Дарпины - перспективные адресные белки для тераностики

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Разработка гибридомной технологии, описанной Кёлером и Мильштейном (Kohler, Milstein) в 1975 году [1], сделала возможным получение моноклональных антител, которые стали использоваться как в исследованиях, так и в диагностике и терапии, благодаря высокой аффинности и специфичности, став той «магической пулей», на которой основана таргетная терапия. Первые терапевтические моноклональные антитела были получены в 1986 году. На данный момент Американским управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) для клинического применения одобрено 82 моноклональных антитела, и это число продолжает расти. Однако и у антител есть свои недостатки: их сравнительно большой размер (150 кДа) может ограничивать проникновение как в нормальные ткани [2], так и в солидные опухоли [3], а константная часть помимо увеличения времени циркуляции в крови может вызывать и нежелательные эффекты [4]. Кроме того, полноразмерные антитела требуют сложного фолдинга и специфического гликозилирования и потому должны нарабатываться в клетках млекопитающих, что сильно удорожает производство. Еще одну проблему представляет гомология между белками мыши и человека, что затрудняет отбор антител к консервативным белкам. Многие из этих трудностей были преодолены получением укороченных и одноцепочечных вариантов антител. Развитие технологии рекомбинантных антител привело к тому, что классическая иммунизация была заменена полностью синтетическими библиотеками, не зависящими от ограничений на аутоспецифичность лимфоцитов. В дальнейшем разработанные при этом методы отбора молекул по аффинности к лиганду стали применяться для других белков, что позволило обойтись без самих антител [5]. В 2018 году значимость этих работ была подтверждена присуждением Нобелевской премии по химии за изучение «Направленной эволюции ферментов и связывающих белков». Одну половину премии получила американский ученый-биоинженер Френсис Арнольд (Frances H. Arnold) «за направленную эволюцию ферментов»; вторую половину премии получили Джордж Смит (George P. Smith) и сэр Грегори Уинтер (Sir Gregory P. Winter) «за фаговый дисплей пептидов и антител». За последние 20 лет с помощью этих технологий создано множество альтернативных каркасных белков, таких, как монободи (получены из фибронектина III типа FN3), антикалины (получены из липокалинов), аффибоди (получены из иммуноглобулинсвязывающего белка А) и дарпины (получены из анкириновых повторов). Такие белки, как и антитела, обычно имеют «константную» каркасную часть и «вариабельные» участки, замены аминокислот в которых не приводят к изменению пространственной структуры белка [6]. Получение альтернативных каркасных белков (скаффолдов) состоит из двух стадий: 1) создание библиотеки белковых вариантов путем случайного или сайт-направленного мутагенеза и 2) отбор полученных молекул с помощью фагового, дрожжевого или рибосомного дисплея, связывающего генотип (последовательность гена белка) и фенотип (способность связываться с мишенью). К преимуществам указанных альтернативных белков можно отнести их малый размер, облегчающий проникновение в опухоль, отсутствие константной части антител, позволяющее избегать цитотоксичности, опосредованной антителами и молекулами системы комплемента, во многих случаях высокая термостабильность, позволяющая долгое время хранить препарат при комнатной температуре без потери активности, легкость наработки в микроорганизмах и даже возможность прямого химического синтеза. Кроме того, создавать и нарабатывать биспецифические молекулы из альтернативных белков гораздо проще, чем получать биспецифические антитела. Еще одно преимущество таких молекул - независимость от иммунизации животных, что упрощает процедуру и расширяет спектр возможных молекул-мишеней за счет включения в него высококонсервативных белков [4]. Многие типы альтернативных скаффолдов созданы на основе белков с повторяющимися мотивами: лейцин-богатые повторы (leucine-rich repeat, LRR), анкириновые повторы (Ankyrin repeat, AR), повторы Armadillo (ArmRP), тетратрикопептидные повторы (TPR). Белки на основе повторов активно используются, поскольку имеют протяженную связывающую поверхность, размер которой можно варьировать, и жесткую каркасную часть, сформированную «константными» участками [7]. В данной работе обсуждаются дарпины - искусственные белки, созданные на основе анкириновых повторов. В эукариотической клетке белки, построенные из анкириновых повторов, связываются с самыми разными мишенями, обеспечивая организацию цитоскелета и регуляцию активности ферментов [8]. Исходное разнообразие таких белков использовано для создания консенсусного мотива, содержащего вариабельные участки и способного объединяться с соседними мотивами в единую жесткую структуру (рис. 1А, Б). ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРОЕНИЯ ДАРПИНОВ В НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И БИОТЕХНОЛОГИИ В качестве связывающих молекул дарпины могут применяться в большинстве технологий, использующих укороченные варианты моноклональных антител. Однако помимо малого размера дарпины обладают и другими полезными свойствами. Легкость наработки в бактериях позволяет создавать белки слияния, добавлять последовательности для очистки и мечения, а отсутствие остатков цистеина в исходной молекуле дарпина позволяет ввести уникальный дополнительный цистеин для точной конъюгации. Дарпины состоят из плотно упакованных анкириновых повторов, каждый из которых образует β-поворот и две антипараллельные α-спирали. Как правило, такой повтор состоит из 33 аминокислот, шесть из которых образуют связывающую поверхность. При создании рекомбинантных библиотек в эти позиции помещают кодоны случайных аминокислот, за исключением цистеина (чтобы избежать образования дисульфидных связей), а также глицина и пролина (так как некоторые аминокислоты входят в состав α-спирали) [6]. Как правило, дарпины образованы 2-3 связывающими мотивами, заключенными между N- и C-концевыми мотивами, экранирующими гидрофобные области (рис. 1). Дарпины - маленькие белки (14-18 кДа), чрезвычайно термостабильные (Tm, температура плавления, может достигать 90°С), устойчивые к протеазам и денатурирующим агентам. Они могут нарабатываться в бактериях с высоким выходом - до 200 мг белка с 1 л жидкой культуры [6]. Оба конца полипептидной цепи дарпинов формируют альфа-спирали, что облегчает создание геометрически точных мультимеров. Так, на основе двух дарпинов, узнающих разные, но перекрывающиеся эпитопы зеленого флуоресцентного белка, при помощи компьютерного моделирования был создан молекулярный «зажим», обхватывающий молекулу GFP с образованием стабильного комплекса, тем не менее сохраняющего обратимость связывания. Такие зажимы были использованы для ориентированной посадки на чип для поверхностного плазмонного резонанса белков, слитых с GFP, и для хроматографической очистки таких белков на сефарозе, конъюгированной с данным дидарпином. Дидарпины, конъюгированные с флуоресцентным красителем, помогли усилить сигнал от редких GFP-меченых белков на поверхности клеток и позволили точнее детектировать их проточной цитометрией [9]. При помощи компьютерного моделирования создан дарпин, формирующий тример за счет добавленного к нему тримеризующего мотива и связывающийся с тримерным белком аденовируса пятого серотипа (Ad5). Для этого белка была показана способность практически необратимо связываться с оболочкой аденовируса. При этом добавление еще одного дарпина, специфичного к рецептору клетки-мишени, позволило эффективно заражать клетки, экспрессирующие соответствующий онкомаркер (HER2, EGFR или EpCAM) [10]. Жесткость и малый размер дарпинов позволили создавать димеры, влияющие на проведение сигнала от внеклеточных рецепторов за счет фиксации рецепторов в определенных конформациях или сближения молекул, генерирующих конкурирующие сигналы. Так, при помощи бивалентного дарпина удалось избирательно подавить активность тучных клеток, связавших иммунные комплексы на основе IgE. Один из модулей этого димера с высокой аффинностью узнает константную часть IgE, связавшуюся с FcεRI, другой связывается с низкоаффинным FcγRIIB, оказывающим ингибирующее действие на тучные клетки. Данный рекомбинантный белок специфически подавляет дегрануляцию тучных клеток in vivo [11]. Аналогичный подход применен для создания биспецифического дидарпина, блокирующего проведение митогенного сигнала от рецептора HER2 и оказывающего цитотоксический эффект на HER2-положительные раковые клетки [12]. Помимо мультимеров с использованием гибких линкеров дарпины могут объединяться и в жесткие конструкции за счет введения альтернативных C- и N-концевых мотивов, имеющих общую альфа-спираль. Дарпины в таких ди- и тримерах по-прежнему могут одновременно связывать свои мишени, стабилизируя их для кристаллизации [13]. Один из таких дарпинов, улучшавший кристаллизацию партнеров, использован для создания жестких димеров с дарпинами, специфичными к JNK1, что позволило получить кристаллы этих комплексов и выявить структурные особенности, объясняющие специфичность дарпинов к изоформе киназы и их способность ингибировать ее активность [14]. К недостаткам дарпинов как связывающих модулей можно отнести их вогнутую связывающую поверхность, жесткость и неполную рандомизацию вариабельных участков, что потенциально может ограничивать спектр возможных мишеней. Однако и эти ограничения можно преодолеть: для этого созданы дарпины нового поколения - LoopDARPins, в которых центральный β-поворот заменен на более длинную выпуклую петлю H3 из молекулы иммуноглобулина. Эта вставка позволила изменить геометрию антигенсвязывающей поверхности, ввести гибкий участок с большим количеством вариабельных аминокислотных остатков и улучшить селективность связывания [15]. Однако вогнутая связывающая поверхность дарпинов может служить и их преимуществом. Воспользоваться им позволяет еще одно свойство дарпинов - отсутствие остатков цистеина в белке, что позволяет ввести единственный цистеин в участок вблизи поверхности взаимодействия с мишенью и использовать его для конъюгации. В работе Kummer и соавт. [16] дарпин, специфичный к фосфорилированной форме ERK (pERK), был конъюгирован с мероцианиновым красителем, чувствительным к окружению - интенсивность его флуоресценции возрастает в гидрофобном окружении, т.е. когда дарпин связывается с pERK. Таким образом, создан биосенсор, позволяющий детектировать фосфорилирование ERK. Поскольку показано, что дарпин распознает не сам фосфат, а изменение конформации активационной петли [17], то этот подход может использоваться и для других белков, меняющих конформацию в ходе функционирования. Таким образом, даже относительные недостатки дарпинов могут быть использованы для создания уникальных конструкций. В свою очередь, преимущества дарпинов позволили найти множество применений этим белкам, в первую очередь в терапии и диагностике онкологических заболеваний. ПРИМЕНЕНИЕ ДАРПИНОВ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ РАКА Принципы создания дарпинов были описаны в 2003 году [18], а уже в 2007 году эту технологию применили для создания высокоаффинных белков, связывающихся с онкомаркером HER2 [19]. Впоследствии были получены дарпины, связывающиеся с другими молекулами, вовлеченными в канцерогенез: EpCAM [20], EGFR [21], VEGF [22], HGF [22], катепсином B [23], KRAS [24] и др. Однако на сегодняшний день больше всего адресных агентов разработано на основе дарпинов, связывающихся с HER2. Очевидно, это связано с терапевтической значимостью их мишени. Белок HER2 (ErbB2) является тирозинкиназным рецептором, экспрессируемым в незначительном количестве на поверхности эпителиальных клеток человека. В норме HER2 участвует в различных внутриклеточных путях передачи сигнала, но главным образом стимулирует HER3/PI3K/Akt-путь и каскады активируемых митогенами протеинкиназ (MAP) [25], что приводит к пролиферации клеток. Антиген HER2 избыточно экспрессируется в 20-30% опухолей молочной железы и яичников, поддерживая агрессивные свойства опухоли, а определение уровня экспрессии HER2 включено в стандартные протоколы диагностики рака молочной железы [26]. Амплификация гена ERBB2 может наблюдаться также в клетках аденокарцином желудка и кишечника [27], карцином яичника [28], эндометрия [29], предстательной железы [30], а также слюнных желез, влагалища, шейки матки и мочевого пузыря [31]. В настоящий момент в терапии HER2-положительного рака применяют два мышиных гуманизированных антитела: трастузумаб (Herceptin, Roche-Genentech), связывающийся с субдоменом IV HER2; и пертузумаб (Perjeta, Roche-Genentech), связывающийся с субдоменом II рецептора [32]. Кроме того, применяется трастузумаб, конъюгированный с ингибитором сборки микротрубочек (трастузумаб-эмтазин, Kadcyla, Roche) [33] и два химических ингибитора тирозинкиназного домена: лапатиниб (Tykerb или Tyverb, GlaxoSmithKlein) [34] и нератиниб (Nerlynx, Pfizer) [35]. Эти препараты одобрены для лечения HER2-положительного рака молочной железы, рака желудка и гастроэзофагеального рака [36], однако в ближайшем будущем показания к их применению могут быть расширены. Согласно результатам исследования MY PATHWAY, достоверный ответ на терапию трастузумабом и пертузумабом показали пациенты с 9 типами HER2-положительных опухолей: колоректальный рак (38% пациентов), рак мочевого пузыря (33%), рак желчного пузыря (29%), рак слюнной железы (80%), немелкоклеточный рак легкого (13%), рак поджелудочной железы (22%), рак яичника (13%), рак предстательной железы и рак кожи (единичный пациент в каждом случае) [37]. Отсюда можно заключить, что потенциал HER2-специфичной таргетной терапии не исчерпывается раком молочной железы и желудка. При этом существующая таргетная HER2-направленная терапия действительно повышает эффективность лечения, однако полное излечение или продолжительность жизни пациентов более 5 лет по-прежнему являются редкими событиями, что стимулирует поиск новых препаратов. Основные способы применения дарпинов в разработке препаратов для диагностики и терапии рака суммированы на рис. 2. Визуализация опухоли важна для предклинических испытаний препаратов на животных, для установления диагноза пациенту и оценки эффективности терапии. В животных моделях могут применяться флуоресцентные дальнекрасные белки, позволяющие осуществлять прижизненную визуализацию, такие, как mCherry [38]. На основе mCherry и HER2-специфичного DARPin 9_29 создан рекомбинантный белок DARPin-mCherry, специфично окрашивающий HER2-положительные раковые клетки [39] и использующийся для функционализации наночастиц [40-43] как описано ниже. В случае визуализации опухоли в организме человека применяют радионуклиды, избирательно накапливающиеся в опухоли. Мономерные дарпины могут служить связывающими модулями для радиоиммунной диагностики, использующей высокоаффинный белок, конъюгированный с носителем радионуклида, как правило, хелатором или квазиковалентными комплексами технеция [44]. Исходно эта технология была разработана для одноцепочечных антител, однако вскоре ее применили и для других каркасных белков, так как основные требования, предъявляемые к связывающим модулям для радиоиммунной диагностики, включают высокую аффинность и малый размер [45, 46]. Дарпины, сочетающие в себе оба этих свойства, могут успешно использоваться для радиоактивной визуализации опухолей. Так, на основе HER2-специфичных дарпинов G3 и 9_29 получены конъюгаты с желаемой фармакокинетикой и пониженным накоплением в печени [47-49]. Что касается терапии рака, то дарпины могут служить как для доставки токсических модулей, так и для ингибирования сигнальных путей клетки за счет специфического связывания мембранных рецепторов. Биспецифический дидарпин с линкером определенной длины дал возможность зафиксировать внеклеточные части соседних рецепторов HER2 в нефункциональной конформации, не позволяющей образовывать димеры и проводить митогенный сигнал, что вызывало цитостатический и цитотоксический эффект для HER2-зависимых раковых клеток [12]. На основе этого димера создан препарат MP0274, тетрадарпин, содержащий модули, распознающие домены I и IV рецептора HER2, и два модуля, связывающихся с сывороточным альбумином человека, которые увеличивают время циркуляции белка в крови. В 2017 году началась I стадия клинических испытаний этого препарата [50]. Клинические испытания проходит и еще один мультивалентный дарпин - MP0250. Этот белок содержит в одной полипептидной цепи модуль, специфичный к фактору роста эндотелия сосудов VEGF-A, модуль, специфичный к фактору роста гепатоцитов HGF, и два модуля, связывающиеся с сывороточным альбумином человека [22]. Таким образом, препарат ингибирует сразу два важных для раковых клеток сигнальных пути: VEGF/VEGFR и HGF/cMet, а связывание с альбумином позволяет добиться длительной циркуляции. MP0250 - первый мультимерный дарпин, проверенный на пациентах [51], в ходе первой фазы клинических испытаний этот препарат хорошо переносился в дозах, достаточных для подавления активности VEGF. В 2018 году началась Ib/II стадия клинических испытаний MP0250 в сочетании с осимертинибом для лечения пациентов с неплоскоклеточным немелкоклеточным раком легкого (non-squamous non-small cell lung cancer, NSCLC) с мутировавшим EGFR [52]. В 2017 году началась II стадия клинических испытаний MP0250 в сочетании с бортезомибом и дексаметазоном для лечения пациентов с резистентной и рецидивирующей множественной миеломой (refractory and relapsed multiple myeloma, RRMM) [53]. Еще один способ создания дарпинов с желаемой фармакокинетикой - конъюгация с полиэтиленгликолем и применение конъюгатов локально. Один из таких конъюгатов, специфичный к VEGF абиципар, применяется при возрастной дегенерации сетчатки (neovascular age-related macular degeneration, ADE) и диабетическом макулярном отеке (diabetic macular edema, DME) [54]. Этот препарат находится на третьей стадии клинических испытаний. ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ТОКСИНЫ НА ОСНОВЕ ДАРПИНОВ Легкость получения дарпинов в бактериальной системе экспрессии дала толчок к созданию противоопухолевых агентов на основе белковых токсинов. Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa (PE, ETA) является одним из наиболее эффективных индукторов апоптоза за счет собственной ферментативной активности, угнетающей трансляцию. PE состоит из трех доменов: домен I специфичен к рецептору α-2-микроглобулина животных клеток (LRP1, CD369), он обеспечивает интернализацию молекулы токсина в клетку; домен II содержит сайты протеолиза фурином и дисульфидные связи, восстанавливаемые белок-дисульфидизомеразами, участвующими таким образом во внутриклеточном процессинге молекулы; домен III обладает собственной каталитической активностью - АDP-рибозилирует эукариотический eEF2, блокируя тем самым биосинтез белка в клетке, что в итоге приводит к ее гибели [55]. Доменное строение экзотоксина дает возможность использовать его укороченные варианты, сохраняющие каталитическую активность, заменяя при этом собственный связывающий домен на направляющие молекулы желаемой специфичности. При этом агенту достаточно проникнуть в эндосому, где эффекторный модуль отрезается фуриновой протеазой, после чего токсин при помощи сигнала ретроградного транспорта KDEL транспортируется в эндоплазматический ретикулум, откуда высвобождается в цитозоль [56]. Дарпин Ec4, специфичный к EpCAM, использован для доставки укороченного варианта экзотоксина А P. aeruginosa к клеткам рака прямой кишки линии HT29. Полученный белок DARPin-ETA показал противоопухолевую активность как in vitro, так и in vivo [57]. ЕТА был использован и для подавления роста HER2-положительных опухолей. Поскольку DARPin 9_29 эффективно вызывает интернализацию HER2 в комплексе с присоединившимся белком [58], этот адресный модуль хорошо подходит для доставки фрагментов экзотоксина к раковым клеткам. На основе модуля DARPin 9_29 и фрагмента экзотоксина А P. aeruginosa массой 40 кДа был создан адресный токсин DARPin-PE40, который успешно индуцировал апоптоз в клетках, сверхэкспрессирующих HER2, проявляя избирательную токсичность in vitro, и эффективно подавлял рост клеток рака молочной железы в ксенографтной модели [59]. Одну из проблем противоопухолевых агентов на основе псевдомонадного экзотоксина представляет их высокая иммуногенность. Будучи белком бактериального происхождения, ETA вызывает образование нейтрализующих антител, которые снижают эффективность терапии и повышают риск анафилактических реакций. Для решения этой проблемы разработаны различные подходы: мутагенез PE с последующей химической модификацией (ПЭГилированием), подавление иммунной системы пациента, выявление и элиминация путем мутагенеза иммунодоминантных эпитопов B- и T-лимфоцитов. Последний из названных подходов наиболее универсален и совместим с разными схемами терапии опухолей [60]. DARPin-LoPE, содержащий фрагмент экзотоксина с удаленными или мутированными иммунодоминантными эпитопами, показал избирательную токсичность в отношении HER2-сверхэкспрессирующих клеток in vitro в пикомолярном диапазоне концентраций [61] и эффективно подавлял рост клеток рака яичника в ксенографтной модели [62]. При этом неспецифическая токсичность и иммуногенность DARPin-LoPE были ниже, чем у DARPin-PE40, и вклад дарпина в эти побочные эффекты был незначительным. ПРИМЕНЕНИЕ ДАРПИНОВ В АДРЕСНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ Фотодинамическая терапия рака полагается на использование фотосенсибилизаторов, которые под действием света определенной длины волны заставляют кислород переходить в активные формы, основной из которых является синглетный кислород (1О2) [63]. Преимущество фотодинамической терапии по сравнению с химиотерапией состоит в меньшем воздействии на нормальные ткани, поскольку освещению подвергается только определенная часть тела. Однако и такая локализация воздействия не позволяет полностью избежать таких побочных эффектов, как сенсибилизация кожи и сетчатки глаза. Для решения этой проблемы применяются два подхода: увеличение селективности накопления фотосенсибилизатора в опухоли за счет физико-химических свойств самой молекулы и ковалентное присоединение адресных модулей к фотосенсибилизатору (таргетная фотодинамическая терапия) [64]. Первыми адресными молекулами, использованными для специфической доставки фотосенсибилизатора в опухоль, стали моноклональные антитела. Этот подход получил развитие после работы Mew D. и соавт., в которой была показана возможность прямой конъюгации гематопорфирина с моноклональным антителом к антигену миосаркомы и обнаружено преимущество полученного иммуноконъюгата перед гематопорфирином in vivo [65]. Дальнейшее развитие адресной фотодинамической терапии привело к созданию конъюгатов, использующих и другие нацеливающие модули, избирательно накапливающиеся в опухоли благодаря особенностям биохимии и сигнальных путей малигнизированных клеток. Так, в случае опухолей, зависимых в своем развитии от фолиевой кислоты, предложено использовать конъюгаты фотосенсибилизаторов с фолиевой кислотой. Разрабатываются пептидные лиганды, служащие средством доставки химических фотосенсибилизаторов в опухоли, клетки которых содержат на поверхности специфические интегрины и рецепторы гормонов [66]. Конъюгаты антител и фотосенсибилизаторов эффективно устраняют раковые клетки, несущие известные поверхностные маркеры, в опытах in vitro и in vivo [67]. Однако метод химической конъюгации фотосенсибилизаторов и антител имеет и ряд недостатков, таких, как низкая воспроизводимость синтеза конъюгатов, агрегация, наличие в препарате примесей неконъюгированного фотосенсибилизатора, потеря аффинности антитела к рецептору и изменение физических свойств фотосенсибилизатора [68]. Кардинальным решением этих проблем является создание генетически кодируемых гибридных молекул, содержащих и фототоксин, и направляющую часть. Это позволяет исключить необходимость химической конъюгации составных частей и сразу нарабатывать единые рекомбинантные молекулы постоянного состава, что предопределяет их стабильно воспроизводимую функциональность. Создание таких фотосенсибилизаторов стало возможным с открытием фототоксических белков, способных продуцировать активные формы кислорода при облучении светом определенной длины волны. На сегодняшний день известно два типа фототоксичных белков. Это белки KillerRed [69] и KillerOrange [70], производные GFP Aequorea victoria, и белки miniSOG [71] и miniSOG2 [72] - производные фототропина Arabidopsis thaliana. Дарпин 9_29 был использован для доставки к раковым клеткам фототоксичного белка miniSOG (miniSinglet Oxygen Generator). Этот белок получен из LOV2 (Light Oxygen Voltage) домена фототропина 2 (AtPhot2) путем сайт-специфического мутагенеза. LOV-домен в качестве кофактора содержит флавинмононуклеотид (FMN), который возбуждается под действием синего света, после чего энергия возбужденного состояния расходуется на образование ковалентной связи с консервативным цистеином-426. Замена цистеина-426, вступающего в эту реакцию, на глицин привела к изменению активности белка: в ответ на облучение синим светом вся энергия возбужденного состояния FMN расходуется на образование синглетного кислорода. После дополнительного мутагенеза был отобран вариант с квантовым выходом синглетного кислорода 0.47 ± 0.05. Спектр поглощения miniSOG имеет два пика, соответствующих 448 и 473 нм, максимумы спектра флуоресценции приходятся на 500 и 528 нм [71]. Исходно белок miniSOG был разработан как генетически кодируемый маркер для электронной микроскопии: miniSOG генерирует синглетный кислород в количествах, достаточных для инициации процесса окислительной полимеризации диаминобензидина (DAB). Полимер, получаемый при окислении DAB, взаимодействует с тетраоксидом осмия, и продукт этой реакции служит меткой для электронной микроскопии. Наряду с этим существует возможность использования miniSOG в качестве токсического модуля для изучения онтогенеза, избирательной инактивации белков и применения в фотодинамической терапии [73-75]. На основе анти-HER2-мини-антитела и фототоксичного белка miniSOG создан генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор 4D5scFv-miniSOG, который селективно уничтожает HER2-положительные клетки аденокарциномы молочной железы SK-BR-3 при облучении. Показано, что в отношении этих раковых клеток 4D5scFv-miniSOG проявляет цитотоксический эффект, в 8 раз превосходящий эффект химического конъюгата порфирина с таким же адресным доменом [76]. Однако суперпродукция 4D5scFv-miniSOG в бактериях приводит к тому, что большая часть целевого белка находится в тельцах включения, и его ренатурация идет неэффективно. Замена адресного модуля на HER2-специфичный DARPin 9_29 помогла решить проблему наработки целевого белка в бактериях в растворимом виде и добиться выхода 15 мг с 1 л жидкой культуры. DARPin-miniSOG показал избирательную токсичность в отношении HER2-сверхэкспрессирующих клеток аденокарциномы молочной железы SK-BR-3 in vitro [77]. Интересно, что благодаря флуоресцентным свойствам DARPin-miniSOG удалось оценить скорость интернализации и рециклизации HER2 [58], а также сравнить скорости интернализации 4D5scFv и DARPin 9_29 в комплексе с данным рецептором [78]. Тем не менее, для визуализации HER2-положительных раковых клеток предпочтительны другие флуоресцентные модули или красители, так как miniSOG имеет довольно низкий квантовый выход флуоресценции, а спектр излучения перекрывается с аутофлуоресценцией [79]. Дарпины могут также использоваться для доставки фототоксичных наночастиц, позволяя создавать многофункциональные противоопухолевые агенты, что мы обсудим далее. ПРИМЕНЕНИЕ ДАРПИНОВ ДЛЯ ДОСТАВКИ НАНОЧАСТИЦ Наноструктуры находят все более широкое применение в фундаментальных исследованиях, диагностике и терапии различных заболеваний. Некоторые виды наночастиц исходно обладают уникальными характеристиками, позволяющими использовать их для эффективного контрастирования патогенных очагов с помощью рентгеновского, инфракрасного, акустического и других видов электромагнитных излучений. Больше всего разработок ведется в области противоопухолевых наночастиц, в первую очередь из-за того, что несовершенная васкуляризация и дезорганизация клеточных контактов опухоли позволяют многим типам наночастиц проникать в опухоли более эффективно, чем в нормальные ткани [80, 81]. Преимуществом наночастиц перед низкомолекулярными и белковыми препаратами является возможность объединять в одном агенте несколько функций, в том числе нацеливать частицу на раковые клетки при помощи поверхностных модификаций. Часто с этой целью используют моноклональные антитела, однако для полноразмерных антител по-прежнему остаются актуальными проблемы их правильной ориентации и стандартизации числа антител на одной частице [82]. Помимо антител и их фрагментов для доставки наночастиц могут использоваться альтернативные скаффолды, белки, специфично поглощающиеся опухолью, такие, как факторы роста и трансферрин, аптамеры и низкомолекулярные вещества, например фолиевая кислота [56, 57]. Как и моноклональные антитела, дарпины могут использоваться для функционализации наночастиц [83]. DARPin 9_29 был использован для доставки в опухоль апконвертирующих наночастиц для фотодинамической терапии. Частицы состава NaYF4:Yb3+Tm3+/NaYF4, испускающие ультрафиолетовое излучение под действием инфракрасного излучения, были покрыты белком DARPin-mCherry [39], позволяющим визуализировать опухолевые клетки за счет флуоресцентного дальнекрасного модуля mCherry [40]. DARPin 9_29 и содержащий его DARPin-mCherry использованы также для покрытия золотых наночастиц диаметром 5 нм [41] и золотых наностержней [42]. Дарпин эффективно связывался с поверхностью частицы, формируя оболочку в среднем из 35 молекул белка, уменьшая склонность частиц к агрегации. При этом присоединение дарпина к частице оставляло свободным его участок взаимодействия с HER2, что обеспечивало избирательное связывание полученных наночастиц с HER2-гиперэкспрессирующими клетками [41]. Дарпины и белки на их основе успешно присоединяются к наночастицам при помощи карбодиимидной конъюгации. DARPin 9_29 был ковалентно присоединен к апконвертирующим радиоактивным наночастицам, покрытым сополимером малеинового ангидрида с 1-октадеценом (PMAO). Полученные наночастицы были использованы для визуализации опухоли молочной железы в ксенографтной мышиной модели и показали низкую побочную токсичность in vivo [84]. Тот же способ конъюгации был применен для функционализации апконвертирующих наночастиц белком DARPin-mCherry [43]. DARPin-PE40 был таким же образом присоединен к апконвертирующим радиоактивным наночастицам, что позволило визуализировать опухоли in vivo и эффективно уничтожать HER2-сверхэкспрессирующие клетки как in vitro, так и in vivo [85]. Введение уникального остатка цистеина позволило конъюгировать HER2-специфичный дарпин G3 с флуоресцеинмалеимидом, а затем соединить меченый дарпин с суперпарамагнитными наночастицами, покрытыми полимолочной кислотой, путем активации ее С-концевых карбоксильных групп карбодиимидом [86]. Дарпин был присоединен к наноструктурам и при помощи малеимидной конъюгации. Таким образом дарпин 9_29 был соединен с ETA-содержащими липосомами, функционализированными по поверхности реактивом Траута [87]. Таким образом, стандартные методики присоединения иммуноглобулинов к наночастицам применимы и к дарпинам. Однако дарпины могут включаться в наноструктуры и за счет встраивания в белки слияния, взаимодействующие с поверхностью частицы. Такой подход позволяет не только добиться желаемой ориентации связывающего модуля, но и собирать нацеливающие модули по принципу конструктора. Так, белок DARPin-Bn, состоящий из DARPin 9_29, гибкого линкера и рибонуклеазы барназы, использован для создания адресных кремниевых наночастиц. Эти наночастицы покрыты белком барстар, содержащим кремнийсвязывающий пептид (SBP-Bs), обеспечивающий прикрепление SBP-Bs к частице. Поскольку барназа и барстар связываются друг с другом с очень высокой аффинностью (Ka = 1014 M-1), их использование позволяло собрать функциональный слой наночастиц в растворе без применения конъюгации или реализовать стратегию претаргетинга, доставляя к клеткам адресный белок, к которому впоследствии присоединялась наночастица [88]. Слияние барназы с пептидом, связывающимся с поверхностью магнетита, позволило использовать тот же белок DARPin-Bn для функционализации наночастиц из магнетита и их доставки к раковым клеткам [89]. Таким образом, дарпины могут использоваться для создания адресных наночастиц наравне с антителами и их фрагментами. Более того, их малый размер и простота наработки в бактериях, в том числе в виде белков слияния, предоставляют уникальные возможности для сохранения аффинности и специфичности связывания за счет благоприятной ориентации молекулы. ПРИМЕНЕНИЕ ДАРПИНОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ОНКОЛИТИЧЕСКИХ ВИРУСОВ Молекулы, полученные из вирусов и бактерий, широко используются для создания противоопухолевых агентов [81], но для разрушения опухолевых клеток можно использовать и целые репликативно активные вирусы [90]. Онколитические вирусы - новый, очень своеобразный класс терапевтических препаратов, во многом действующих в организме пациента самостоятельно. Некоторые вирусы обладают природной тропностью к опухолевым клеткам, но чаще для создания онколитических агентов используют вирусы, поддающиеся перенацеливанию путем модификации поверхностных белков, такие, как вирус кори, аденовирус, вирус везикулярного стоматита, вирус коровьей оспы и вирус простого герпеса [90]. Можно изменить природную специфичность вируса за счет адаптерных биспецифических белков, как это успешно сделано для аденовирусов при помощи тримеризующихся дарпинов [10], однако чаще применяется слияние нацеливающих модулей с белками оболочки, поскольку в этом случае все свойства вируса кодируются его геномом. Дарпины, как и одноцепочечные антитела, могут использоваться для подобного изменения специфичности, причем их малый размер позволяет успешно встраивать последовательности, кодирующие дарпины в вирусные векторы. Белок оболочки вируса кори был модифицирован дарпинами, специфичными к HER2, EGFR или EpCAM. Полученные при этом вирусные частицы теряли тропность к естественным рецепторам и избирательно заражали клетки, избыточно экспрессирующие соответствующий опухолевый маркер. Вирусные частицы, несущие на поверхности дарпин, специфичный к HER2, вызывали лизис клеток более эффективно, чем вирус, функционализированный HER2-специфичным одноцепочечным антителом. Использование двух соединенных линкером дарпинов, узнающих HER2 и EpCAM, позволило создать биспецифические вирусные частицы, сохранившие высокую цитолитическую активность, характерную для моноспецифичных вирионов [91, 92]. Для заражения HER2-положительных опухолевых клеток использовали также аденоассоциированный вирус, покрытый модифицированным белком оболочки VP2, слитым с дарпином. Полученные вирионы специфически заражали HER2-положительные клетки и доставляли векторы с генами люциферазы либо тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK) к клеткам SK-OV-3 in vivo. Вирусные частицы, содержащие генотерапевтический вектор, кодирующий HSV-TK, в сочетании с генциклавиром эффективно подавляли рост ксенографтной опухоли, не вызывая гепатотоксичности [93]. Аналогичные вирусные частицы созданы с использованием EGFR-специфичных дарпина и аффибоди, и оба препарата показали избирательную токсичность в отношении EGFR-положительных клеток in vitro [94]. ПРИМЕНЕНИЕ ДАРПИНОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ХИМЕРНЫХ АНТИГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ Накопление знаний о функционировании иммунной системы позволило создать технологию адресной терапии рака, использующей цитотоксические лимфоциты - Т-лимфоциты и NK-клетки. Для этого лимфоциты трансдуцируют конструкциями, кодирующими химерный антигенный рецептор (Chimeric Antigen Recaptor, CAR), специфичный к опухолевому антигену и имеющий все необходимые для активации клетки домены, включая сигнальные последовательности костимулирующих молекул обычного рецептора [95]. При активации через химерные рецепторы лимфоциты секретируют провоспалительные цитокины и запускают апоптоз клеток-мишеней через рецептор FAS, инициирующий внешний путь активации апоптоза, и гранзимы, напрямую активирующие эффекторные каспазы и каспазонезависимые пути клеточной гибели [96]. Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-T) успешно борются с гематологическими опухолями, устойчивыми к химиотерапии, позволяя добиться полного излечения большого числа пациентов [97, 98]. Большинство разработанных на сегодняшний день химерных рецепторов содержат в качестве антигенраспознающего домена одноцепочечный вариант антитела, однако дарпины также могут определять специфичность CAR. Более того, дарпины имеют некоторые преимущества перед одноцепочечными антителами: они компактнее, а значит, кодирующие их последовательности занимают меньше места в трансдуцирующем лимфоциты вирусном векторе; дарпины более термодинамически стабильны; и наконец, их связывающая поверхность сформирована единственным полипептидом, в отличие от антител, чей паратоп образован двумя иммуноглобулиновыми доменами, происходящими из разных полипептидов, а значит, дарпины могут использоваться для создания мультиспецифичных CAR [99]. CAR-T с рецептором на основе HER2-специфичного дарпина G3 имели такой же уровень активации, как и клетки с химерным рецептором, содержащим одноцепочечное антитело FRP5. При этом дарпинсодержащие CAR-T проявляли высокую токсичность в отношении HER2-положительных раковых клеток и низкую - в отношении контрольных клеток, не экспрессирующих HER2 [99]. Сходные результаты получены при сравнении CAR-T-терапии на основе антитела 4D5 и дарпинов G3 и 9_29. Все исследованные типы клеток специфически узнавали HER2 и проявляли высокую цитотоксичность в отношении HER2-положительных клеток in vitro, наиболее выраженную у клеток с рецепторами на основе дарпина G3. В ксенографтной модели рака яичника различия между CAR-T на основе разных дарпинов проявились ярче: клетки с рецепторами на основе 4D5scFv и дарпина G3 лучше инфильтрировали опухоль и эффективнее подавляли ее рост [100]. В целом можно заключить, что CAR-T на основе дарпинов не уступают Т-лимфоцитам с искусственными рецепторами, содержащими одноцепочечные антитела, а сравнительная простота получения дарпинов и их мономерность облегчают создание химерных рецепторов к разным мишеням. Естественные киллерные клетки (NK) также могут служить агентами для распознавания опухолевых клеток при помощи химерных антигенных рецепторов. Их цитотоксичность основана на тех же механизмах, что и активность CD8+ Т-клеток, а природный путь активации дает CAR-NK некоторые преимущества перед CAR-T. NK-клетки не распознают пептид в комплексе с MHC I [101], что снижает риск запуска реакции трансплантант против хозяина (РТПХ). Это свойство уже используется в терапии рака переливанием донорских NK-клеток [102-104] или даже клеток стабильной линии NK-92 [105, 106], что увеличивает эффективность терапии даже без экспрессии клетками химерных рецепторов. Это позволяет создавать препараты на основе стабильных линий NK-клеток, не получая клетки от пациента [107]. К дополнительным преимуществам NK-клеток относится наличие собственных механизмов распознавания перерожденных клеток, которые позволяют им оставаться эффективными противоопухолевыми агентами даже при утрате или мутации химерных антигенных рецепторов. На сегодняшний день не создано противоопухолевых CAR-NK на основе дарпинов, однако их появление, скорее всего, не заставит себя долго ждать. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Дарпины были разработаны как каркасные белки, альтернативные антителам. Они нашли применение в большинстве технологий, где исходно использовались антитела, за исключением тех случаев, где необходимы свойства константной части молекул иммуноглобулинов. Такие преимущества дарпинов, как малый размер, отсутствие необходимости в иммунизации животных и легкость получения белков слияния, делают их перспективными инструментами для исследований и эффективными компонентами терапевтических и диагностических агентов. Не следует делать вывод, что альтернативные каркасные белки полностью заменят антитела, однако можно с уверенностью говорить, что они существенно дополнили набор используемых адресных белков, расширив спектр мишеней за счет другого строения паратопа и предоставив исключительные возможности для создания биспецифических и мультивалентных конструкций.

Об авторах

О. Н. Шилова

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.shilova.n@gmail.com
Россия

С. М. Деев

Email: olga.shilova.n@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы