНК Top2 под действием этопозида (яда топоизомеразы) показало, что они преимущественно находятся рядом с сайтами связывания CTCF [208–211]. Предполагается, что ТАДы образованы петлями, которые, согласно механизму экструзии хроматиновых петель, формируются за счет деятельности когезина и CTCF [212–214]. Предполагается, что Top2 играет важную роль в функционировании хроматиновых петель и необходима для снятия топологического стресса на границах ТАДов (рис. 6В). Существует гипотеза, что компактность ТАДов может поддерживаться за счет отрицательной суперспирализации ДНК, что позволяет рассматривать ее в качестве универсального фактора, организующего ДНК про- и эукариот в пространстве [215].

Рис. 6. Функции Top2 эукариот. Релаксация супервитков в ходе транскрипции генов. Промоторы показаны фиолетовыми стрелками (А). Участие в инициации транскрипции (Б). Колокализация Top2, CTCF и когезина у границ топологически ассоциированных доменов. Розовые стрелки на ДНК иллюстрируют процесс экструзии петли под действием CTCF и когезина. Сайты связывания CTCF показаны красно-синими квадратами. Top2 облегчает транслокацию ДНК когезином, релаксируя топологический стресс (В). Индукция транскрипции гена путем внесения разрыва в промоторной области (Г). Декатенация ДНК дочерних хромосом (Д)

Обнаружено, что Top2 взаимодействуют также с компонентами АТР-зависимых хроматинремоделирующих комплексов [171, 216–218], которые осуществляют сборку и перемещение нуклеосом по ДНК и замену канонических гистонов на вариантные формы, поддерживая тканевую специфичность структуры хроматина [219–221]. Взаимодействие Top2 с ремоделирующими комплексами влияет на каталитические свойства топоизомеразы, а также на способность связываться с ДНК [171, 222], что, вероятно, необходимо для структурных перестроек хроматина. Предполагается, что комплексы, ремоделирующие хроматин, могут привлекать топоизомеразы и CTCF к границам ТАДов [223]. На данный момент взаимосвязь изменений структуры хроматина и активности Top2 недостаточно изучена и требует детализированного анализа в дальнейших исследованиях.

ДНК-гираза

Гираза эукариот, как и фермент бактерий, способна вносить отрицательные супервитки in vitro и чувствительна к кумаринам и хинолонам [224–226]. Гены гиразы растений способны комплементировать мутации фермента E. coli [225, 227, 228].

В ядерном геноме Arabidopsis thaliana обнаружен один ген субъединицы GYRA и три гена-паралога, кодирующие GYRB-субъединицы гиразы [225]. Показано, что AtGYRA взаимодействует с AtGYRB1 и AtGYRB2 (и такие комплексы способны вносить отрицательную суперспирализацию), но не взаимодействует с AtGYRB3 [228, 229]. Субъединицы содержат сигнальные пептиды, которые отвечают за локализацию AtGYRA в митохондриях и хлоропластах, AtGYRB1 – в хлоропластах, а AtGYRB2 – в митохондриях, поэтому считается, что в хлоропластах функционирует комплекс AtGYRA:AtGYRB1, а в митохондриях – AtGYRA:AtGYRB2. У субъединицы AtGYRB3 не обнаружен канонический сигнальный пептид, однако предсказано, что белок может иметь ядерную локализацию [225, 228] (рис. 7). У N. benthamiana известен один ген GYRA и два гена GYRB, при этом субъединицы GYRA и GYRB1 локализованы в хлоропластах и митохондриях [227]. Схожие результаты получены для GYRA-субъединицы гороха Pisum sativum [230].

У растений ингибирование гиразы в первую очередь затрагивает хлоропласты и митохондрии. Так, обработка клеток водоросли Chlamydomonas reinhardtii ингибиторами фермента (налидиксовая кислота, новобиоцин) приводит к изменению транскрипции в хлоропластах [224], а добавление налидиксовой кислоты к культуре клеток высшего растения Nicotiana tabacum подавляет синтез ДНК в хлоропластах [231]. Ингибиторы гиразы вызывают уменьшение числа хлоропластов и митохондрий, изменяют структуру хлоропластов и, вероятно, нарушают их деление [229]. Выращивание растений на питательных средах, содержащих ингибиторы гиразы, или обработка этими веществами растений A. thaliana замедляет их рост и индуцирует этиоляцию, что приводит в итоге к гибели растений [225, 229]. Аналогичные результаты получены с помощью подавления экспрессии генов гиразы вирус-индуцированным сайленсингом (VIGS) у растений N. benthamiana и РНК-интерференцией у A. thaliana [227, 229]. На основании этих данных можно заключить, что в растениях фермент, вероятно, сохранил свои роли, характерные для бактерий, он необходим для сегрегации ДНК двумембранных органелл, их деления и транскрипции их генов.

Неизвестной остается роль субъединицы AtGYRB3. Этот полипептид не обладает некоторыми консервативными для топоизомераз типа II аминокислотными мотивами в АТР-азном домене, но при этом содержит не встречающийся в других топоизомеразах SANT-домен, который известен своей способностью связываться с гистонами [228, 232]. Анализ экспрессии гена AtGYRB3 у A. thaliana выявил отсутствие корреляции с экспрессией других генов гиразы: наибольший уровень экспрессии AtGYRB3 обнаружен в тычинках и пыльце, тогда как экспрессия остальных субъединиц активнее всего в семенах и апикальной меристеме побега. Мы предполагаем, что белок AtGYRB3 может принимать участие в мейозе, где ассистирует Топо VI или SPO11.

С помощью BiFC (бимолекулярная комплементация флуоресценции) и коиммунопреципитации выявлено взаимодействие между РНКазой H1 (AtRNH1C), разрушающей РНК из гетеродуплексов РНК-ДНК (R-петли), сформированных в процессе транскрипции, и субъединицей ДНК-гиразы AtGYRA в хлоропластах A. thaliana [233]. Высказано предположение, что взаимодействие ферментов способствует преодолению репликационной вилкой R-петель, которые часто возникают в активно транскрибируемых регионах генома хлоропластов, например в генах рРНК.

Топоизомераза VI

Среди эукариот полноразмерная гетеротетрамерная Топо VI обнаружена только у представителей Archaeplastida [138]. Как и в случае с гиразой, растения содержат несколько генов-паралогов, кодирующих субъединицы Топо VI, – у A. thaliana обнаружен один ген B-субъединицы (AtTOP6B) и три гена A-субъединиц AtSPO11-1,2,3, а у Oryza sativa найдено пять генов-паралогов А-субъединиц и один ген В-субъединиц [138, 234, 235]. Субъединицы Топо VI растений локализованы в ядре, что было предсказано биоинформатически и подтверждено микроскопией [234, 236, 237].

С помощью двугибридного анализа и коиммунопреципитации установлено, что не все А-субъединицы образуют комплекс с B-субъединицей: у A. thaliana AtTOP6B взаимодействует с AtSPO11-2 и AtSPO11-3, но не с AtSPO11-1, OsTOP6B O. sativa взаимодействует с OsSPO11-2, OsSPO11-3 и OsSPO11-4, но не с OsSPO11-1 и OsSPO11-5 [138, 234, 235]. А-субъединицы, не взаимодействующие с B, вероятно, выполняют функции белков Spo11 у других эукариот, так, например, AtSPO11-1 и OsSPO11-1 необходимы для мейотической рекомбинации [238, 239]. OsSPO11-4, хотя и взаимодействует с OsTOP6B, также необходима для мейоза в пыльцевых зернах, поэтому одна из функций Топо VI растений может заключаться в участии в этом процессе [235].

Рис. 7. Клеточная локализация топоизомераз II и гомологичных белков у A. thaliana

Мутации или подавление экспрессии генов субъединиц Топо VI, которые образуют полноразмерную топоизомеразу и не участвуют в мейотической рекомбинации, вызывают карликовость у растений и уменьшение размера клеток. Такие растения лишены трихом и корневых волосков [237, 240, 241]. Показано, что у мутантов нарушена эндоредупликация – процесс полиплоидизации соматических клеток, который в норме происходит в клетках растений [237, 241]. Обнаружено, что для эффективного выполнения своих функций Топо VI образует комплекс с белками MID, RHL1 и BIN4 (интересно, что RHL1 и BIN4 имеют отдаленное сходство с последовательностью CTD Top2α позвоночных) [237, 242, 243]. Считается, что этот комплекс участвует в регуляции циклов эндоредупликации и, вероятно, принимает участие в декатенировании хромосом при достижении клетками высокой плоидности [236, 237, 242, 243].

Сверхэкспрессия компонентов Топо VI ряда растений в A. thaliana увеличивает плоидность клеток и значительно стимулирует устойчивость организмов к стрессовым условиям – повышенному содержанию соли и засухе, а также снижает чувствительность растений к абсцизовой кислоте (гормон стресса растений) [234, 241]. При сверхэкспрессии генов топоизомеразы изменяется уровень большого количества транскриптов, например, активируются каскады ответа на стресс [234]. Обнаружено, что Топо VI участвует также в ответе растений на окислительный стресс, связываясь с промоторами некоторых генов [244]. Остается неизвестным механизм, за счет которого Топо VI влияет на транскрипцию генов – связано ли это с релаксацией супервитков, внесением разрывов в ДНК, подобно Top2β, или вызвано ремоделированием хроматина? Кроме того, не ясно, как связаны процессы, в которых участвует Топо VI, – эндоредупликация и ответ на стресс.

ТОПОИЗОМЕРАЗЫ ВИРУСОВ И МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ

Top2-подобные топоизомеразы

Вирусы с крупным двухцепочечным ДНК-геномом (например, T4-подобные вирусы и NCLDV – крупные ядерно-цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы) имеют собственные Top2-подобные ферменты [11]. Топоизомеразы NCLDV (вирусы эукариот), возможно, являются сестринской группой Top2 хозяев. Филогенетическое положение топоизомераз группы бактериофагов T4 менее определенно, по аминокислотным последовательностям они одинаково не похожи на топоизомеразы IIA бактерий и эукариот [11]. Тем не менее, топоизомеразы этих вирусов консервативны по своей структуре и активностям – фермент бактериофага T4, хотя и кодируется тремя генами, релаксирует супервитки и декатенирует кольцевые ДНК, а также чувствителен к некоторым ингибиторам Top2 [245, 246]. Считается, что топоизомеразы необходимы для удаления положительной суперспирализации, возникающей при репликации генома вирусов [247, 248].

ДНК-гираза

В геноме гигантского бактериофага AR9 и ряда родственных вирусов из группы Myoviridae предсказаны гены ДНК-гиразы [249]. Функции и роль данного фермента не известны.

Топоизомераза VIII

В некоторых плазмидах архей и бактерий, а также в интегрированных в геном мобильных генетических элементах обнаружены гены топоизомераз, в которых предсказаны домены, схожие с доменами Топо VI. Топоизомеразы, кодируемые этими генами, выделены в отдельную группу IIB топоизомераз и названы Топо VIII [250, 251]. Для ряда Топо VIII показана способность релаксировать суперспирализованные плазмиды и проводить декатенацию кольцевых молекул ДНК [250]. Недавно была описана новая группа белков, гомологичных А-субъединице Топо VIII, названная Mini-А за сравнительно небольшие размеры полипептидов (рис. 2) [251]. Функция этих топоизомераз неизвестна, вероятно, они способствуют поддержанию и распространению плазмид в клетках хозяев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Топоизомеразы разрешают топологические проблемы, возникающие из-за спиральности ДНК. Эти ферменты широко распространены и необходимы для прохождения фундаментальных клеточных процессов. Согласно одной из гипотез, топоизомеразы возникли и прошли ранние этапы своей эволюции в вирусах, где и образовали все известные на сегодня группы еще во времена LUCA. При разделении клеточных организмов на современные домены вирусы распространяли, переносили и перемешивали гены топоизомераз [11, 250]. Вполне вероятно, что известное разнообразие топоизомераз является лишь вершиной айсберга и по мере изучения «темной материи вирусов» будут открыты новые типы и классы ферментов с необычными свойствами.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ LUCA – последний всеобщий предок; CTD – С-концевой домен; ТАД – топологически ассоциированный домен.

Подготовка обзора поддержана Соглашением с Министерством науки и высшего образования Российской Федерации № 075-15-2019-1661, а также при поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-34-90069.

Об авторах

Дмитрий А. Сутормин

Институт биологии гена РАН; Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий

Автор, ответственный за переписку.
Email: sutormin94@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6834-4246
Россия, Москва; Москва

Алина Х. Галивонджян

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт молекулярной генетики РАН

Email: a.galivondzhyan@yandex.ru
Россия, Москва; Москва

Александр В. Полховский

Институт биологии гена РАН; Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий

Email: polkhovsky.a.w@gmail.com
Россия, Москва; Москва

София О. Камалян

Институт биологии гена РАН; Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий

Email: Sofya171@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Константин В. Северинов

Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий; Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, ИБГ РАН; Институт микробиологии Ваксмана, Пискатэвей

Email: severik@waksman.rutgers.edu
Россия, Москва; Москва; Нью-Джерси, США

Светлана А. Дубилей

Институт биологии гена РАН; Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий

Email: stupidrabbit44@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы