Генетическая вариабельность основной помпы множественной лекарственной устойчивости AcrAB-TolC определяет резистентность грамотрицательных бактерий к SkQ1

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ SkQ1 - пластохинон, конъюгированный с децилтрифенилфосфонием, - является представителем нового класса антибиотиков, которые влияют непосредственно на бактериальную биоэнергетику. Благодаря способности подавлять рост широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий SkQ1 может найти применение в медицине и сельском хозяйстве, поэтому важным представляется изучение его влияния на микробные экосистемы и развитие устойчивости к нему. Нами показано [1, 2], что устойчивость бактерии Escherichia coli к SkQ1 обусловлена наличием специфической помпы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) AcrAB-TolC (рис. 1), определяющей резистентность к широкому спектру антибиотиков, поверхностно-активных веществ, солей желчных кислот, красителей и малых органических молекул [3]. Однако в нашей работе [1] не были проанализированы все TolC-зависимые помпы, а именно предполагаемая TolC-зависимая помпа EmrKY-TolC и EntS, а также белок AcrZ. Известно, что состоящий из 49 аминокислотных остатков небольшой вспомогательный белок внутренней мембраны AcrZ (он же YbhT) связывается с комплексом AcrAB-TolC, в состав которого входят белки AcrA, AcrB и TolC, и повышает способность помпы откачивать из клетки определенные классы субстратов, такие, как тетрациклин, пуромицин и хлорамфеникол [4]. Бактерии обладают генетической пластичностью, что позволяет им реагировать на широкий спектр экологических угроз, таких, как антибиотики. Бактерии используют две основные генетические стратегии выживания: (1) приобретение детерминант устойчивости посредством горизонтального переноса гена и (2) мутации, связанные с мишенями антибиотиков [5]. Аминокислотные последовательности белков AcrA, AcrB и TolC идентичны у лабораторных субштаммов В и К-12 E. coli [6]. Ранее мы показали, что удаление любого из белков AcrA, AcrB или TolC приводит к полной потере устойчивости к SkQ1 [1]. Расстояние между оперонами TolC и AcrB в хромосоме E. coli составляет около 175 т.п.н. [7], таким образом, вероятность приобретения устойчивости, опосредованной помпой AcrAB-TolC, через межвидовой горизонтальный перенос генов очень мала. На сегодняшний день устойчивость, опосредованная помпой МЛУ, представляет собой единственный известный механизм резистентности к SkQ1, а AcrAB-TolC является единственным известным насосом, удаляющим SkQ1 из клетки. На основании данных о способности малого белка AcrZ регулировать устойчивость к таким антибиотикам, как тетрациклин, пуромицин и хлорамфеникол [4], можно предположить, что устойчивость к SkQ1 также модулируется AcrZ. С другой стороны, резистентность к SkQ1 могла бы модулироваться локальными и глобальными регуляторами транскрипции, а также посредством посттранскрипционной и посттрансляционной регуляции [8]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использованы стандартные лабораторные штаммы E. coli, штаммы MG1655 и W3110 (F-lambda-IN (rrnD-rrE) 1 rph-1). Штаммы E. coli MC1061, DH5α и BL21(DE3) предоставлены С.С. Соколовым (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ), штамм E. coli JM109 - Л.А. Новиковой (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ), штамм E. coli GR70N получен от Ю.В. Берцовой (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ), штамм E. coli XL1-Blue приобретен у компании «Евроген» (Москва, Россия). Делеционные штаммы E. coli ECK0751 (лишенные гена acrZ), ECK0584 (лишенные гена entS), ECK2363 (лишенные гена emrY), ECK2364 (лишенные гена emrK) любезно предоставлены H. Niki (National Institute of Genetics, Япония) [9]. Staphylococcus aureus получен из коллекции микроорганизмов МГУ им. М.В. Ломоносова (№ 144). Photobacterium phosphoreum предоставлен А.Д. Исмаиловым (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ). Rhodobacter sphaeroides получен от G. Klug (Institute for Microbiology and Molecular Biology at Justus-Liebig-University of Giessen, Германия). Бактериальные клетки выращивали при 37°С в среде LB или Мюллера-Хинтона при частоте встряхивания 140 об / мин как описано в [1]. Исследование устойчивости к SkQ1 осуществляли методом двойных разведений в жидкой питательной среде с использованием панелей собственного производства согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI). Для исследования была использована жидкая среда Мюллера-Хинтона (HIMEDIA, Мумбай, Индия). Панель концентраций готовили в 96-луночном микротитровальном планшете в объеме 200 мкл. Бактериальную суспензию (50 мкл) в среде Мюллера-Хинтона добавляли к каждой лунке для получения 250 мкл суспензии (5 × 105 КОЕ/мл). Полученную суспензию инкубировали при 37°С в течение 20 ч [1]. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли как самую низкую концентрацию, которая полностью ингибировала рост бактерий. Рост бактерий наблюдали визуально наряду с измерениями OD620 [1]. Для биоинформатического анализа мы использовали поисковый инструмент BLASTp (NCBI, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), базу данных STRING v.10.5 (EMBL, http: //string.embl.de/) и базу данных BioCyc из коллекции баз данных Pathway/Genome (PGDBs, https://biocyc.org/) BioCyc. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мы сравнили устойчивость различных лабораторных штаммов E. coli и выяснили, что все эти штаммы устойчивы к SkQ1 (табл. 1). Это объясняется, по-видимому, идентичностью первичной структуры белков AcrA, AcrB и TolC у всех изученных нами штаммов [6]. Ранее [1] нами было показано, что грамотрицательные бактерии P. phosphoreum и R. sphaeroides, в отличие от штаммов E. coli, не обладают устойчивостью к SkQ1. Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что аминокислотная последовательность белков этих бактерий, аннотированных как AcrB, довольно сильно отличается от последовательности белка AcrB из E. coli. Уровень их идентичности с белком AcrB E. coli составляет 65 и 33% соответственно, что и определяет, по-видимому, чувствительность этих бактерий к SkQ1. Отметим, что белок AcrD, удаление которого не влияет на чувствительность к SkQ1, на 66% идентичен последовательности белка AcrB, что сравнимо с белками AcrB из P. phosphoreum и R. sphaeroides. Таким образом, для резистентности бактерий к SkQ1 требуется большее сходство аминокислотной последовательности их белка AcrB с последовательностью белка AcrB из E. coli. Чтобы проверить это заключение, мы проанализировали первичную структуру белка AcrB другой грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae, которая оказалась на 91.5% идентичной структуре белка AcrB из E. coli. Это дало нам основание предположить наличие резистентности к SkQ1 у K. pneumoniae, что и было подтверждено экспериментально (табл. 1 и 2). Анализ антибактериальной активности SkQ1 по отношению к делеционным мутантам E. coli по белкам EmrK, EmrY и EntS (рис. 2) показал, что минимальные ингибирующие концентрации SkQ1 были такими же, как определенные нами для штамма дикого типа E. coli (табл. 1). Чтобы проверить роль белка AcrZ в устойчивости E. coli к SkQ1, мы сравнили устойчивость штаммов дикого типа E. coli MG1655 и штаммов с делецией белков AcrZ и AcrB. Если белок AcrZ участвует в функционировании помпы МЛУ AcrAB-TolC с формированием комплекса AcrABZ-TolC, то для удаления SkQ1 устойчивость делеционного мутанта по белку AcrZ должна быть выше устойчивости мутанта с делецией белка AcrB, но ниже, чем у белка дикого типа. Если белок AcrZ не участвует в функционировании помпы AcrAB-TolC, то устойчивость мутанта с делецией белка AcrZ должна быть такой же, как у штамма дикого типа, и выше, чем в случае делеции белка AcrB. В качестве положительного контроля в этих опытах использовали хлорамфеникол [10], удаление которого из клетки усиливается под действием белка AcrZ [4]. Влияние белка AcrZ на устойчивость к SkQ1 и хлорамфениколу определяли одновременно, чтобы исключить зависимость получаемых результатов от условий эксперимента. В наших экспериментах делеционный мутант по белку AcrZ обладал такой же устойчивостью к SkQ1, как и штаммы дикого типа E. coli (рис. 3), тогда как три штамма E. coli (WT, ΔAcrZ и ΔAcrB) показали разные уровни устойчивости к хлорамфениколу (рис. 3) как описано ранее [4]. Согласно [4], связывание AcrZ с AcrB может вызывать конформационные изменения в его периплазматическом домене, что влияет на распознавание и захват субстратов с низкой гидрофобностью. Поскольку SkQ1 является высокогидрофобным соединением (logP = 4.11) [11, 12], его распознавание помпой может не регулироваться связыванием AcrZ с AcrB. Анализ делеционных мутантов показал, что помпа EmrKY-TolC не принимает участие в откачке SkQ1 из бактериальной клетки. Удаление гена entS также не влияло на откачку SkQ1 из бактериальной клетки. Таким образом, подтвердилось наше заключение о том, что AcrAB-TolC является единственной помпой, откачивающей SkQ1. Другим возможным модулятором устойчивости к SkQ1 могла бы быть 6S РНК, регулятор сигма-70-зависимой транскрипции генов [13]. Наши предварительные исследования не выявили различий в устойчивости к SkQ1 между делеционным мутантом E. coli по белку SsrS и штаммом E. coli дикого типа. Нельзя исключить, что устойчивость к таким антибиотикам, нацеленным на биоэнергетику, как SkQ1, может быть повышена за счет тривиального увеличения уровня экспрессии. Недавно было показано [13], что экспрессию помп плейотропной лекарственной устойчивости у дрожжей Saccharomyces cerevisiae можно индуцировать додецилтрифенилфосфонием, другим представителем этого класса антибиотиков, т.е. додецилтрифенилфосфоний может служить как активатором, так и ингибитором лекарственной устойчивости [14, 15]. Однако нет прямой взаимосвязи между временной активацией экспрессии и постоянным увеличением плейотропной устойчивости к подобным веществам. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные результаты показывают, что SkQ1 является эффективным антибиотиком, устойчивость к которому бактерий E. coli обусловлена лишь наличием помпы AcrAB-TolC. Существенный фактор, определяющий устойчивость других грамотрицательных бактерий к SkQ1, - идентичность их белков AcrB и AcrB из E. coli. Белок AcrZ не участвует в формировании устойчивости к SkQ1, иными словами, обычный способ регуляции устойчивости за счет влияния на помпу МЛУ AcrAB-TolC через белок AcrZ не эффективен в случае SkQ1.

Об авторах

П. А. Назаров

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Митотех

Автор, ответственный за переписку.
Email: nazarovpa@gmail.com
Россия

Е. А. Котова

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nazarovpa@gmail.com
Россия

В. П. Скулачев

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; НИИ митоинженерии, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nazarovpa@gmail.com
Россия

Ю. Н. Антоненко

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nazarovpa@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы