Влияние липополисахарида из Rhodobacter capsulatus PG на развитие воспаления, вызванного различными штаммами вируса гриппа

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Эпидемии гриппа продолжают охватывать миллионы людей в мире, несмотря на использование рекомендуемых вакцин, эффективность которых оказывается ниже прогнозируемой [1, 2]. Вирусы гриппа А обладают высокой степенью изменчивости генома и продуцируют резистентные штаммы, которые некоторое время контролируются вакцинами или антивирусными препаратами общеукрепляющего действия. Разработка безопасных и эффективных вакцин остается важной проблемой здравоохранения. Взаимодействие вирусных компонентов с различными рецепторами активирует внутриклеточные пути, ответственные за секрецию IFN типа I, провоспалительных цитокинов и хемокинов. Ключевыми факторами, вовлеченными в распознавание вирусных лигандов, являются Toll-подобные рецепторы (TLR) клеток врожденного иммунитета. Локализованные на поверхности клеток TLR2 и TLR4 обнаруживают глико/липопротеины оболочки вирусов, а внутриклеточные и эндосомальные TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 - нуклеиновые кислоты [3, 4]. Toll-подобные рецепторы могут взаимодействовать с другими рецепторами, стимулируя ответ клеток врожденного иммунитета на патогены, включая вирусы гриппа [4]. TLR4 может активироваться DAMP (damage-associated molecular patterns), молекулярными структурами, высвобождаемыми из зараженных вирусом клеток [5]. Показано, что разные штаммы гриппа активируют клетки c использованием различных механизмов, что приводит к синтезу различных цитокинов и хемокинов [6, 7]. На мышах линии C57BL/6J показано, что соединение E5564 (Эриторан), синтетический аналог нетоксичного липида А из Rhodobacter sphaeroides, при определенной схеме введения защищает мышей от смерти, вызываемой вирусом гриппа H1N1, адаптированным к мышам [8]. Известно, что ядерный негистоновый белок HMGB1 (High Mobility Group Box1, или амфотерин), представляющий собой DAMP, высвобождается сравнительно поздно после начала инфекции и участвует в развитии как грамотрицательного сепсиса, так и осложнений при гриппе, взаимодействуя с MD-2 и активируя TLR4 [5, 9, 10]. Активация TLR4 приводит к цитокиновому шторму с огромным выбросом провоспалительных цитокинов, включая интерфероны, факторы некроза опухолей, интерлейкины и хемокины [11]. Фармакологическая блокада TLR4 Эритораном значительно снижает смертность мышей от птичьего гриппа [8]. Липополисахарид (ЛПС) из штамма фототрофной бактерии R. capsulatus PG (Rb.) [12], структура липида А которого аналогична структуре липида А R. sphaeroides, является антагонистом эндотоксинов и подавляет активацию синтеза широкого спектра провоспалительных цитокинов клетками крови человека [13], что указывает на его способность блокировать TLR4. Мыши являются основным инструментом для изучения иммунной системы и иммунных ответов человека. Однако существуют значительные различия между врожденной и адаптивной иммунной системами мыши и человека, которые отличаются соотношением клеток крови, составом плазмы, поверхностными рецепторами, уровнем экспрессии различных цитокинов и хемокинов и т.д. [14, 15]. Это следует учитывать при использовании мышей в качестве моделей болезней человека. В настоящей работе изучено влияние нетоксичного ЛПС Rb. на индукцию про- и противовоспалительных цитокинов, а также на выживаемость мышей при заражении животных различными штаммами вируса гриппа А. Данное исследование направлено на изучение особенностей развития воспалительных процессов, вызванных вирусами гриппа H1N1 и H5N1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использованы наборы для ИФА: Mouse TNF alpha Platinum ELISA, Mouse IL-6 Platinum ELISA, Mouse IL-10 Platinum ELISA, Mouse INF gamma Platinum ELISA (eBioscience, США), Mouse IFN beta ELISA Kit (PBL Assay Science, США). ЛПС Rb. получен в лаборатории ИФПБ РАН согласно методике, описанной ранее [16]. Вирусы В работе использовали штаммы вируса гриппа A: chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1) и Hamburg/2009 МА (H1N1), адаптированный к мышам. Вирусы культивировали в куриных эмбрионах. 50% инфекционную дозу вируса (TCID50) определяли титрованием в культуре клеток MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). 50% летальную дозу (LD50) определяли путем титрования на мышах. Эксперименты с высокопатогенным вирусом A/сhicken/Kurgan/5/2005 проводили в боксах с уровнем безопасности BSL-3. Мыши В работе использовали мышей Balb/c массой 10-14 г возрастом 36-38 дней без различия пола. Животные получены из питомника ФГБУН Научный центр биомедицинских технологий ФМБА. Все манипуляции с животными проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации [17] с соблюдением биологической этики при проведении экспериментов на лабораторных животных. Экспериментальная гриппозная инфекция у мышей, зараженных штаммом H5N1 вируса гриппа Мыши были разделены на шесть групп в зависимости от получаемых препаратов. Каждая группа включала не менее 12 животных. Животные пяти групп были заражены интраназально (по 50 мкл) под легким эфирным наркозом высокопатогенным вирусом гриппа птиц H5N1 в дозах от 10 до 105 TCID50 на мышь, что составляло от 10-1 до 103 LD50. Шестая контрольная группа оставалась незараженной. Через 24 ч все группы делили пополам. Одной половине животных ежедневно в течение последующих 4 сут вводили внутрибрюшинно физраствор по 500 мкл/мышь, другой - ЛПС Rb. по 400 мкг/500 мкл/мышь. Контролем служили мыши, которым не вводили никаких агентов. Схема эксперимента представлена на рис. 1. У выживших к концу эксперимента животных (14-й день) после эвтаназии в CO2-камере отбирали кровь, клетки крови осаждали, полученную сыворотку замораживали при -20°С до определения в ней титра антител к вирусу гриппа H5N1 методом ИФА. Экспериментальная гриппозная инфекция у мышей, зараженных адаптированным к мышам штаммом H1N1 вируса гриппа Использованный в работе пандемический вирус H1N1, адаптированный к мышам, был проведен через 20 пассажей в легких мышей и отличался от родительского штамма A/Hamburg/2009 (H1N1) делецией в нейраминидазе (NA) и мутациями в белках НА, NP, PA и PB1 (таблица). Вирус гриппа H1N1 обладает в 105 раз большей патогенностью для мышей, чем исходный родительский штамм. Мышей делили на три группы в зависимости от получаемых препаратов. Каждая группа включала не менее 12 животных. Две группы мышей были заражены интраназально (по 50 мкл) под легким эфирным наркозом вирусом гриппа H1N1, адаптированным к мышам, в дозах 10 и 300 TCID50 на мышь. Контрольная группа включала незараженных мышей. Через 2 сут после заражения все группы делили пополам. Одной половине ежедневно в течение последующих 4 сут вводили внутрибрюшинно физраствор по 500 мкл/мышь, другой - ЛПС Rb. по 400 мкг/500 мкл/мышь. Контролем служили мыши, которым не вводили никаких агентов. Схема эксперимента представлена на рис. 2. Через 5 ч после введения ЛПС Rb. у трех мышей каждой группы на 3, 4 и 5 день проводили забор крови после эвтаназии в CO2-камере. Кровь центрифугировали, полученную сыворотку замораживали при -20°С до определения содержания цитокинов методом ИФА. У выживших к концу эксперимента (12-й день) животных после эвтаназии в CO2-камере отбирали кровь, клетки крови осаждали, сыворотку замораживали при -20°С до определения уровня IgG1 и IgG2a антител к вирусу гриппа H1N1 методом ИФА. Определение содержания цитокинов Содержание цитокинов TNF-α, IL-6, IL-10, IFN-γ и IFN-β в образцах сывороток крови мышей, зараженных вирусом гриппа H1N1, определяли с помощью наборов для ИФА по методике, рекомендованной производителем. Оптическую плотность образцов измеряли с помощью иммуноферментного анализатора STAT FAX 3200 (Awareness, США) при длине волны 450 нм. Определение содержания антител к вирусу гриппа Для определения уровня антител на гемагглютинин (НА) вирусов гриппа H5N1 и H1N1 в сыворотке мышей в планшет (Nunc, MaxiSorp, США), сенсибилизированный фетуином, добавляли аллантоисную жидкость, содержащую 64 единицы HA одного из вирусов, выдерживали в течение ночи при 40°С, отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7.4 с 0.1% Твин-20 и блокировали буфером А (0.1% Твин-20, 0.2% БСА в ФСБ) в течение 1 ч. Для определения антител IgG1 и IgG2a каждую сыворотку титровали на двух разных планшетах. Блокирующий раствор удаляли, в лунки вносили по 100 мкл сыворотки мышей, инфицированных H5N1, в разведениях от 1 : 40 до 1 : 2560, или H1N1 в разведениях от 1 : 50 до 1 : 3200 в буфере А. Плашки инкубировали в течение 4 ч при 40°С, отмывали ФСБ и добавляли меченные пероксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши (Sigma, США), либо против IgG1 или IgG2a мыши и инкубировали при 40°С в течение 2 ч. Затем плашки отмывали ФСБ и окрашивали ортофенилендиамином. Оптическую плотность образцов измеряли с помощью анализатора иммуноферментных реакций АИФР-01 Униплан («Пикон», Россия) при длине волны 492 нм. Для исключения неспецифического связывания использовали контрольные лунки без вирусной подложки. Содержание антител в образцах выражали как разведение сыворотки, обеспечивающее сигнал, превышающий в 2 раза значение фона. Статистический анализ Для статистического анализа и графического представления данных использовали Microsoft Office Exel 2010 (плагин AtteStat) и OriginPro 7.5. Статистически значимые различия результатов оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при уровне значимости р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Состояние экспериментальных животных оценивали по выживаемости и изменению массы тела. Введение ЛПС Rb. мышам контрольной группы, а также заражение минимальной дозой 10 TCID50 вируса H5N1, независимо от введения ЛПС Rb., не влияло на выживаемость животных до конца эксперимента (14-й день) (рис. 3). Гибель животных в группах, инфицированных дозами 102 и 103 TCID50 вируса H5N1, начиналась на 8-е сут после заражения, в дозе 104 и 105 TCID50 - на 6-е. Все мыши, получившие 103, 104 и 105 TCID50 вируса гриппа, погибли к 10 сут после заражения независимо от введения ЛПС Rb. Дополнительное введение ЛПС Rb. мышам, инфицированным вирусом гриппа в дозе 102 TCID50, повысило их смертность (рис. 3). Кривые изменения веса показали, что введение ЛПС Rb. здоровым животным не влияло на их состояние и вес (рис. 4). Мыши, зараженные 10-102 TCID50 вируса, продолжали набирать вес в течение всего времени эксперимента. Инфицирование дозами 103-105 TCID50 заметно влияло на состояние животных, вызывая значительное воспаление и стремительное снижение веса. Дополнительное введение ЛПС Rb. на фоне заражения вирусом приводило к еще большему снижению веса (рис. 4). Введение ЛПС Rb. мышам контрольной группы и инфицирование дозой 10 TCID50 вируса гриппа H1N1 с последующим введением ЛПС Rb. не влияло на выживаемость животных до конца эксперимента (12-й день). В группе мышей, зараженных вирусом гриппа в дозе 300 TCID50, к концу эксперимента выжило 14% мышей, дополнительное введение ЛПС Rb. увеличивало смертность мышей (рис. 5). Анализ кривых изменения веса показал, что введение ЛПС Rb. здоровым мышам не влияло на состояние и вес контрольных животных. Мыши, инфицированные 10 TCID50 вируса H1N1, не проявляли признаков болезни и на 3-й день после инфицирования начинали быстро прибавлять в весе до окончания эксперимента (12-й день). Дополнительное введение ЛПС Rb. животным, инфицированным вирусом в этой дозе, приводило к снижению их веса после 7-го дня эксперимента. Инфицирование вирусом (300 TCID50) заметно влияло на состояние мышей, вызывая значительное воспаление и снижение веса. Введение ЛПС Rb. на фоне заражения вирусом ухудшало состояние животных и приводило к дополнительному снижению веса (рис. 6). Определение выживаемости и изменения массы животных, инфицированных вирусом гриппа H5N1 или H1N1, показало, что ЛПС Rb. не защищал мышей от летальной инфекции (рис. 3-6). Известно, что ежедневное (в течение 5-ти сут) внутривенное введение Эриторана через 2 сут после инфицирования защищало мышей от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Показано, что защита от DAMP, высвобождаемых к этому времени из инфицированных и разрушенных вирусом гриппа клеток, происходит по TLR4-зависимому механизму [18]. Тип вируса определяет механизмы ответа врожденного иммунитета на инфекцию. Пути сигнализации при инфицировании разными штаммами вирусов H5N1 и H1N1 различаются и определяют выживание и патологию развития воспаления [7]. Очевидно, в наших экспериментах инфекция развивается по молекулярным механизмам, отличным от активации клеток по пути TLR4. Возможно также, что использованная нами схема введения и концентрация ЛПС Rb. не эффективны для защиты от этих штаммов вируса. К признакам вирусной инфекции относятся повышенная индукция провоспалительных цитокинов и хемокинов, таких, как TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 [19], а также IFN-β и IFN-γ, обладающих противовирусным действием [20, 21]. Введение мышам ЛПС Rb. вызывало к 3 дню возрастание содержания TNF-α в сыворотке крови в 1.5 раза по сравнению с контрольными мышами, которое сохранялось примерно на том же уровне до 5-го дня эксперимента. Следует отметить, что содержание TNF-α в сыворотке контрольных мышей отличалось достаточно высоким значением (74.7±8.7 пг/мл), указывающим на сенсибилизированное состояние животных. Образование TNF-α в крови мышей, инфицированных вирусом гриппа, зависело от дозы вируса и имело положительную динамику в ходе эксперимента. Введение ЛПС Rb. инфицированным мышам усиливало продукцию TNF-α в их крови (рис. 7А). Динамика синтеза IL-6 во всех вариантах опыта была сходной. Уровень IL-6 значительно возрастал (от 1000 до 2000 раз) к 4-му дню эксперимента. У инфицированных мышей продукция IL-6 зависела от дозы вируса. Содержание IL-6 в ответ на введение ЛПС Rb. было сравнимым с содержанием у мышей, инфицированных вирусом гриппа. Введение ЛПС Rb. инфицированным мышам незначительно усиливало выработку IL-6 к 5-му дню эксперимента (рис. 7Б). Из полученных результатов видно, что вирусная инфекция вызывает дозозависимую индукцию синтеза провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6, возрастающую со временем. Эти цитокины вырабатываются, в основном, моноцитами и макрофагами в ответ как на бактерии, так и на вирусы, с использованием независимых путей передачи сигнала с привлечением разных поверхностных и внутриклеточных рецепторов, но одних и тех же адаптерных белков и транскрипционных факторов. Данные по индукции синтеза TNF-α и IL-6 показывают, что введение ЛПС Rb. мышам, инфицированным вирусом гриппа, усиливало провоспалительный ответ их иммунных клеток (рис. 7А, Б). Это усугубляло состояние животных, о чем свидетельствуют данные по выживаемости и изменению веса (рис. 5, 6). Введение мышам ЛПС Rb. вызывало повышение уровня противовоспалительного цитокина IL-10, превышающего к 5-му дню исходный уровень в 3 раза. Вирус гриппа, независимо от дозы, не влиял на выработку противовоспалительного цитокина IL-10. Введение ЛПС Rb. инфицированным мышам независимо от дозы вируса практически не влияло на индукцию синтеза IL-10 по сравнению с введением только ЛПС Rb. (рис. 7В). Иммунорегуляторный цитокин IL-10 - ключевой компонент системы, регулирующей чрезмерные иммунные ответы подавлением экспрессии провоспалительных цитокинов, таких, как TNF-α, IL-6 и IL-1 [22, 23]. Уровни продукции IL-10 в ответ на ЛПС значительно выше, чем при вирусной инфекции [24, 25]. Полученные результаты указывают на повышение уровня IL-10 в ответ на введение ЛПС Rb. как здоровым, так и инфицированным вирусом гриппа мышам. Это может свидетельствовать о том, что ЛПС Rb. способствует усилению противовоспалительных ответов клеток (рис. 7В). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии продукции IFN-γ в ответ на введение мышам ЛПС Rb. Вирус гриппа дозозависимо увеличивает содержание IFN-γ в крови мышей. Более того, дополнительное введение ЛПС Rb. мышам, инфицированным вирусом гриппа H1N1, снижало выработку IFN-γ в их крови (рис. 7Г). Не влияя на выработку IFN-γ, ЛПС Rb. вызывал к 4 дню эксперимента увеличение продукции IFN-β в 4 раза по сравнению с контрольным уровнем. На 5 день содержание IFN-β снижалось до исходного уровня. Содержание IFN-β в ответ на инфицирование вирусом H1N1 в дозе 10 TCID50 возрастало к 5 дню эксперимента в 3 раза. Вирус гриппа в дозе 300 TCID50 значительно усиливал индукцию IFN-β к 4 дню (в 16 раз) по сравнению с исходным значением. Введение ЛПС Rb. мышам, инфицированным 10 TCID50 вируса гриппа, усиливало, а в дозе 300 TCID50 снижало содержание цитокина по сравнению с мышами, инфицированными только вирусом гриппа (рис. 7Д). Полученные результаты показали, что количества IFN-γ и IFN-β, синтезируемые при использованной схеме введения ЛПС Rb., были недостаточны для эффективной противовирусной защиты против исследуемых штаммов вируса. IFN-β, входящий в состав вакцины против гриппа, действует как мощный адъювант и способствует индукции синтеза IgG2a и IgA, обеспечивая защиту от заражения. Образование IgG2a антител, характерное для ответа на вирусную инфекцию, оказывает защитное и нейтрализующее действие против вирусов гриппа. В ходе вирусной инфекции экспрессия IFN типа I и генерация IgG2a антител являются взаимосвязанными событиями биологической значимости для последующего защитного иммунитета [26]. Действие существующих вакцин против инфекции вирусами гриппа основано, главным образом, на индукции синтеза нейтрализующих антител в ответ на вирусный HA [27]. Определение уровня антител на HA вируса гриппа H5N1 в сыворотке мышей, показало, что чем выше заражающая доза вируса, тем выше титр антител в сыворотке инфицированных животных. Дополнительное введение ЛПС Rb. мышам, зараженным вирусом гриппа H5N1, приводило к достоверному росту титра антител (р < 0.001) в сыворотке крови (рис. 8). Определение уровней IgG1 и IgG2a антител в ответ на инфицирование вирусом гриппа H1N1 показало, что титры IgG2a значительно выше, чем IgG1 во всех группах животных. Введение ЛПС Rb. статистически значимо увеличивало уровень IgG2a в сыворотке по сравнению с мышами, инфицированными вирусом гриппа без дополнительного введения ЛПС Rb. (р < 0.05) (рис. 9). Врожденный иммунный ответ имеет решающее значение в борьбе с вирусами и играет ключевую роль в индукции и регуляции адаптивных иммунных ответов. По этой причине TLR-лиганды рассматриваются в качестве потенциальных адъювантов для включения в вакцинные препараты. Предполагается, что одновременная доставка TLR-лиганда и представляющего интерес антигена более эффективна, чем вакцинация смесью адъюванта и антигена [28, 29]. Из полученных результатов видно, что введение мышам ЛПС Rb. способствует продукции IFN-β (рис. 7Д), а в крови мышей, инфицированных различными дозами вируса гриппа, контролирует его уровень. IFN-β способствует выработке антител клетками приобретенного иммунитета [26]. Результаты данной работы также показывают, что дополнительное введение ЛПС Rb. приводит к выработке антител в крови животных, инфицированных вирусом гриппа А (рис. 8, 9). ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенной работы показано, что нетоксичный природный ЛПС Rb. способствует выработке иммуномодулирующего цитокина IFN-β как при самостоятельном введении, так и на фоне заражения штаммами вируса гриппа А/chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1) и А/Hamburg/2009 МА (H1N1), а также способствует образованию антител на НА этих штаммов в крови инфицированных животных.

Об авторах

С. В. Зубова

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: zusvet@rambler.ru
Россия

М. Ф. Ворович

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН; Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России

Email: zusvet@rambler.ru
Россия

А. С. Гамбарян

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: zusvet@rambler.ru
Россия

А. А. Ишмухаметов

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН; Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России

Email: zusvet@rambler.ru
Россия

С. В. Грачев

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН; Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России

Email: zusvet@rambler.ru
Россия

И. Р. Прохоренко

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН

Email: zusvet@rambler.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы