Механизмы действия производных трииндолилметана на липидные мембраны

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Основными проблемами современной антибиотикотерапии являются побочные эффекты от применения антибактериальных средств и растущая устойчивость болезнетворных бактерий к ним, что приводит к утрате клинической значимости ряда лекарственных средств. Одним из перспективных способов преодоления этих трудностей считается модификация природных антибиотических соединений с целью создания на их основе полусинтетических производных, проявляющих не только выраженную активность в отношении резистентных микроорганизмов, но и характеризующихся расширенным спектром действия по сравнению с исходными препаратами. Антибиотик турбомицин А, впервые выделенный в качестве продукта метаболизма Saccharomyces cerevisiae, обладающий относительно невысокой активностью в отношении грамположительных бактерий [1], является солью трис(индол-3-ил)метилия [2]. Показано, что введение алкильных заместителей по атомам азота индольных циклов антибиотика приводит к резкому увеличению антибактериальной активности, расширению спектра действия и появлению противоопухолевых свойств [3, 4]. Большой интерес представляют новые гомологи турбомицина А, трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия хлорид (ЛХТА-1975) и (1-(4-(диметиламино)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил)-1H-индол-3-ил)бис(1-пропил-1H-индол-3-ил)метилия хлорид (ЛХТА-2701), синтезированные в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе. ЛХТА-1975, кроме высокой антибактериальной активности в отношении мультирезистентных штаммов грамположительных бактерий, индуцирует также апоптоз опухолевых клеток посредством влияния на сигнальный путь NF-kB [3, 5, 6]. ЛХТА-2701, обладающий примерно таким же уровнем антибактериальной активности, как и ЛХТА-1975, значительно менее токсичен в отношении клеток человека (донорские фибробласты) [7]. В нашей работе изучены механизмы взаимодействия ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701 с липидными бислоями, в том числе имитирующими мембраны клеток-мишеней. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использовали: 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфосерин (ДОФС), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДФФХ), 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ПОФХ) и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ) (Avanti Polar Lipids, США); KCl, KOH, HEPES, пентан, этанол, гексадекан, диметилсульфоксид, капсаицин, кофеин (Sigma, США). Химические структуры производных трииндолилметана, ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701, синтезированных в Научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, представлены на рис. 1. Формирование плоских липидных бислоев и регистрация токов, протекающих через мембраны Формирование бислойных липидных мембран проводили по методу Монтала и Мюллера [8] путем сведения конденсированных липидных монослоев на отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей экспериментальную камеру на два (цис- и транс-) отделения. Объем каждого отделения - 1.5 мл, толщина тефлоновой пленки - 10 мкм, диаметр отверстия - около 50 мкм. Перед началом формирования мембраны отверстие в тефлоновой пленке обрабатывали гексадеканом. Плоские липидные бислои формировали из ДФФХ или ПОФХ, а также из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ. Эксперименты проводили при одинаковом ионном составе разделяемых мембраной водных растворов электролита (0.1 M KCl, рН 7.4). Кислотность растворов (рН 7.4) поддерживали буферной смесью 5 мМ HEPES-KOH. Тестируемые вещества, ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701, добавляли из раствора 10 мг/мл в смеси диметилсульфоксид : Н2О (1 : 1) в цис-отсек камеры до конечной концентрации, указанной в табл. 1. Для каждой системы «агент-липидный бислой» проведено не менее четырех независимых экспериментов (повторов). Для подачи трансмембранного напряжения и измерения протекающего через мембрану тока были использованы хлорсеребряные электроды, которые соединяли с растворами камеры через мостики с 1.5% агарозой в растворе 2 М KCl. Положительным считали потенциал, вызывающий поток катионов из цис- в транс-отделение камеры. Измерения и оцифровку трансмембранных токов проводили в режиме фиксации потенциала с помощью Axopatch 200B и Digidata 1440A (Axon Instruments, США). Для обработки данных использовали 8-полярный фильтр Бесселя (Model 9002, Frequency Devices) и частоту фильтрации 1 кГц. Обработку записей трансмембранных токов осуществляли с использованием программного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments). Статистический анализ полученных данных проводили при помощи программы Origin 8.0 (Origin Lab., США). Проводимость пор вычисляли как отношение силы тока, проходящего через одиночную пору, к трансмембранному напряжению. Гистограммы флуктуаций тока строили для значений трансмембранных токов, определяемых по изменениям амплитуды тока при открывании (закрывании) одиночных каналов. Для определения времени жизни каналов (времени их нахождения в открытом состоянии) рассматривали записи флуктуаций тока через мембраны с одним встроенным каналом. Для каждой из экспериментальных систем величины проводимости и времени жизни пор представляли как средние арифметические значения и их ошибки (среднее ± SE). Пороговые значения трансмембранного напряжения, которое вызывает разрушение мембран из ДФФХ до и после добавки производных трииндолилметана в мембраноомывающие растворы, Vbd, измеряли путем приложения к мембране напряжения в диапазоне от 0 до ± Vbd. Не выявлено различий между положительным и отрицательным трансмембранным напряжением. Определение изменений электрического потенциала на границе мембрана/водный раствор при введении тестируемых производных Ионофор нонактин добавляли в омывающие растворы с обеих сторон мембраны до конечной концентрации 10-7-10-6 М. Липидные мембраны формировали из ДФФХ, как описано выше, в 0.1 M KCl, 5 мМ HEPES-KOH, рН 7.4. Проводимость бислоя (G) находили по отношению стационарного трансмембранного тока к трансмембранному потенциалу, равному 50 мВ. Изменения электрического потенциала на границе мембрана/водный раствор при введении тестируемых производных (Δφd) определяли как: , где G0m и Gm - значения стационарной К+-проводимости бислоя, индуцированной нонактином до и после введения тестируемого агента. Тестируемые вещества ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701 добавляли в цис-отсек экспериментальной камеры из смеси диметилсульфоксид : Н2О (1 : 1) до 300 и 150 мкМ соответственно. Конфокальная флуоресцентная микроскопия липосом Гигантские одноламеллярные липосомы формировали из ПОФХ в электрическом поле c использованием коммерческого прибора Nanion vesicle prep pro (Германия) на паре стекол, покрытых проводящей смесью оксида индия и оксида олова, со стандартным протоколом (переменное напряжение с амплитудой 3 В, частота 10 Гц, 1 ч, температура 25°C) согласно [9]. Полученную суспензию липосом разделяли на аликвоты. В экспериментальные образцы вводили производные трииндолилметана в соотношении липид : агент = 10 : 1. Аликвоты уравновешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, 10 мкл полученной суспензии липосом помещали между предметным и покровным стеклами. Липосомы наблюдали в проходящем свете с помощью конфокального микроскопа Olympus FV3000 (Германия). Проводили независимые эксперименты (от 3 до 5), определяли средний диаметр липосом в каждой из экспериментальных систем (среднее ± SE). Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия липосом Гигантские одноламеллярные липосомы формировали из ДПФХ в электрическом поле как описано выше. Полученную суспензию липосом доводили до 800 мкл буферным раствором (5 мМ HEPES, pH 7.4). Конечная концентрация липида составляла 5 мМ. В экспериментальные образцы вводили ЛХТА-2701 и ЛХТА-1975 в соотношении липида к агенту 10 : 1 или 5 : 1. Контрольные образцы не модифицировали. Термограммы суспензий липосом получали при помощи дифференциального сканирующего микрокалориметра µDSC7 (Setaram, Франция). Нужное количество суспензии помещали в одну ячейку и нагревали с постоянной скоростью 0.2 К/мин, во вторую ячейку помещали эквивалентный объем буферного раствора. Воспроизводимость температурной зависимости теплоемкости достигали путем повторного нагревания образца сразу после охлаждения. Пики на термограммах характеризовали температурами предперехода (Tp) и основного перехода (Tm), шириной основного пика на полувысоте (T1/2), отвечающей кооперативности перехода ДПФХ из гель-состояния в жидкую фазу, а также изменением энтальпии главного фазового перехода (ΔН). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В работе изучена мембранная активность синтетических гомологов турбомицина А, ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701. В табл. 1 представлены характеристические параметры действия тестируемых агентов на липидные бислои. Добавка ЛХТА-1975 до концентрации 15 мкМ к мембранам из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ не вызывает появления видимых флуктуаций трансмембранного тока. Повышение концентрации агента вызывает нарушение стабильности бислоя и последующее его разрушение. Добавка ЛХТА-2701 до концентрации 8 мкМ не влияет на ионную проницаемость отрицательно заряженных мембран. Введение ЛХТА-2701 до концентрации 8-25 мкМ в раствор цис-отделения камеры вызывает рост проводимости мембраны, обусловленной образованием ион-проницаемых пор. На рис. 2А приведены примеры записей ступенеобразных флуктуаций тока, протекающего через ДОФС : ДОФЭ (50 : 50 мол%)-мембраны в присутствии ЛХТА-2701. Из рис. 2А видно, что поры характеризуются различной проводимостью. Проводимость пор варьирует от 5 до 100 пСм, а их время жизни - от 0.1 до 5 с. Дальнейшее повышение концентрации ЛХТА-2701 приводит к дезинтеграции липидного бислоя. В отличие от отрицательно заряженных мембран, включающих ДОФС, тестируемые вещества проявляют детергентное действие в отношении бислоев из нейтральных липидов, ДФФХ или ПОФХ, при на порядок более высоких концентрациях (табл. 1). Повышение концентрации ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701 до 200 и 130 мкМ соответственно приводит к нарушению стабильности незаряженных мембран и их разрушению. ЛХТА-2701 в концентрации 30-130 мкМ также характеризуется порообразующей способностью. Записи флуктуаций тока, соответствующих открыванию и закрыванию индуцированных этим веществом трансмембранных пор в ДФФХ- или ПОФХ-бислоях, представлены на рис. 2Б,В. Полученные результаты позволяют заключить, что тестируемые вещества по-разному действуют на модельные липидные мембраны: оба агента обладают детергентной активностью, в то время как ЛХТА-2701 также способен индуцировать трансмембранные поры. Следует отметить, что тип мембранной активности этих веществ не зависит от состава мембраны. Пороговая концентрация, при которой проявляется разрушительное действие тестируемых агентов, определяется поверхностным зарядом бислоя. Возможной причиной этого может быть положительный заряд тестируемых соединений, что способствует их сорбции на отрицательно заряженных мембранах из ДОФС и ДОФЭ. Кроме того, мембранная активность тестируемых производных практически не зависит от формы мембранообразующих липидов. Активность тестируемых веществ в отношении мембран из конусообразных молекул ДФФХ и цилиндрических молекул ПОФХ [10, 11] проявляется при близких концентрациях. Пороговая концентрация, вызывающая увеличение ионной проницаемости липидного бислоя, зависит также от вида агента. ЛХТА-2701 более эффективно, чем ЛХТА-1975, действует как на отрицательно заряженные, так и на нейтральные мембраны. Наибольшей электростабильностью в отсутствие каких-либо модификаторов обладают плоские липидные бислои из ДФФХ. Пороговое значение трансмембранного напряжения (Vbd), которое вызывает разрушение ДФФХ мембран, составляет 450 ± 30 мВ. Введение ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701 до концентрации 100 мкМ приводит к падению Vbd до 310 ± 30 мВ и 370 ± 30 мВ. Это свидетельствует о снижении электрической стабильности мембраны в присутствии этих веществ. Полученные результаты указывают на разупорядочивающее действие тестируемых агентов на липиды в бислое. Выдвинутое предположение независимо подтверждают результаты изучения влияния алкалоидов на мембранную активность ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701. Комплексные исследования с применением методов дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, рентгеновской дифракции, флуоресцентной зондовой спектроскопии и ЯМР показали значительное влияние капсаицина - алкалоида перца чили, на фазовые превращения мембранных липидов [12, 13]. Капсаицин существенно снижает температуру и кооперативность плавления димиристоилфосфохолина [14] и дипальмитоилфосфохолина [12]. При относительно высоких концентрациях алкалоида на термограмме наблюдается выраженная деконволюция пика, соответствующего главному фазовому переходу, что говорит о существовании нескольких смешанных алкалоид-липидных фаз. Более того, капсаицин усиливает способность фосфоэтаноламина формировать неламеллярные инвертированные гексагональные фазы. Предполагается, что адсорбция капсаицина увеличивает отрицательную спонтанную кривизну липидных монослоев [12, 15]. В мембранах из пальмитоолеоилфосфохолина капсаицин локализуется между липид-водной интерфазой и плоскостью, соответствующей положению двойной связи в ненасыщенной ацильной цепи липида [13]. Обнаружено, что снижение жесткости мембраны в присутствии капсаицина ответственно за модулирование ионных токов, индуцированных антибиотиком грамицидином А [16, 17]. На основании приведенных данных о разупорядочивающем действии капсаицина можно было ожидать увеличения детергентного действия тестируемых производных в его присутствии. Действительно, введение 0.4 мМ капсаицина в растворы, омывающие ДОФС : ДОФЭ (50 : 50 мол%)-мембраны, модифицированные ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701, приводит к 20-30% снижению концентрации веществ, вызывающей дестабилизацию бислоя. Взаимодействие другого растительного алкалоида, кофеина, с молекулами воды, связанными с соседними липидами, приводит к локальному увеличению гидратации, росту толщины мембраны и уменьшению ее текучести [18]. Эти результаты согласуются с данными калориметрии и молекулярной динамики, согласно которым кофеин значительно компенсирует разобщающий эффект местного анестетика тетракаина [19]. Аналогичный эффект отсутствует в случае ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701. Неспецифическое взаимодействие кофеина с ДОФС : ДОФЭ (50 : 50 мол%)-бислоями практически не влияет на мембранную активность тестируемых веществ. Невозможность компенсации кофеином разобщающего действия ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701 может указывать на существенное различие в локализации этих веществ и кофеина в мембране. По данным [18, 20] молекулы ксантина располагаются на границе между областями, занимаемыми липидными «головками» и «хвостами». По всей вероятности, благодаря алкильным заместителям молекулы ЛХТА способны погружаться в гидрофобную область мембраны, что приводит к росту латерального давления в этом регионе и его экспансии. Близость расположения в мембране тестируемых антибактериальных агентов и капсаицина может объяснить синергизм их разупорядочивающего действия. На рис. 3 представлены термограммы липосом из ДПФХ в отсутствие (контроль, черные линии) и в присутствии ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701 в суспензии при молярном соотношении липид : агент = 10 : 1 (красные линии) и 5 : 1 (синие линии). В отсутствие производных ЛХТА температура предперехода, Tp, составляет 32.6°C, температура главного фазового перехода, Tm, равна 41.2°C, ширина пика на полувысоте, характеризующая кооперативность перехода ДПФХ из геля в жидкое состояние, T1/2, составляет не более 0.6°С. Оба тестируемых агента существенно влияют на процесс плавления ДПФХ. В обоих случаях элиминируется предпереход. В табл. 2 приведены величины Tm и T1/2 при используемых соотношениях липид : агент. Следует отметить деконволюцию пика, соответствующего главному фазовому переходу ДПФХ, выраженность которой зависит от соотношения липид : агент (рис. 3). На рис. 4 представлен результат разложения пика, соответствующего главному фазовому переходу ДПФХ в присутствии тестируемых агентов, на отдельные составляющие. Присутствие нескольких пиков свидетельствует о сосуществовании различных фаз. Пик под номером 1 на термограммах (рис. 4А-Г) может быть ассоциирован с плавлением чистого ДПФХ, а два других - с наличием различных фаз, включающих как ДПФХ, так и ЛХТА (пик 2 и(или) 3 на рис. 4А-Г). Падение температуры и кооперативности перехода ДПФХ в присутствии тестируемых веществ может быть связано с их погружением в гидрофобную область бислоя, что приводит к увеличению площади, приходящейся на одну липидную молекулу, а следовательно, к относительному росту подвижности ацильных хвостов липидов. Полученные результаты также показывают, что с увеличением концентрации ЛХТА-1975 и ЛХТА-2701 происходит уменьшение изменения энтальпии главного фазового перехода (ΔН): при увеличении концентрации в 2 раза ΔН падает примерно на 10%. Уменьшение ΔН может быть связано с переходом части липида в неламеллярную фазу [21-23]. В частности, появление выраженного пика при 34°C после введения ЛХТА-1975 во всех используемых концентрациях может свидетельствовать о существенном изменении распределения латерального давления в мембране и формировании в присутствии этого агента небислойных липидных образований (пик 4 на рис. 4А,Б). Изучено также действие антибактериальных веществ на граничный потенциал плоских липидных бислоев из ДОФС : ДОФЭ (50 : 50 мол%). ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701 не влияют на стационарный трансмембранный ток, индуцированный комплексом ионофора нонактина с ионом калия (Δφd = 1 ± 1 мВ). Это указывает на неизменность распределения электрического потенциала на границе раздела мембрана/водный раствор при адсорбции тестируемых соединений. С использованием конфокальной микроскопии изучены везикулы из ПОФХ до и после введения в суспензию производных ЛХТА. Добавка к ПОФХ-липосомам ЛХТА-1975 или ЛХТА-2701 в молярном соотношении липид : агент = 10 : 1 не приводит к изменению сферической формы липидных везикул. Неизменность среднего диаметра липосом до (15 ± 6 мкм) и после введения (15 ± 7 мкм) показывает, что тестируемые агенты не вызывают заметного слияния или деления липидных везикул. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Установлено, что механизмы действия тестируемых соединений на модельные липидные мембраны различны: ЛХТА-1975 обладает детергентными свойствами, а ЛХТА-2701 характеризуется не только также детергентной активностью, но способен индуцировать поры в фосфолипидных мембранах. Различие механизмов действия определяется особенностями их строения: в молекуле ЛХТА-1975 все три заместителя при атомах азота индольных циклов одинаковы и представляют собой н-алкильные группы (пентильные), а ЛХТА-2701 содержит наряду с двумя алкильными заместителями (н-пропильными) малеинимидный цикл. Полученные результаты помогают понять механизм действия новых антибактериальных агентов, проясняют различия в селективности действия веществ на микроорганизмы и цитотоксичности для клеток человека, а также позволяют использовать модельные мембраны в дальнейшем изучении направлений модификации и совершенствовании структуры новых антибактериальных средств.

Об авторах

С. С. Ефимова

Институт цитологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: efimova@incras.ru
Россия

Т. Е. Тертычная

Институт цитологии РАН

Email: efimova@incras.ru
Россия

С. Н. Лавренов

Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе

Email: efimova@incras.ru

О. С. Остроумова

Институт цитологии РАН

Email: efimova@incras.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы