Особенности презентации энцефалитогенного пептида МВР комплексами HLA-DR, обуславливающими протективность и предрасположенность к рассеянному склерозу

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Гены лейкоцитарного антигена человека (HLA) кодируют белки, которые способны связывать и представлять антигенные пептиды и, следовательно, играют критическую роль в иммунном ответе на патогены, а также в аутоиммунитете [1]. Связывание антигенных пептидов с молекулами HLA класса II приводит к образованию бинарных комплексов пептид–HLA, представляемых на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК) для распознавания рецепторами CD4 Т-клеток [2]. Новосинтезированные белки HLA защищены инвариантной цепью от агрегации [3]. В эндосомальном компартменте инвариантная цепь частично деградирует, оставляя пептид CLIP в бороздке связывания [4, 5]. Далее CLIP может обмениваться на антигенные пептиды, которые образуются в результате процессинга антигенов в эндосомах. Процесс обмена ускоряется белком HLA-DM [6]. Наконец, комплекс пептид–HLA транспортируется на поверхность АПК для узнавания CD4 Т-клетками. Механизмы презентации пептидов молекулами HLA класса II хорошо изучены [7], однако, каким образом формирование и презентация комплексов аутоантиген–HLA приводят к развитию аутоиммунных реакций до сих пор не установлено и остается предметом большого интереса. Таким образом, идентификация комплексов аутопептид–HLA, связанных с аутоиммунными реакциями, может дать ключ к пониманию патогенеза аутоиммунных заболеваний [8–10].

Рассеянный склероз (РС) – хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы, для которого характерны воспаление, демиелинизация и нейродегенерация [11]. Природа генетической предрасположенности к РС сложна и зависит от взаимодействия между множественными генетическими и эпигенетическими факторами, а также факторами окружающей среды [12]. Считается, что гены области HLA вносят большой вклад в риск развития РС [13]. Определенные аллели высокополиморфного гена HLA класса II – DRB1, по-видимому, являются значимой генетической детерминантой в патологии РС и могут влиять как на предрасположенность, так и на устойчивость к заболеванию [14]. Аллель HLA-DRB1*1501 и связанный с ним гаплотип (DQA1*0102, DQB1*0602, DRB1*1501, DRB5*0101) известны как универсальный фактор риска развития РС с 1970-х годов. Анализ ассоциаций HLA с РС в популяциях Северной Европы выявил группы аллелей HLA-DRB1 (DRB1*03, *01, *10, *11, *14, *08), которые коррелировали с заболеванием положительно или отрицательно [15]. Более того, идентифицированы аутоантигенные пептиды, презентируемые аллелями риска. HLA-DRB1*1501 связывает фрагмент основного белка миелина (MBP), энцефалитогенный пептид MBP_85-99 [8], тогда как HLA-DRB5*0101 презентирует пептид MBP_86-105 [10]. Причем определены CD4 Т-клеточные клоны, распознающие эти комплексы пептид–HLA, связанные с заболеванием [16–18].

Ранее на репрезентативной когорте этнических русских пациентов с РС и условно здоровых людей показано, что группа аллелей HLA-DRB1*01 связана с устойчивостью к РС, тогда как аллели HLA-DRB1*15 положительно ассоциированы с заболеванием. Анализ взаимодействия белков, кодируемых аллелем риска HLA-DRB1*1501 и протективным аллелем HLA-DRB1*0101, с библиотекой MBP показал, что оба белка способны связывать миелиновый пептид MBP_81-104 cо сходной аффинностью [19]. Однако непонятно, каким образом связывание одного и того же миелинового фрагмента обеспечивает протективность в случае одного аллеля и предрасположенность к заболеванию в случае другого. Поэтому целью данного исследования было сравнение кинетических характеристик взаимодействия пептида MBP_81-104 с протективным HLA-DR1 и предрасполагающим HLA-DR15 при РС, а также сравнение с их вирусными антигенными детерминантами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экспрессия и очистка белков

Рекомбинантные белки HLA-DR1 (продукт генов HLA-DRА1*0101 и HLA-DRB1*0101), HLA-DR15 (продукт генов HLA-DRА1*0101 и HLA-DRB1*1501) и HLA-DM получены с использованием методики, описанной ранее [20]. Пептид CLIP (PVSKMRMATPLLMQA) был связан ковалентно с N-концом β-цепей HLA-DR1 и HLA-DR15 через линкер с сайтом тромбина, по которому отрезали пептид для дальнейших экспериментов (1 ч, 20 U/мг, 25°C). Белки концентрировали в PBS и хранили при 4°С.

Слитые с тиоредоксином пептиды сконструированы и получены на основе созданной ранее библиотеки эпитопов MBP [21]. Генетические конструкции, кодирующие HA, pp65, миелиновые пептиды (MBP_88-100 и MBP_85-97), MBP с точечными мутациями (V86A, V87A, F89A, F90A) и химерные пептиды (НА-МВР, МВР-НА, рр65-МВР), получены путем ПЦР с использованием библиотеки эпитопов MBP в качестве матрицы. В белковых конструкциях пептиды были слиты с С-концом бактериального тиоредоксина через гибкий линкер (SGGGG)₃S, несущий His-теги для очистки. Конструкцию, несущую только тиоредоксин с линкером (TRX), использовали в качестве отрицательного контроля. Все слитые с тиоредоксином пептиды получены с использованием методики, описанной ранее [21]. Пептиды химически биотинилировали с помощью EZ-Link Sulfo-NHS-LC-биотина (Thermo Fisher Scientific) в молярном соотношении 1 : 20 в течение 30 мин при 25°C. Белки концентрировали в PBS и хранили при -20°С.

Иммуноферментный анализ связывания пептидов HLA-DR

Биотинилированные пептид MBP_81-104 и его варианты с точечными мутациями (V86A, V87A, F89A, F90A) (750 нМ) инкубировали в течение 18 ч при 37°C в 50 мкл PBS с HLA-DR с CLIP (HLA-DR1 или HLA-DR15) (150 нМ) (рис. 1А). Тиоредоксин с линкером (TRX) использовали в качестве отрицательного контроля. Комплексы DR–пептид затем добавляли к антителам L243 к HLA-DR, иммобилизованным в планшете и блокированным РBS с 2% обезжиренным сухим молоком. Связанный с HLA-DR биотинилированный пептид количественно определяли с помощью стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена.

Рис. 1. Схемы иммуноферментного анализа связывания пептидов HLA-DR (А) и кинетики загрузки пептидов на HLA-DR (Б). Каждая из временных точек отмечена цветом. L243 – иммобилизованные в планшете моноклональные антитела к HLA-DR

В конкурентном анализе биотинилированные пептиды HA и pp65 (150 нМ) инкубировали с соответствующим HLA-DR (HLA-DR1 или HLA-DR15) (150 нМ) в присутствии небиотинилированных HA, pp65, миелиновых пептидов (MBP_88-100 и MBP_85-97) или химерных пептидов (НА-МВР, МВР-НА, рр65-МВР) (в концентрациях 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6 и 7.8 нМ) в течение 18 ч при 37°C в 50 мкл PBS. Эксперименты проводили в трех повторностях.

Рис. 2. А – последовательности пептида MBP81-104 и его вариантов с точечными заменами аминокислот на аланин. Точечные замены обозначены разными цветами. Б, В – связывание пептида MBP81-104 и его вариантов (750 нМ) с точечными заменами аминокислот на аланин с HLA-DR1 (Б) и HLA-DR15 (В) с CLIP (150 нМ). Цвета столбцов соответствуют цветам точечных замен. Белые столбцы представляют фоновый сигнал с PBS. Тиоредоксин с линкером (TRX) использовали в качестве отрицательного контроля. Стандартное отклонение отмечено

Иммуноферментный анализ кинетики загрузки пептидов на HLA-DR

Соответствующий HLA-DR с CLIP (HLA-DR1 или HLA-DR15) (150 нМ) инкубировали в присутствии HLA-DM (150 нМ) в 50 мкл цитратного буфера (50 мM цитрат натрия, 150 мM NaCl, pH 5.3) при 37°C с биотинилированными HA, pp65, миелиновыми пептидами (MBP_88-100 и MBP_85-97) или химерными пептидами (НА-МВР, МВР-НА, рр65-МВР) (150 нМ) в течение 7, 5, 3, 1 и 0 ч (рис. 1Б). Каждую временную точку смешивали отдельно, начиная с крайнего времени инкубации (7 или 5 ч), каждые 2 ч, после чего все временные точки вносили в планшет одновременно. ИФА проводили, как описывалось выше, лишь с той разницей, что время инкубации реакционных смесей в планшете и со стрептавидином было сокращено до 30 мин. Эксперименты проводили в трех повторностях. Анализ кинетических кривых проводили с применением модуля Enzyme Kinetics программы SigmaPlot (Sigma-Aldrich). Аппроксимации кривых связывания выполняли с помощью нелинейного приближения наименьших квадратов к модели связывания Ленгмюра, описывающей стехиометрию связывания 1 : 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение эпитопов MBP_81-104, распознаваемые HLA-DR1 и HLA-DR15

Нами проведено сравнение кинетических характеристик взаимодействия энцефалитогенного миелинового фрагмента MBP_81-104 с белками главного комплекса гистосовместимости II класса человека: протективным HLA-DR1 и предрасполагающим HLA-DR15 [19] в случае рассеянного склероза, а также с их антигенными детерминантами вирусного происхождения. Для осуществления данного анализа было необходимо первоначально определить связывающий эпитоп в составе MBP_81-104, распознаваемый HLA-DR1. Аланиновый скрин (замена гидрофобных и ароматических остатков на аланин, начиная с N-конца пептида (рис. 2А)) MBP_81-104 выявил остаток Phe в положении 90 в качестве гидрофобного якоря P1 (рис. 2Б); в свою очередь, это позволило предположить, что карманы P6/P7 и P9 в HLA-DR1, связанные с MBP_81-104, заняты остатками Thr, Pro и Thr в положениях 95, 96 и 98 соответственно. Эпитоп связывания MBP_81-104 с HLA-DR15, где Val87 и Phe90 находятся в положениях Р1 и Р4 соответственно [8], подтвержден с использованием соответствующих мутантных форм MBP_81-104 (рис. 2В).

Сравнение кинетики загрузки пептида МВР на HLA-DR1 и HLA-DR15

На следующем этапе изучена кинетика связывания HLA-DR1 с пептидами HA_306-318, MBP_88-100 и их химерными конструкциями MBP-HA и HA-MBP в присутствии HLA-DM, ускоряющего скорость обмена CLIP на изучаемый пептид (рис. 3Б). HA является фрагментом гемагглютинина вируса гриппа – классической вирусной антигенной детерминантой для HLA-DR1 [22]. Для сравнения с аллелем риска HLA-DRB1*1501 также получены кинетические кривые связывания HLA-DR15 с пептидом pp65_109-123, который, в свою очередь, является фрагментом белка цитомегаловируса, вирусной детерминантой HLA-DR15 [23], миелиновым пептидом MBP_85-97 и химерной конструкцией pp65-MBP (рис. 3В). Важно отметить, что в химерных пептидах граница между N- и С-концевыми частями составляющих пептидов проходила между аминокислотными остатками в положениях Р4 и Р5 (рис. 3А).

Рис. 3. А – последовательности пептидов MBP88-100, MBP-HA, HA-MBP, HA, MBP85-97, pp65-MBP и pp65. У химерных пептидов цветом отмечены части составляющих пептидов, а также положения аминокислотных остатков Р1/4/5/9. Указаны значения начальной скорости взаимодействия каждого из пептидов с соответствующим HLA-DR1 или HLA-DR15 с CLIP, а также значения IC50 в конкуренции с соответствующим пептидом HAbio или pp65bio. Б, В – кинетика связывания биотинилированных пептидов MBP88-100, MBP-HA, HA-MBP и HA (150 нМ) с предзагруженным CLIP HLA-DR1 (150 нМ) (Б) и биотинилированных пептидов MBP85-97, pp65-MBP и pp65 (150 нМ) с предзагруженным CLIP HLA-DR15 (150 нМ) (В) в присутствии HLA-DM (150 нМ). Г, Д – конкурентное взаимодействие HLA-DR1 (150 нМ) с биотинилированным пептидом HAbio (150 нМ) (Г) и HLA-DR15 (150 нМ) с биотинилированным пептидом pp65bio (150 нМ) (Д) в присутствии возрастающих концентраций (7.8 нМ–1 мкМ) небиотинилированных пептидов MBP88-100, MBP-HA, HA-MBP и HA (Г), и MBP85-97, pp65-MBP и pp65 (Д) в присутствии HLA-DM (150 нМ). Стандартное отклонение и значения р отмечены

Известно, что вирусный пептид НА прочно связывается в пептидсвязывающей бороздке HLA-DR1 с высокой скоростью [24], поэтому в случае взаимодействия пептида HA с HLA-DR1 наблюдается выход кинетической кривой на плато уже в течение 8 ч (рис. 3Б). В то же время миелиновый пептид MBP_88-100 связывается с HLA-DR1 со скоростью, практически на порядок меньшей по сравнению с вирусным пептидом. Таким образом, можно утверждать, что протективный HLA-DR1 кинетически различает экзогенный вирусный и эндогенный миелиновый антигены. Химерный пептид HA-MBP, содержащий N-концевую часть HA (306–311) и C-концевую часть MBP (94–100), связывается с HLA-DR1 с низкой скоростью, схожей с кинетикой взаимодействия с MBP_88-100. Однако в случае химерного пептида MBP-HA, состоящего из N-концевой части MBP (88–93) и С-концевой части HA (312–318), скорость связывания очень высокая, как и при связывании природного вирусного пептида HA. На основании полученных данных можно сделать вывод, что кинетические показатели связывания химерных пептидов с HLA-DR1 свидетельствуют о важности C-концевой части для эффективного взаимодействия с HLA-DR1 при одинаково высокоаффинных N-концевых частях пептидов. В изучаемых фрагментах N-концевые части содержат основной якорь в кармане связывания P1: ароматические остатки Tyr308 в случае HA и Phe90 в случае MBP. Можно предположить, что именно наличие Pro96 в C-концевой части пептидов MBP_88-100 и химерного HA-MBP меняет положение пептида в борозде связывания из-за природной конформационной жесткости пролина, тем самым ухудшает взаимодействие пептида c карманом связывания Р7. В случае пептидов HA и MBP-HA в положении 314 С-концевой части в кармане P7 находится гидрофобный аминокислотный остаток лейцина, благоприятствующий связыванию.

При анализе аллеля, обуславливающего риск возникновения РС, вирусный, миелиновый и химерный пептиды связываются с HLA-DR15 практически c одинаковой скоростью (рис. 3В). В отличие от HLA-DR1 у HLA-DR15 ключевым для связывания пептида является карман Р4, куда идеально подходят ароматические аминокислотные остатки, а второстепенным – гидрофобный карман Р1. Поэтому эффективность связывания вирусного, миелинового и химерного пептидов может быть объяснена благоприятными для взаимодействия пептидов с пептидсвязывающей бороздкой HLA-DR15 аминокислотными остатками, заполняющими важные для загрузки пептидов карманы Р1 и Р4: Ile111 и Tyr114 в случае pp65, Val87 и Phe90 в MBP. Несмотря на то что вирусный пептид pp65 также содержит в С-концевой части пролин в кармане P7, он не уменьшает эффективность взаимодействия пептида с пептидсвязывающей бороздкой, так как в случае HLA-DR15 карманы P6/P7/Р9 играют меньшую роль, чем Р4. Разницу в скорости взаимодействия HA c HLA-DR1 и pp65 с HLA-DR15 (примерно в 5 раз) можно объяснить различиями в устройстве карманов данных комплексов HLA-DR и наличием якорных остатков в соответствующих пептидах (рис. 3А).

Сравнение скорости загрузки протективного HLA-DR1 и положительно ассоциированного с РС HLA-DR15 различными пептидами экзогенной и эндогенной природы может свидетельствовать о большей важности кинетической, а не термодинамической составляющей во взаимодействии комплекса MHC II с антигенами.

Сравнение конкурентной способности пептида МВР за связывание с HLA-DR1 и HLA-DR15

Принимая во внимание, что миелиновый пептид связывается и с HLA-DR1, и с HLA-DR15, хоть и с разной скоростью, на заключительном этапе оставался вопрос, способен ли он конкурировать за связывание с высокоаффинными вирусными антигенами. Для прояснения данного вопроса провели эксперименты по изучению конкурентного связывания пептидов HA, миелинового MBP_88-100 и химерных HA-MBP и MBP-HA с HLA-DR1 в присутствии вирусного НАbio (рис. 3Г), а также пептидов рр65, миелинового MBP_85-97 и химерного рр65-MBP с HLA-DR15 в присутствии вирусного рр65bio (рис. 3Д). Кинетические данные свидетельствуют, что эффективно конкурировать с вирусным HAbio за связывание с HLA-DR1 способны HA и химерный пептид MBP-HA. Причем значимое падение сигнала ИФА при их добавлении начинается с концентрации, равной 30 нМ. В отличие от них добавление миелинового MBP_88-100 и химерного HA-MBP незначительно понижает сигнал ИФА, начиная лишь с высокой концентрации (300 нМ) (рис. 3Г). IC₅₀ этих пар пептидов различаются практически на порядок, что говорит о неспособности миелинового пептида MBP_88-100 эффективно конкурировать с вирусным HA за связывание с HLA-DR1 (рис. 3А). В случае HLA-DR15 снижение сигнала ИФА в реакциях конкуренции MBP_85-97 и pp65 начинается с 30 нМ конкурирующего пептида рр65bio (рис. 3Д) – аналогично взаимодействию пептида НА с HLA-DR1. При этом IC₅₀ пептида MBP_85-97 приблизительно в 3 раза меньше, чем у pp65, таким образом, пептид MBP_85-97 в отличие от MBP_88-100 даже более конкурентоспособен, чем вирусный (рис. 3А).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя их полученных данных, можно предположить, что в отличие от HLA-DR15 фрагмент основного белка миелина будет с низкой вероятностью представлен в комплексе с HLA-DR1 на поверхности антигенпрезентирующих клеток в достаточной плотности, необходимой для активации Т-клеточного ответа. По-видимому, протективные свойства аллеля HLA-DRB1*0101 могут быть связаны со способностью белкового продукта этого аллеля HLA-DR1 кинетически различать миелиновые и экзогенные пептиды. С другой стороны, предрасполагающий к РС HLA-DR15 способен эффективно представлять фрагмент MBP даже в конкуренции с экзогенными пептидами, такими, как вирусный pp65. Наши данные позволяют считать, что один и тот же энцефалитогенный миелиновый фрагмент может презентироваться с абсолютно разной результирующей скоростью в зависимости от аллеля HLA-DR. Другими словами, иммуногенность компонентов миелина при РС в большей степени может определяться не их доступностью для иммунных клеток, а, скорее, генетической предрасположенностью за счет носительства того или иного аллеля HLA-DR.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 17-74-30019 и гранта РФФИ ЕМБЛ_т № 18-54-74006.

Об авторах

Азад Энверович Мамедов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: bioaz12@gmail.com

м.н.с.

Лаборатория биокатализа

Россия, Москва

Иоанна Никитовна Филимонова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: ioannishka@gmail.com

инженер

лаборатория биокатализа

Россия, Москва

Иван Витальевич Смирнов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук; Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: smirnov@mx.ibch.ru

заместитель директора по науке

лаборатория химии протеолитических ферментов

Россия, Москва; Казань

Алексей Анатольевич Белогуров

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: alexey.belogurov.jr@gmail.com

заведующий лабораторией 

лаборатория белков гормональной регуляции

Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы