Исследование эффективности новых ингибиторов вирусного канала М2 (R)-6-(1-адамантил)-1,3-оксазинан-2-она и (R)-6-(1-адамантил)-пиперидин-2,4-диона в отношении штамма вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 на модели гриппозной пневмонии мышей

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПЖ – средняя продолжительность жизни; ТЦИД₅₀ – тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя; МЛД – мышиная летальная доза; ФСБ – фосфатно-солевой буфер; MEM – Minimum Essential Medium (среда Игла); MDCK – Madin–Darby canine kidney (клетки почки собак Madin Darby); ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения; ИФА – иммуноферментный анализ; ДМСО – диметилсульфоксид; РМТ – римантадин, пндм (pdm) – пандемический.

ВВЕДЕНИЕ

Грипп – это высококонтагиозное респираторное вирусное заболевание человека и многих видов млекопитающих и птиц. Несмотря на доступность различных вакцин и противовирусных препаратов, вирусы гриппа вызывают ежегодные эпидемии по всему миру [1]. Ежегодно от гриппа и его осложнений умирают до 650000 человек, при этом только в США до 40000 [2]. На протяжении последних 10–15 лет ежегодно регистрируется от 27.3 до 47.2 млн случаев ОРВИ, причем удельный вес гриппа в структуре ОРВИ в зависимости от интенсивности эпидемий колеблется от 25 до 60%. Особое беспокойство вызывают пандемии гриппа, которые обычно возникают каждые 20–30 лет. Помимо непосредственного влияния на здоровье населения, особенно из групп риска [2], инфекция оказывает колоссальный негативный экономический эффект, что показала современная пандемия COVID-19. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает вакцинацию основной стратегией борьбы с гриппом. Однако из-за высокой и непредсказуемой изменчивости поверхностных белков вируса состав вакцины постоянно меняется в зависимости от антигенной структуры циркулирующих штаммов вирусов гриппа. Поэтому ВОЗ в дополнение к вакцинации рекомендует этиотропные препараты прямого вирусспецифического действия, что особенно актуально при пандемии, вызванной новыми штаммами вируса гриппа А. В настоящее время во всем мире одобрены два класса синтетических низкомолекулярных препаратов [1, 3, 4]: блокаторы канала М2 – аминоадамантаны – амантадин и римантадин (рис. 1); ингибиторы нейраминидазы – озельтамивир, занамивир, перамивир, ланинамивир (только в Японии) (рис. 1). Адамантановые блокаторы канала М2 относятся к первому поколению противовирусных препаратов, эффективных в отношении вируса гриппа типа А. Хотя эти препараты успешно использовали в течение более 30 лет [3, 4], с 2006 года их применение не рекомендовано из-за развития лекарственной резистентности к ним у большинства циркулирующих штаммов [5]. Возникновение резистентности отмечено как в результате эволюционных изменений вируса гриппа, так и непосредственно в процессе лечения римантадином и амантадином. Быстрое (через 1–2 пассажа) возникновение резистентных к этим препаратам штаммов показано в многочисленных экспериментах на животных и в культуре клеток, а развитие резистентности в человеческой популяции может происходить уже через 2–4 дня после начала лечения [6]. Генетическая основа резистентности обусловлена мутациями в гене 7 во второй рамке считывания, кодирующей белок М2, и связана с заменой аминокислот в позициях L26, V27, A30, S31 и G34 [7]. Мутация S31N (серин–аспарагин) – наиболее распространенная причина резистентности штаммов вируса гриппа А человека, птиц и свиней [8]. Тем не менее уникальный и громадный опыт успешного клинического применения препаратов адамантанового ряда, показавший их высокую эффективность, оставляет эти препараты в арсенале средств противовирусной терапии на случай возникновения вирусов, чувствительных к ним, но резистентных к другим противогриппозным препаратам, в частности к ингибиторам нейраминидазы. Следует отметить, что возникновение резистентности к озельтамивиру отмечается регулярно, но особенно масштабно это проявилось в период сезонного гриппа в 2008–2009 годах, когда практически все циркулирующие штаммы H1N1 имели мутацию H275Y в гене нейраминидазы [9], сохранив чувствительность к адамантанам.

В результате исследований, направленных на преодоление существующей резистентности вирусов гриппа к препаратам двух первых классов, получен ингибитор эндонуклеазы балоксавир марбоксил, обладающий высокой эффективностью в отношении различных штаммов вируса гриппа А и В (одобрен в Японии, проходит последнюю стадию испытаний в США) [10–12]. Кроме того, в России и Китае одобрен препарат умифеновир («Арбидол») – ингибитор процесса фузии, индуцируемой гемагглютинином [13, 14], а также риамиловир («Триазавирин», Россия) – ингибитор РНК-репликазы (рис. 1).

 

Рис. 1. Структуры лекарственных препаратов, активных в отношении вирусов гриппа

 

Несмотря на то что в разработке и клинической практике находится целый ряд соединений, способных противостоять резистентным штаммам, наличие набора комплементарных противовирусных средств с разным механизмом действия представляет надежный способ защиты от возникновения пандемии [15]. К сожалению, на сегодняшний день отсутствуют одобренные эффективные блокаторы канала с мутацией S31N. Недавно было показано, что экспериментальные М2-ингибиторы достаточно устойчивы к развитию резистентности [16], а подавляющее большинство возникающих штаммов с соответствующими мутациями [16, 17] не сохраняется в популяции, что позволяет полагать, что разработка таких ингибиторов перспективна.

Ранее мы разработали удобный метод синтеза новых энантиомерно чистых адамантильных производных 1,3-оксазинанов и пиперидинов 3–7 из соответствующих энантиомерных гомоаллиламинов 1 (cхема 1). Ключевыми стадиями процесса были реакции циклобромокарбамирования (1 в 2 и 3), дегидробромирования под действием tBuOK (2 в 4) и енолят-изоцианатная перегруппировка (4 в 5). Последние две реакции в случае бромида 3 проводятся в «одной колбе». Дикетон 5 далее постадийно восстанавливали в 4-гидроксилактам (6) и 4-гидроксипиперидин (7). Оказалось, что соединения 3–7 ингибируют in vitro репликацию пандемических штаммов H1N1 A/Калифорния/7/2009 и A/IIV–Оренбург/29–L/2016 [18]. Оба штамма содержат мутацию S31N, ответственную за резистентность к римантадину/амантадину. Среди пар энантиомеров, (R)-изомеры (асимметрический центр при адамантильной группе) 3–5, 7 наиболее эффективно ингибировали репликацию вируса in vitro (схема 1, табл. 1). Поскольку ингибирующая активность соединений оказалась высокой, в следующей серии опытов была изучена их эффективность in vivo.

 

Схема 1. Структуры новых производных адамантана, активных в отношении римантадин-резистентных штаммов вируса гриппа H1N1

 

Таблица 1. Подавление репликации вируса гриппа А ингибиторами 3–7 in vitro

Штамм вируса	ИК50 (ингибирующая концентрация), мкМ
	3	4	5	7
A/Калифорния/7/2009 (H1N1)	11.3	8.1	20.6	18.4
A/IIV–Оренбург/29–L/2016 (H1N1)	20.1	7.7	27.1	17.7

 

Соединение 3 исключено из исследований из-за его низкой растворимости в водных растворах, а соединение 7 в диастереомерно чистом виде оказалось достаточно сложным для синтеза. Таким образом, были выбраны адамантильные производные 1,3-оксазинан-2-она (4) и пиперидин-2,4-диона (5), синтез которых был прост, а растворимость приемлема. Активность соединений оценивали на модели гриппозной пневмонии мышей, индуцированной резистентным к римантадину вирусом гриппа А/Калифорния/04/09 (Н1N1).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Препараты и их приготовление

(R)-Изомеры соединений 4 и 5 синтезированы из соответствующего (R)-N-Boc-производного адамантильного гомоаллиламина 1, согласно описанным методикам [18]. В экспериментах использовали свежеприготовленные растворы соединений 4, 5 и римантадина (РМТ) в 50% водном ДМСО. Исследуемые растворы вводили мышам перорально в объеме 200 мкл. Животные получали соединения 4, 5 и РМТ в дозах 15 и 20 мг/кг/день.

Клетки и вирусы

В исследованиях использовали штамм вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1), полученный от ВОЗ и адаптированный к мышам путем трех пассажей через легкие. Гриппозную инфекцию у животных моделировали, используя наработанный вирус, выращенный в аллантоисной полости 9-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 37°С по общепринятой методике [19].

Животные

Мышей BALB/c (самки весом 12–14 г) получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.). Содержание животных соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник. Животных кормили брикетированными кормами в соответствии с утвержденными нормами. Проведение экспериментов утверждено Биоэтическим Комитетом по работе с животными НИИВС им. И.И. Мечникова.

Определение эффективности препаратов на модели вирусной пневмонии мышей

Животных разбивали на группы и помещали в клетки (по 8–13 особей). В день начала эксперимента мышей взвешивали. Мышей инфицировали интраназально под легким наркозом. В первой серии опытов использовали высокую дозу заражения МЛД₅₀, соответствующую 4.5 lg ТЦИД₅₀. Во второй серии экспериментов использовали низкую дозу МЛД₅₀, соответствующую 4.0 lg ТЦИД₅₀. Соединения 4, 5 и контрольный препарат РМТ вводили в объеме 200 мкл перорально за 4 ч до и после инфекции и далее в течение 5 дней 2 раза в день. Параллельно животным контрольной группы, инфицированным вирусом гриппа и не получавшим лечения, вводили фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (опыт I) или 50% раствор ДМСО (опыт II). За животными наблюдали в течение 16 дней. Мышей, имеющих признаки тяжелого течения инфекции и потерявших 30% первоначального веса, гуманно умерщвляли. Эффективность соединений на модели вирусной пневмонии мышей оценивали по следующим критериям: выживаемость, увеличение средней продолжительности жизни, уменьшение снижения веса и титра вируса в легких животных, получавших лечение, по сравнению с контрольной группой. Среднюю продолжительность жизни (СПЖ) высчитывали по формуле:

СПЖ = ∑f(d–1)/n,

где f – число мышей, умерших на день d, n – количество мышей в группе. Для выживших мышей d ограничено 21 днем. Уменьшение или увеличение веса рассчитывали для каждой мыши отдельно и выражали в процентах. За 100% принимали вес животного перед инфицированием. Для всех мышей одной группы определяли среднее значение потери или увеличения веса. На 4 день после инфицирования вирусом гриппа забивали по три мыши из каждой группы и в стерильных условиях извлекали легкие. После промывки в растворе стерильного 0.01 М ФСБ легкие гомогенизировали и ресуспендировали в 1 мл холодного ФСБ. После отделения клеточного дебриса центрифугированием (2000 g, 10 мин) супернатант использовали для определения инфекционного титра вируса в культуре клеток MDCK общепринятым методом. Титр вируса в легких рассчитывали как среднее значение lgTЦИД₅₀/мл ± SD.

Статистическую обработку проводили с использованием порангового критерия Мантеля–Кокса в программе Statistica 8.0, р < 0.05 рассматривали как статистически значимое отличие от контроля.

Изучение противовирусной активности препаратов в культуре клеток MDCK

Сток-растворы образцов и РМТ (1 мг/мл) готовили в ДМСО. Полученные растворы разводили до концентрации 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 и 10 мкг/мл культуральной средой MEM. Для определения противовирусной активности соединений клетки МDСК рассаживали в 96-луночные планшеты фирмы Costar и выращивали до полного монослоя. Перед началом исследований клетки промывали средой МЕМ, добавляли соединения 4, 5 и РМТ в указанных концентрациях и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. По окончании инкубации во все лунки, исключая контрольные, добавляли выделенный вирус. Далее планшеты инкубировали в течение 24 ч в атмосфере 5% СО₂ при 37°С и фиксировали 80% ацетоном на ФСБ. Противовирусную активность препаратов определяли по уровню экспрессии вирусных антигенов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Для каждой опытной точки использовали четыре лунки планшета, а каждое значение представляли как среднее арифметическое, вычисленное из трех независимых опытов.

Нуклеотидный анализ гена белка М

Молекулярный маркер резистентности к препаратам адамантанового ряда идентифицировали с помощью секвенирования гена М2 вируса гриппа A/Калифорния/04/2009пндм (H1N1), которым заражали животных. Суммарную РНК выделяли с помощью набора для экстракции нуклеиновых кислот RIBO-prep (AmpliSens, CRIE, Россия). Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием набора реагентов REVERTA-L (AmpliSens, CRIE) и праймера 5agcaaaagcagg. Вирусную кДНК амплифицировали с использованием следующих праймеров: M 1F agcaaaagcaggtagatgtt; M 1027R agtagaaacaaggtagttt, на Tercyc Thermocycler («ДНК-Технология», Россия). Реакции секвенирования перекрывающихся продуктов ПЦР проводили с использованием тех же праймеров, что и для амплификации, с помощью набора ABI PRISM Big DyeTM v. 3.1 согласно инструкциям производителя на автоматическом ДНК-анализаторе ABI-3100 PRIZM^TM (Applied Biosystems, США). Последовательности анализировали с помощью пакета программ Lasergene версия 10.1 (DNASTAR Inc, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение эффективности соединений 4 и 5 в дозе 20 мг/кг/день на модели гриппозной пневмонии мышей, индуцированной высокой дозой римантадин-резистентного вируса гриппа А/Калифорния/04/2009

Предварительные эксперименты показали, что введение интактным мышам изучаемых соединений в дозах до 60 мг/кг/день по схемам, используемым в дальнейшем, не привело к потере веса и гибели ни одного животного. Для изучения эффективности соединений 4, 5 в сравнении с РМТ в качестве оптимальной дозы мы выбрали 20 мг/кг [3]. Гибель животных контрольной группы, зараженных вирусом гриппа и не получавших лечения, наблюдалась начиная с 7 дня и к 9 дню достигала 100%, СПЖ животных данной группы составила 5.1 дня. Снижение массы тела в контрольной группе начиналось со 2 дня после заражения вирусом и достигало максимального значения (18%) к 5 дню. Эффективность лечения соединениями 4 и 5 была одинаковой – они обеспечивали защиту 60% животных на 15-й день наблюдения. Это лечение было более эффективным, чем применение РМТ в этой же дозе, который обеспечивал защиту 40% животных. Средняя продолжительность жизни мышей составила 10.1 дня при применении РМТ и более 12 дней в случае 4 и 5. Кроме того, в группах, получавших соединения 4 и 5, а также РМТ, снижение веса было менее значительным, чем в группе вирусного контроля (рис. 2 и 3, табл. 2).

 

Рис. 2. Выживаемость мышей при лечении соединениями 4, 5 на модели гриппозной пневмонии, индуцированной высокой дозой вируса

 

Рис. 3. Изменение массы тела мышей при лечении соединениями 4, 5 на модели гриппозной пневмонии, индуцированной высокой дозой вируса

 

Таблица 2. Эффективность 4, 5 и РМТ (перорально) на модели гриппозной пневмонии у мышей, инфицированных высокой дозой вируса гриппа А/Калифорния/04/2009

Доза, мг/кг	Выживаемость		Защита от смертности, %	СПЖ, дни
	выжившие/общее количество	Смертность, %
Соединение 4
20	3/5а	40	60	12.6
Соединение 5
20	3/5б	40	60	12.2
РМТ
20	2/5в	60	40	10.1
Вирусный контроль
	0/10	100		5.1

^а – (р = 0.003198); ^б – (р = 0.003198);
^в – (р = 0.031863).

 

Определение эффективности соединений 4 и 5 в дозах 15 и 20 мг/кг/день на модели гриппозной пневмонии мышей, индуцированной низкой дозой римантадин-резистентного вируса гриппа А/Калифорния/04/2009

В последующих экспериментах для выявления разницы в активности соединений 4 и 5 дозу вируса уменьшили, а также выбрали две дозы: 20 и 15 мг/кг/день.

В контрольной группе гибель зараженных вирусом гриппа мышей, не получавших лечения, к 16 дню наблюдения достигла 90%, а СПЖ в этой группе составила 10 дней (рис. 4, табл. 3).

 

Рис. 4. Выживаемость мышей в модели гриппозной пневмонии, индуцированной низкой дозой вируса

 

Таблица 3. Эффективность соединений адамантанового ряда на модели гриппозной пневмонии у мышей, инфицированных низкой дозой римантадин-резистентного вируса гриппа А/Калифорния/04/2009

Доза, мг/кг/день	Выживаемость		Защита от смертности, %	СПЖ, дни	Титр вируса, lg ТЦИД50
	выжившие/общее количество	смертность, %
	Соединение 4
15	5/10а	50	40	12.4	4.5±0.5
20	8/10б	20	70	14	1.16±1.6
	Соединение 5
15	7/10в	30	60	13.5	2.5±2.3
20	10/10г	0	100	>16	2.6±2.3
	РМТ
20	7/10д	30	60	13.7	1.3±0.3
	Вирусный контроль
-	1/9	90	-	10	6.1±0.3

^а – (р = 0.075134); ^б – (р = 0.001106); ^в – (р = 0.007137); ^г – (р = 0.000000168); ^д – (р = 0.007137).

 

Эффективность обоих соединений напрямую зависела от их дозы. Пероральное применение соединения 4 в дозе 15 мг/кг/день не влияло статистически значимо на выживаемость: смертность в этих группах составила 50% (рис. 4, табл. 3). Увеличение дозы до 20 мг/кг/день приводило к значимому снижению смертности до 20%. Более эффективным было соединение 5: при лечении этим соединением в дозе 15 мг/кг/день смертность составляла 30%, а доза 20 мг/кг/день полностью защищала животных от гибели.

В контрольной группе мышей снижение массы тела наблюдалось начиная с 3 дня после заражения вирусом, достигая к 11 дню в среднем по группе 11%. Данные по выживаемости подтверждены важнейшим критерием тяжести заболевания – потерей веса. В группах, получавших соединение 5 в обеих дозах и соединение 4 в дозе 20 мг/кг/день, не отмечено снижения массы тела мышей (рис. 5). При лечении препаратом сравнения РМТ в дозе 20 мг/кг/день смертность (30%) и потеря веса были выше, чем при лечении соединениями 4 и 5 в такой же дозе, что коррелировало с выживаемостью.

 

Рис. 5. Изменение массы тела мышей в модели гриппозной пневмонии, индуцированной низкой дозой вируса

 

Во второй серии опытов мы наблюдали большую выживаемость животных при использовании всех препаратов в аналогичных дозах по сравнению с первой серией опытов. Это связано с уменьшением дозы вируса, так как эффективность противовирусного препарата обратно пропорциональна дозе заражения, а также с тем, что группы для первичного скрининга соединений в первом эксперименте содержали меньше животных. Кроме того, во второй серии экспериментов наблюдали увеличение эффективности соединений при увеличении их дозы. Полученные данные свидетельствуют о вирусспецифическом эффекте изучаемых препаратов.

Влияние РМТ и соединений 4, 5 на титр вируса в легких мышей, инфицированных римантадин-резистентным вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009

Данные об увеличении выживаемости подтверждены вирусологическим методом. Титр вируса отражает размножение вируса в легких – высокое значение титра вируса соответствует более тяжелым патологическим изменениям в легких. Наибольшим титр вируса (6.1 ± 0.3 lg ТЦИД₅₀) был в легких мышей контрольной группы, не получавшей лечения. Наименьшее подавление титра вируса в легких наблюдалось при лечении соединением 4 в дозе 15 мг/кг/день (4.5 ± 0.5 lg ТЦИД₅₀). Увеличение дозы соединения 4 до 20 мг/кг/день, а также лечение соединением 5 в обеих дозах значительно ингибировало размножение вируса, снижая титр вируса на 2.4–4.9 lg ТЦИД₅₀, что соответствует клиническим параметрам эффективности лечения этими соединениями. Важно отметить значительное подавление размножения вируса в легких при применении РМТ. Несмотря на то что в обеих сериях экспериментов смертность при лечении РМТ в дозе 20 мг/кг/день была выше, чем в случае соединений 4 и 5 в этой же дозе, она была статистически значимо ниже, чем в группе инфицированных нелеченных животных. Ранее мы показали отсутствие активности РМТ в культуре клеток в отношении римантадин-резистентного вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1). Поэтому данные об обнаружении активности РМТ, хотя и сниженной, в опытах на животных были несколько неожиданными для нас. Однако данные, полученные in vivo, более адекватно характеризуют противовирусную активность, поскольку учитывают особенности биологической доступности, токсичности, фармакокинетики соединений непосредственно в организме. Часто концентрации препаратов в плазме крови могут значительно превышать концентрации, необходимые для подавления противовирусной активности в опытах in vitro. Это может объяснять сниженную, но тем не менее выраженную эффективность препаратов в отношении резистентных к ним вирусов. Это подтверждается данными, полученными при изучении эффективности озельтамивира у хорьков [20]. В этих исследованиях озельтамивир был эффективным не только в отношении чувствительного к озельтамивиру вируса гриппа H1N1, но и озельтамивир-резистентного вируса с мутацией H274Y, хотя и в меньшей степени. Эти данные совпадают также с результатами клинических исследований, в которых показана эффективность озельтамивира во время эпидемического сезона 2008–2009 при циркуляции озельтамивир-резистентного штамма H1N1 (H274Y). Однако эта эффективность была ниже эффективности родственного ингибитора нейраминидазы занамивира, к которому чувствителен этот штамм [21]. Кроме того, показана эффективность РМТ при сезонном гриппе с циркуляцией римантадин-резистентного вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1), однако эффективность такого лечения была ниже, чем при применении озельтамивира [22].

Секвенирование адаптированного к мышам римантадин-резистентного вируса гриппа А/Калифорния/04/2009

Известно, что мутация S31N в белке М2 вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1) считается молекулярно-генетическим маркером резистентности к препаратам адамантанового ряда. Хотя нами показано, что применение аналогов РМТ более эффективно, чем РМТ в соответствующих дозах, тем не менее РМТ также эффективно снижал смертность, потерю веса и размножение вируса в легких животных на модели гриппозной пневмонии, индуцированной вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1), резистентным к РМТ. Исходный вирус гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1) не вызывает гибель животных, поэтому был использован вирус, адаптированный к мышам путем пассирования в легких. Полученные данные об эффективности РМТ позволили предположить, что мутация, ответственная за резистентность к РМТ, могла быть утеряна в процессе адаптации. С целью проверки этого предположения проведено секвенирование гена 7 (кодирует белок М2), адаптированного к мышам вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1). Показало, что белок М2 использованного нами адаптированного к мышам вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1) содержит мутацию S31N, ответственную за резистентность к препаратам адамантанового ряда.

Изучение возможности возникновения резистентности к соединениям 4 и 5 на фоне их приема

Известно, что появление устойчивых к препаратам адамантанового ряда штаммов в культуре клеток и в организме животных происходит через 2–3 пассажа, в человеческой популяции такие штаммы могут появляться уже через 2–4 дня после начала лечения [4–6]. В следующей серии экспериментов изучена возможность возникновения резистентности к соединениям 4 и 5 на фоне их приема. Мы выделили вирусы из легких мышей на 4 день приема как обоих соединений, так и РМТ, и изучили их чувствительность к этим соединениям в культуре клеток. В качестве сравнения использовался вирус гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2), чувствительный к РМТ (рис. 6).

 

Рис. 6. Противовирусная активность соединений 4, 5 и РМТ в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2) (А) и вирусов гриппа А/Калифорния/04/09 (H1N1), полученных из легких леченных животных (Б)

 

Видно, что как соединения 4, 5, так и РМТ обладали активностью в отношении данного вируса. В то же время вирусы, выделенные из легких мышей, зараженных римантадин-резистентным вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N1), получавших 4 и 5, оставались чувствительными к этим соединениям, что говорит об отсутствии развития резистентности после их неоднократного применения. При этом вирус, выделенный из легких животных, леченных РМТ, оставался резистентным к нему. Таким образом, нами не обнаружено возникновения резистентности к соединениям 4 и 5 на фоне их приема, в отличие от РМТ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На модели гриппозной пневмонии мышей изучена противовирусная активность (R)-изомеров 6-(1-адамантил)-1,3-оксазинан-2-она (4) и 6-(1-ада­мантил)-пиперидин-2,4-диона (5), синтезированных в препаративных количествах согласно разработанному ранее методу. Изучение эффективности обоих соединений в дозах 15 и 20 мг/кг/день значительно снижало смертность животных, потерю веса, размножение вируса в легких и увеличивало продолжительность жизни. В проведенных экспериментах соединения 4 и 5 были более эффективными, чем римантадин, применяемый в тех же дозах и по такой же схеме. Пероральное лечение данными соединениями в течение 5 дней не приводило к возникновению резистентности. Эти соединения высокоселективно подавляют репродукцию вируса гриппа А, в том числе штаммов, резистентных к римантадину. Схема синтеза этих производных адамантана проста и содержит синтетически и экономически доступные соединения, а направленная модификация структуры адамантильного (гидроксилирование) и гетероциклического (замещение в положении 4 соединений 4 и 5) фрагментов этих соединений должна способствовать дальнейшему усилению противовирусной активности. Учитывая сказанное, можно считать, что эти соединения перспективны для разработки нового средства против вируса гриппа А.

Н.Ю.К. благодарит за поддержку данного исследования Министерство науки и высшего образования Российской Федерации. Авторы благодарят Г.Д. Коломникову (ИНЭОС РАН) за ценную помощь в организации исследовательской работы.

Об авторах

Екатерина Андреевна Глубокова

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: eaglubokova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5925-9733
SPIN-код: 2500-8409
Scopus Author ID: 57204360267
Россия, 105064, Москва

Ирина Анатольевна Ленева

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: wnyfd385@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7755-2714
SPIN-код: 9459-1065
Scopus Author ID: 6602522537
Россия, 105064, Москва

Надежда Павловна Карташова

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: nadezdakartasova10571@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2096-5080
SPIN-код: 6277-3407
Россия, 105064, Москва

Ирина Николаевна Фалынскова

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: falynskova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9836-9620
SPIN-код: 1151-6690
Scopus Author ID: 56196863600
Россия, 105064, Москва

Рабдан Магомедович Тихов

Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Email: tikhov.rabdan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3830-4662
Россия, 119991, Москва

Николай Юрьевич Кузнецов

Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Email: nkuznff@ineos.ac.ru
ORCID iD: 0000-0003-2702-5366
Россия, 119991, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы