Применение полиоксиалканоатов в медицине и биологическая активность природного поли-3-оксибутирата

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Полиоксиалканоаты (ПОА) - это биоразлагаемые полиэфиры оксикарбоновых кислот, которые полу чают как путем химического синтеза, так и с помо щью бактериального биосинтеза. С начала 21 века наблюдается рост интереса к изучению этих поли меров и к внедрению их в медицинскую практику. В настоящее время как в научных исследованиях, так и в клинической практике используют синте тические поли-2-оксипропановую (полимолоч ная (ПМК), полилактиды), поли-2-оксиуксусную (полигликолевая (ПГК), полигликолиды) кисло ты, поли-6-оксикапролактон (ПКЛ) и природ ные поли-3-оксимасляную (поли-3-оксибутират (ПОБ)), поли-4-оксимасляную (П4ОБ), поли-3 оксивалериановую (поли-3-оксивалерат (ПОВ)) кислоты, поли-3-оксигексаноат (ПОГк), их сополимеры и близкие по структуре полимеры, такие, как поли п-диоксанон (ПДС) (рис. 1). Благодаря сходству химического строения эти полимеры обладают сходным сочетанием физико-химических и биоме дицинских свойств: способностью к биодеградации в организме без образования токсичных продуктов, биосовместимостью с органами и тканями человека, оптимальными физико-химическими свойствами (термопластичность, относительно высокая гидро фобность, специфические диффузионные свойства, относительно высокая прочность, пластичность), возможностью использования эффективных тех нологических процессов при их получении. Такое уникальное сочетание свойств этих полимеров спо собствует активному их использованию и внедре нию в медицинскую практику [1-4]. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ В МЕДИЦИНЕ ПОА стали активно использоваться в медицине еще с 70-х гг. прошлого века. Так, первые биоразлагае мые шовные нити марки «Викрил», изготовленные из полимеров, полученных с помощью химического синтеза, были выведены на рынок медицинских из делий еще в 1974 г. Уже используются или разраба тываются разнообразные изделия из ПОА: биоразла гаемые скобы, винты, пластины, штифты и шпагаты, биорассасываемые шовные нити и скобы для кожных степлеров, раневые и ожоговые покрытия, пародон тологические мембраны, хирургические сетчатые эндопротезы, хирургические заплаты для закрытия дефектов кишечника и перикарда, плаги-эндопро тезы для колопроктологии и герниопластики, проте зы сосудов, кардиоваскулярные стенты-эндопротезы, каркасные проводники для регенерации нервов, искусственные клапаны сердца и другие изделия. ПОА используются и в фармацевтике как компонент новых лекарственных форм, придающий им такие свойства, как направленная доставка, пролонгиро ванное действие, сниженная токсичность, увеличен ная стабильность [1-4] (рис. 2). Несмотря на то что уникальное сочетание свойств присуще всем представителям класса ПОА, в боль шинстве случаев в медицине используют такие син тетические ПОА (сПОА), как поли-2 оксипропановая (полимолочная кислота, или полилактид), поли-2 оксиуксусная (полигликолевая кислота, или поли гликолид), их сополимеры - полимолочно-со-полигликолевые кислоты (полилактид-со-гликолиды) (ПМГК), поли-6-оксикапролактон и поли-п-диоксанон (рис. 1). Это связано с гораздо более масштабным ис пользованием химического синтеза для получения полимеров медицинского назначения и более ран ней разработкой способа промышленного получения сПОА (ПМК, ПГК, ПКЛ и их сополимеров), более ранней сертификацией, проведением доклинических и клинических испытаний и введением этих поли меров в клиническую практику (в 70-х и 80-х гг. про шлого века). Важную роль сыграло также удобство применения этих полимеров, в частности, их быстрая биодеградация в тканях человека [4-6]. Однако ПМК, ПГК и их сополимеры являются син тетическими аналогами природных полиоксиалкано атов, поли-3-оксиалканоатов (пПОА). И хотя синте тические ПОА (в том числе ПМК, ПГК, ПМГК, ПКЛ) довольно часто называют биополимерами, имея в виду их способность к биодеградации и биосовместимость, это не вполне корректно, так как биополимерами при нято называть полимерные продукты жизнедеятель ности живых организмов: бактерий, растений, грибов, животных, т.е. биомакромолекулы природного проис хождения [7]. Так, поли-3-оксиалканоаты являются запасными полимерами многих видов бактерий [1], тогда как сПОА (ПМК, ПГК, ПМГК, ПКЛ и др.) в природе не встречаются [4, 8], хотя методами генетиче ской инженерии с использованием бактериальных штаммов-продуцентов синтезированы сополимеры поли-3-оксибутирата с полимолочной кислотой [9, 10], но это лишь подтверждает их искусственное про исхождение. Тем не менее, основные свойства этих полимеров сходны, хотя имеются и важные отличия, уже указанные выше. Природные поли-3-оксиалканоаты представля ют собой полиэфиры 3-оксиалкановых кислот, со ответственно ПОБ является линейным полиэфиром R-формы 3-оксимасляной кислоты (рис. 1). Различия разных пПОА определяются наличием бокового ра дикала: поли-3-оксибутирата, поли-3-оксивалерата, поли-3-оксигексаноата, поли-3-оксиоктаноата и т. д. (рис. 1). Все они довольно сильно различа ются по своим физико-химическим свойствам, та ким, как кристалличность, температуры плавления и стеклования, гидрофобность, пластичность, модуль упругости и другим. Причем при биосинтезе в бакте риях образуются, как правило, не чистые гомополи меры поли-3-оксивалерата, поли-3-оксигексаноата и других более длинноцепочечных мономеров ПОА, а их блок-сополимеры с ПОБ: поли-3-оксибутират со-3-оксивалерат (ПОБВ), поли-3-оксибутират со-3-гексаноат (ПОБГк), поли-3-оксибутират со-3-оксивалерат-со-3-оксигексаноат (ПОБВГк), поли-3-оксибутират-со-3-оксиоктаноат (ПОБОк), поли-3-оксибутират-со-4-оксибутират (ПОБ4ОБ) и др., но свойства этих сополимеров сильно отлича ются от свойств ПОБ и значительно зависят от моно мерного состава этого сополимера [11-13]. Как правило, для изучения биомедицинских свойств, в том числе биологической активности раз личных ПОА, проводят тестирование одного из мате риалов, предназначенного для разработки какого-то определенного медицинского изделия, т.е. используют технический подход. Но что, если рассмотреть биоме дицинские свойства ПОА на примере ПОБ как при родного родоначальника практически всех ПОА, ис пользуемых в медицине, с точки зрения тех функций, которые этот биополимер выполняет в природе? Т.е. использовать такое интересное направление в биоло гии, как биомиметика [14], тем более, что биомимети ческий подход в последнее время все активнее приме няют для изучения различных полимеров [15]. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ Биосовместимость полиоксиалканоатов и их биологическая активность Как правило, природные биополимеры, такие, как белки и пептиды, полисахариды, липиды, ну клеиновые кислоты, полипренолы, а также их со полимеры обладают выраженной биологической активностью, непосредственно связанной с их спе циализированными функциями: ферментативной, регуляторной, сигнальной, защитной, транспортной и многими другими. Более того, даже такие биопо лимеры, как липополисахариды или пектины, вы полняющие «нейтральные» функции - структурную или запасную, также могут обладать выраженной биологической активностью [16]. Соответственно медицинские изделия и лекарственные препараты на основе некоторых из этих биополимеров (колла гена, хитозана, полилизина) могут проявлять био логическую активность, иногда нежелательную, на пример, иммунотоксичность [17]. Однако, несмотря на интенсивное исследование, вопрос биологической активности как синтетических, так и природных ПОА остается противоречивым и недостаточно из ученным. С одной стороны, активное применение ПОА в медицине во многом обусловлено их высокой биосовместимостью, отсутствием или низким уров нем их токсичности, что, тем не менее, не исключает наличия биологической активности у этих полимеров [17]. Вместе с тем, основной причиной использования ПОА в медицине является их способность к биоде градации. Однако сам процесс биодеградации поли меров предполагает активное взаимодействие между полимером и окружающими его живыми клетками и тканями, зачастую участвующими в этом процес се, а также воздействие на клетки и ткани не только самого полимера, но и продуктов его биодеградации - олигомеров и мономеров. Кроме того, появляется все больше данных о собственной биологической ак тивности ПОА по отношению к различным клеткам и тканям человека и лабораторных животных. Все основные ПОА как синтетические (ПМК, ПГК, ПМГК и ПКЛ), так и природные ПОБ, (ПОБВ, ПОБГк, П4ОБ) обладают довольно хорошей био совместимостью по сравнению со многими другими материалами, достаточной для применения этих биоразлагаемых полимеров, в том числе, для изго товления имплантируемых изделий, контактирую щих с мягкими тканями, костью и кровью согласно ISO 10993 [2, 4, 17, 18]. Однако сопоставление тка невой реакции ПОБ и синтетических полиэфиров ПЛА, ПГА или их сополимеров выявило легкую или умеренную тканевую реакцию на ПОБ [2, 3], тогда как ПЛА, ПГА и ПЛГА нередко вызывали вы раженную хроническую воспалительную реакцию [18]. В большинстве случаев ПОБ и его сополимеры характеризовались хорошей биосовместимостью при использовании в качестве имплантируемых био материалов [19-21]. Стандартное определение ткане вой реакции на подкожную имплантацию ПОБ и его сополимеров в виде пленок, применяемое в протоко лах доклинических исследований, выявляет слабую или умеренную реакцию на чужеродный материал. В течение одного месяца формируется тонкая фи брозная капсула (около 100 мкм), которая, как по казано, рассасывается после биодеградации об разцов [19-22]. Во многих работах выявлено малое количество лимфоцитов или практически полное их отсутствие (в частности, Т-лимфоцитов) в обла сти имплантации ПОБ, что свидетельствует о зна чительном снижении или отсутствии иммунной реакции на этот полимерный биоматериал [23-26]. Показано, что подвергнутые глубокой очистке ПОБ и ПОБВ обладают также хорошей гемосовместимо стью, что позволяет использовать их для получения изделий, контактирующих с кровью: заплат стенки перикарда, легочной артерии и правого предсердия, биоразлагаемых кардиоваскулярных стентов [25-30]. Но особенно ярко биосовместимость ПОБ проявляет ся при использовании изделий на его основе, напри мер, пористых матриксов для регенерации костной ткани. При имплантации изделий из ПОБ в область дефекта костной ткани не происходит присущее мно гим биомедицинским материалам (например, ПМК) образование соединительнотканной капсулы, изо лирующей полимерный материал от костной ткани, т.е. ПОБ полностью интегрируется в костную ткань. В случае имплантации пористого матрикса из ПОБ наблюдается активная васкуляризация матрикса и образование в порах матрикса островков (балок) новой костной ткани из грануляционной ткани [23, 24, 31]. Определение уровня экспрессии различных цитокинов и других белков-маркеров воспаления в области имплантации изделий из ПОБ (и его сопо лимера ПОБВ) выявило сниженный (по сравнению с другими материалами) уровень экспрессии провос палительных цитокинов (интерлейкинов, фактора некроза опухоли, белка хемоаттрактанта моноцитов, индуцибельной NO-синтазы, С-реактивного белка) и повышенную экспрессию генов различных белков (коллагена I, кавеолина-1, цитокератина, гепаран сульфатпротеогликана, тромбомодулина, простаци клина) - маркеров регенеративных процессов в тка нях сердца и сосудов, кишечника, нервной, костной ткани [23, 25, 27, 28, 32-35]. Однако в некоторых слу чаях наблюдалась хроническая воспалительная ре акция на имплантацию изделий из ПОБ, например, прототипов стентов-эндопротезов. Следует отметить, что эти изделия получены плавлением или могли быть плохо очищены [36, 37]. На биосовместимость ПОБ и его сополимеров, как и в случае биодеграда ции, может сильно влиять способ формования изде лий из этого полимера, особенно при использовании экструзии или формования из расплава. Плавление вызывает перекристаллизацию полимера и резко замедляет диффузию воды в полимерной матрице, а именно вода играет ключевую роль в формирова нии ультраструктуры ПОБ, которая сильно влияет на его биологические свойства [38]. Благодаря своей высокой биосовместимости ПОБ представляет собой перспективный материал для кле точной биологии и инженерии. Хороший уровень кле точной адгезии, пролиферации и жизнеспособности в ходе культивирования in vitro на пленках или пори стых матриксах из ПОБ проявляют различные клетки млекопитающих: фибробласты человека и мыши, ме зенхимальные стволовые клетки (МСК) крысы, мыши и человека, остеобласты костной ткани кролика, осте огенные клетки саркомы человека, хондроциты су ставного хряща кролика и клетки гладкой мускула туры кролика [3]. Нано- и микрочастицы из ПОБ и его сополимеров не оказывают цитотоксического эффекта на различные клетки вплоть до концентрации 1 мг/мл [39, 40], а к их эндоцитозу способны не только макро фаги, но и остеобласты, фибробласты и опухолевые эпителиальные клетки [41-45]. Тогда как цитотоксич ность наночастиц из ПМК и ПМГК не проявлялась лишь до концентрации 66-100 мкг/мл, но была вы раженной при концентрации более 100 мкг/мл [41, 46]. Водорастворимые олигомеры ПОБ, состоящие примерно из 25 остатков 3-оксибутирата, конъюги рованных с липоевой кислотой, также не оказывали цитотоксического действия in vitro на кератиноциты в концентрации до 9 мкг/мл [47]. Благодаря своей высокой биосовместимости ПОБ и другие ПОА могут использоваться для изготовле ния различных конструкций (пористых матриксов, микросфер, каркасов) для экспериментального моде лирования 3D-роста in vitro различных клеток чело века и млекопитающих: мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов, различных линий опухолевых клеток, что позволит создавать экспериментальные модели различных заболеваний, прежде всего опу холей [48] (рис. 3). Вместе с тем, следует принимать во внимание, что такие характеристики полимеров, как химиче ский состав, морфология поверхности, поверхност ная энергия и гидрофобность, оказывают большое влияние на жизнеспособность клеток и их рост [49], например, химическая обработка поверхности изде лий из ПОБ способствует росту клеток на них [3]. Биодеградация полиоксиалканоатов и их биологическая активность Скорость биодеградации широко используемых сПОА, ПМК и ПГК значительно выше, чем других ПОА, так как она происходит преимущественно пу тем гидролитической деструкции. Такой механизм деструкции сПОА является причиной многих про блем их медицинского использования. Так, продук ты деградации ПМК, ПГК и ПМГК, образующиеся в процессе быстрого гидролиза, не успевают утили зироваться в организме, и вблизи имплантата резко снижается рН. Хроническое раздражение ткани в ре зультате снижения рН считается серьезной пробле мой применения полимерных имплантатов на основе ПМК, ПГК и ПМГК, оптимальное решение которой не найдено до сих пор [18]. Хроническое воспаление как ответ на деструкцию полилактидов и полигли колидов может усугубляться иммунным ответом на высвобождение нестереорегулярных водораство римых олигомеров - продуктов деградации поли меров данного класса [18, 50]. Показана цитотоксич ность продуктов гидролитической деструкции ПМК и ПГК [18, 41, 46]. В формировании воспалительной реакции на имплантированный ПМГК большую роль играют дендритные клетки, которые этот полимер способен активировать [51]. Такой воспалительный ответ является, в частности, одной из причин тор можения биодеградации внутрикостных импланта тов из этих полимеров благодаря их «консервации» в соединительнотканной капсуле, что вызывает раз личные осложнения: миграцию имплантатов в кости, образование свищей, отторжение имплантата и др. [18]. Чтобы устранить хроническое воспаление при ходится прибегать к различным ухищрениям. Так, в изделия из ПМГК вводят противовоспалительные лекарственные средства (дексаметазон, куркумин) [52, 53], антитела к провоспалительным цитокинам (интерферону-γ) [54], используют мезенхимальные стволовые клетки [51]. Природные поли-3-оксиалканоаты гораздо более устойчивы к гидролизу в водной среде [55], в том чис ле в присутствии различных эстераз [55-57], причем в живых тканях скорость биодеструкции может быть многократно выше, чем в водной среде в модельных условиях in vitro, даже в присутствии липолитиче ских ферментов (например, липазы) в высоких кон центрациях [22]. Появляется все больше данных в пользу того, что биодеградация ПОБ и его сополимеров проис ходит преимущественно за счет фагоцитирующей активности специализированных клеток - макро фагов, а также гигантских клеток инородных тел (ГКИТ) и остеокластов, т.е. имеет место специализи рованная биодеградация этих полимеров. Введение в организм изделий из ПОБ и его сополимеров вы зывает привлечение в область повреждения ма крофагов, которые плотно покрывают полимерный материал при формировании вокруг него соедини тельнотканной капсулы и активно участвуют в про цессах его биодеградации. Полимерный биоматериал подвергается воздействию межклеточной жидкости и клеток, что может приводить к отщеплению от него микро- и наночастиц, олигомеров и мономеров [3, 19, 57-59]. Причем клетки вызывают поверхностную эрозию полимера, без существенного изменения его физико-химических свойств, которое происходит при гидролитической деструкции полимера в объеме. Показано, что после удаления макрофагов и ГКИТ на поверхности полимера оставались следы эрозии в виде углублений диаметром 20-50 мкм [25, 26, 60, 61]. Низкая скорость биодеструкции приводит к сни жению концентрации продуктов распада вблизи им плантата, среди которых в случае ПОБ доминирует 3-гидроксимасляная кислота, гораздо более слабая (pKα = 4.41), чем основной продукт биодеградации ПМК и ПМГК - молочная кислота (pKα = 3.73). Соответственно при биодеградации ПОБ и его сопо лимеров не происходит закисления среды [18-20]. При этом наблюдается активация макрофагов полимерным материалом, что способствует их фа гоцитирующей активности [36, 40, 62]. Важную роль играет адгезия макрофагов на поверхности поли мерного материала. Показано, что биодеградация полимерных мембран происходит только тогда, когда на их поверхности адгезируются макрофаги. Если же макрофаги не имеют физической возмож ности прикрепиться к мембране, то деградации по лимера не происходит [63]. Макрофаги и остеокласты прочно прикрепляются к полимерным пленкам ПОБ и пролиферируют на них [62]. Отмечено значитель ное увеличение экспрессии липаз двух типов по сле 7 и 14 дней контакта ПОБ с тканями животных, при этом в печени увеличивалась экспрессия липаз этих же типов. Более того, наблюдалось повышение синтеза таких расщепляющих ферментов, как липа за 1-го типа, липаза 2-го типа, амилаза, химотрипсин и трипсин в стенке желудка непосредственно в об ласти контакта тканей с заплатой на основе ПОБ [34]. В тканях крыс найдены два фермента, расщепляю щих ПОБ: сериновая эстераза печени с максималь ной активностью в щелочной среде (рН 9.5) и эстераза почек, активная в нейтральной среде [64]. В опытах с частицами ПОБ низкой молекулярной массы по казано участие макрофагов в биодеградации ПОБ [40]. Установлено, что макрофаги и в меньшей степе ни фибробласты способны фагоцитировать частицы ПОБ размером 1-10 мкм. При высоких концентраци ях частиц ПОБ (>10 мкг/мл) фагоцитоз сопровожда ется токсическим действием и изменением функцио нального состояния макрофагов, но не фибробластов [40], тогда как наночастицы (15-250 нм) из ПОБ и его сополимеров не оказывали значительного цитоток сического действия на макрофаги даже при такой большой концентрации, как 1 мг/мл, в отличие от на ночастиц ПМК [41]. Фагоцитоз микрочастиц ПОБ со провождался увеличением продукции оксида азота (NO) и фактора некроза опухолей альфа (TNF-α) в активированных макрофагах, а при фагоцитозе большого количества микрочастиц происходила ги бель макрофагов. Показано также, что фагоцитоз частиц ПОБ постепенно снижается благодаря актив ному процессу биодеградации ПОБ [40]. Интересно, что к эндоцитозу микрочастиц из низкомолекуляр ного ПОБ in vitro способны не только макрофаги, но и остеобласты. Причем при сокультивировании этих клеток фагоцитирующую способность остеобла стов, как и их остеогенную активность (активность щелочной фосфатазы), стимулировали макрофаги, фагоцитирующие полимерные микрочастицы [40]. Таким образом, контакт с живыми тканями по лимеров даже с высокой биосовместимостью может сочетаться с развитием естественной воспалитель ной реакции организма на имплантацию чужерод ного тела, активацией макрофагов и остеокластов при расщеплении ими полимера. Однако следует от личать такую биологическую активность ПОА от соб ственной биологической активности полимеров, свя занной с их специфическими свойствами. Собственная биологическая активность полиоксиалканоатов ПОБ и его сополимеры, по-видимому, обладают и собственной биологической активностью. Они, как уже отмечено, активируют при имплантации клетки иммунной системы, вызывая секрецию ими провоспалительных цитокинов [34, 35], что характер но для обычной тканевой реакции на имплантацию практически любых материалов, особенно биодегра дируемых. Показано, что изделия из ПОБ (непле теные заплаты, пористые матриксы) способствуют регенерации тканей различных органов: костной, сердца и сосудов, нервов, кишечника. Использование изделий из ПОБ приводит к высокой васкуляриза ции в зоне восстановления дефектов ткани [23-28, 32, 35, 65]. На критических (теменная кость черепа крысы) и некритических (бедренная кость крысы) моделях костных дефектов показано, что пористые матриксы из ПОБ способствуют регенерации кост ной ткани. На всех стадиях регенерации костного де фекта отмечена минимально выраженная тканевая реакция на имплантацию, связанная с постепенной биорезорбцией полимерного материала, активная васкуляризация матриксов и прорастание образу ющейся костной ткани в порах матрикса из ПОБ. На регенерацию костной ткани в матриксе из ПОБ указывает также экспрессия остеогенных маркеров, например, коллагена типа I [23, 24]. Мы наблюдали равномерное появление новообразующейся костной ткани по всему объему пористого биополимерного матрикса в виде островков, а не с краев, при этом вокруг биополимерного материала не образовыва лась фиброзная капсула, что указывает на его пол ную интеграцию с костной тканью [24, 65]. Все это свидетельствует о превосходной биосовместимости ПОБ с костной тканью, о выраженной остеокон дуктивной и даже остеоиндуктивной способности. Биологическую активность ПОБ и его сополимеров, полученных бактериальным биосинтезом, связы вают с возможностью плохой очистки полимерно го материала от бактериального липополисахарида или ДНК. Однако даже очень хорошо очищенный по лимер способен активировать клеточный ответ [36]. Биологическая активность пористых матриксов из ПОБ и его сополимеров (ПОБВ, ПОБГк, ПОБВГк) показана и на клеточном уровне in vitro. Так, терпо лимер ПОБВГк стимулировал пролиферацию линии HaCaT кератиноцитов человека при росте на поли мерных пленках, полученных осаждением из раство ра. Исследование механизма стимуляции пролифе рации клеток с использованием наночастиц из этого биополимера показало, что добавление наночастиц из ПОБВГк в концентрации 0.02-0.1 г/л стимулиро вало увеличение тока ионов кальция в цитоплазму, что является одним из основных сигнальных путей активации деления клеток. Продукт деградации ПОА мономер 3-гидроксибутират (D-3-гидроксимасляная кислота, 3ГБ) также самостоятельно вызывает акти вацию пролиферации кератиноцитов линии HaCaT человека и фибробластов мыши L929 в концентра ции от 0.01 до 0.1 г/л (0.1-1.0 мМ) по механизму уве личения концентрации ионов кальция в цитоплазме клетки, а также подавляет апоптоз и некроз фибро бластов [66-68]. Подобная активность 3ГБ неудиви тельна, поскольку это кетоновое тело - естественный метаболит млекопитающих, обладающий выражен ной биологической активностью [16]. Однако биологической активностью могут обладать не только 3ГБ, но и олигомеры ПОА. Так, олигомеры ПОБ и его со полимеры с 4-оксибутиратом и 3-оксигексаноатом (с длиной цепи 20-25 мономеров) не токсичны для кле ток (до концентрации 20 мкг/мл) и стимулируют пролиферацию, подавляют апоптоз, выброс кальция в цитоплазму и образование межклеточных контак тов между бета-клетками поджелудочной железы мышей [69]. Показано, что скаффолды из ПОБ и его сополиме ров (ПОБВ, ПОБГк) стимулируют дифференцировку остеобластов и мезенхимальных стволовых клеток человека, крысы, кролика (выделенных как из жи ровой ткани, так и из костного мозга) в остеогенном направлении при росте клеток на них [23, 24, 39, 63, 70-72]. Дифференцировка МСК при росте на скаф фолдах из пПОА подтверждена изменением мор фологии клеток (рис. 4), угнетением их пролифера ции, увеличением активности щелочной фосфатазы, отложением солей кальция в клетке [24, 39, 70-72] и экспрессией маркеров остеогенной дифференци ровки и формированием костной ткани (щелочной фосфатазы, коллагена типа 1, Runx2, остеокальци на, остеопонтина) с помощью иммуноферментных методов и ПЦР [23, 24, 70]. Впрочем, в некоторых работах индукция остеогенной дифференцировки при росте эмбриональных предшественников осте областов на матриксах не была подтверждена [73]. Здесь необходимо отметить, что значительное вли яние на рост и дифференцировку МСК могут вли ять их физико-химические свойства, а также ми кроструктура и топография конструкций из этих полимеров, на которых растут клетки. Этот эффект может даже нивелировать воздействие биоактив ных молекул, стимулирующих рост или дифферен цировку клеток в том или ином направлении [49, 74, 75]. Влияние ПОА на дифференцировку МСК также может быть связано с биоактивностью про дукта их биодеградации - 3ГБ. Так, 3ГБ в концен трации 0.005-0.1 г/л (0.05-1 мМ) вызывает остеоген ную дифференцировку остеобластов мыши линии MC3T3-E1, определенную по увеличению актив ности щелочной фосфатазы, отложению кальция (тест на краситель Ализариновый красный S) и экс прессии остеокальцина. Остеоиндуктивное действие 3ГБ in vivo показано на модели остеопороза у самок крыс с удаленными яичниками. Тем не менее, 3ГБ в меньших концентрациях не оказывал подобного действия, а при медленной биодеградации ПОА 3ГБ образуется в концентрациях, гораздо меньших 0.05 мМ [76]. ПОБГк вызывает также дифференциров ку МСК в хондрогенном направлении, что показано по изменению экспрессии хондрогенных генов-мар керов МСК: аггрегана, col2, sox9, col10 и pthrp [74]. В других исследованиях показано, что ПОБ, ПОБГк, ПОБВГк, ПОБО и их композиты, а также ПМК сти мулируют дифференцировку МСК в нейрогенном направлении, что выражается в изменении морфо логии клеток и экспрессии ими генов специфических белков: нестина, фибриллярного кислого белка глии и βIII-тубулина [77, 78]. Теоретически это могло быть связано с показанным ранее нейропротективным действием 3ГБ, если бы не тот факт, что позитивное воздействие 3ГБ на нервную систему обусловлено питательной (энергетической) функцией жирных кислот, в том числе 3ГБ, в нейронах и проявляется при очень больших дозах этих веществ [79]. Однако показано также, что 3ГБ стимулирует образование щелевых контактов между нейронами для переда чи электрического сигнала, чем может объяснять ся вызываемое им улучшение памяти и обучаемо сти [80]. Интересно, что реализация эффектов ПОА на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз кле ток может осуществляться через интегрины - мо лекулы межклеточных контактов и распознавания. Дифференцировка МСК и апоптоз остеобластов осу ществляются по каскадному механизму, который за пускается при взаимодействии ПОА с интегринами на поверхности клетки [81, 82]. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ПРИРОДНЫЕ ФУНКЦИИ ПОЛИ-3-ОКСИБУТИРАТА Поли-3-оксибутират как запасной полимер бактерий Природные поли-3-оксиалканоаты возникли в про цессе эволюции, прежде всего, как резервные биополимеры, т.е. такие полимеры, которые предназначены для биодеградации ферментными системами жи вых организмов с целью извлечения из них энергии и углерода для обеспечения жизнедеятельности кле ток и биосинтеза ими других биомолекул. Способность к синтезу резервных пПОА, преимущественно ПОБ, широко распространена у прокариот, сотни видов бактерий используют этот биополимер в качестве за пасного вещества. Для большинства микроорганиз мов накопленные пПОА служат источником углеро да и энергии при их недостатке. Бактерии, способные к синтезу пПОА, запасают биополимер в цитоплазме в виде дискретных включений (гранул) обычно от 100 до 800 нм в диаметре (рис. 5). Роль пПОА, прежде все го ПОБ, как резервного материала бактерий подробно освещена в обзоре Anderson и Dawes [83]. Более того, к синтезу ПОБ способны или об ладают ферментами (и их генами) его биосинтеза (прежде всего, ПОА-полимеразой) симбиотиче ские и инфекционные бактерии человека, такие, как Agrobacterium, Clostridium, Ralstonia, Bacillus, Burkholderia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Mycobacterium, Acinetobacter, Sphingomonas, Fusobacterium, Neisseria, Streptomyces, Bordetella, Rickettsia. Некоторые из этих бактерий, например Pseudomonas sp., способны к синтезу не только ПОБ, но и различных его сополимеров [84]. Многие из этих бактерий формируют значительную долю нормаль ной микробиоты кишечника, играющего важнейшую роль в формировании иммунитета человека, и дру гих органов (ротовой полости, легких, кожи) или яв ляются возбудителями многих широко распростра ненных инфекционных заболеваний. Соответственно иммунная система человека распознает антигены этих бактерий, вероятно, с момента формирования иммунитета в младенчестве. Одним из таких обыч ных и привычных для иммунитета антигенов явля ется ПОБ, чем, по-видимому, можно объяснить вы сокую биосовместимость этого биополимера и его синтетических аналогов, близких по своей структуре и физико-химическим свойствам. Однако с липопо лисахаридом иммунная система также контактирует на этапе формирования иммунитета, что не меша ет этому биополимеру быть мощным стимулятором иммунитета. А ПОБ является таким же продуктом как симбиотических, так и инфекционных бактерий. Возможно, в организме человека ПОБ выполняет какую-то функцию, отличную от функции запасного вещества у представителей микробиоты. Эндогенный поли-3-оксибутират в тканях животных и его предполагаемые функции Вопреки мнению, что ПОБ синтезируется только в клетках прокариот, этот биополимер обнаружен группой Reusch у организмов практически всех ти пов [85]. Короткоцепочечный комплексообразующий ПОБ (кПОБ, не более 30 мономеров 3-оксибутирата) и среднецепочечный, или олиго-ПОБ (оПОБ, 100-200 мономеров 3-оксибутирата), найдены в различных органах и тканях млекопитающих, включая челове ка (а также коровы, овцы, свиньи) и птиц (курицы, индейки), - в крови, мозгу, сердце, печени, почках, сосудах, нервах, липопротеиновых частицах, тром боцитах и др. Концентрация кПОБ/оПОБ варьирует от 3-4 мкг/г в нервных тканях и мозгу до 12 мкг/г в плазме крови. Концентрация оПОБ в плазме крови человека может изменяться в достаточно широких пределах - от 0.6 до 18.2 мкг/мл при усредненном значении 3.5 мкг/мл [85]. Следует отметить, что про межуточный продукт биодеградации ПОБ - 3ГБ - является так называемым кетоновым телом. В нор ме он содержится в крови и тканях млекопитающих в концентрациях 0.3-1.3 мМ, а при патологических состояниях и намного выше [86]. Reusch с соавт. [85] предполагают, что ПОБ, поми мо роли запасного вещества и энергетического депо у бактерий, выполняет также и различные регулятор ные функции у эукариот и прокариот. При этом ПОБ (а именно короткоцепочечные кПОБ и оПОБ) влияет на функционирование белковых рецепторов и кана лов, а также ДНК путем образования с ними как не ковалентных, так и ковалентных связей. Наличие ПОБ в различных тканях человека эти исследовате ли объясняют существованием неких биохимических механизмов синтеза этого биополимера. Показано, что кПОБ и оПОБ образуют нековалентные комплек сы с неорганическими полифосфатами и ионами каль ция, которые могут функционировать как небелковые каналы, способные к проведению неорганических ио нов через плазматическую мембрану. Эти структуры образуют также нековалентные комплексы с белками ионных каналов и входят в их состав, а также влияют на функции рецепторов и каналов за счет ковалентно го связывания. Так, олигомеры ПОБ ковалентно свя зываются с кальциевой АТР-азой плазматической мембраны эритроцитов человека, формируя одновре менно комплекс с неорганическими фосфатами [86]. Получены косвенные подтверждения существования определенной физиологической функции у конъюга тов кПОБ с белками. Так, активность противоопухоле вых пептидов DP18L усиливается при их конъюгации с 3-гидроксидеканоатом [87]. Предполагаемые функции поли-3-оксибутирата в микробиоте животных Однако ПОБ может выполнять и другие функции в организме человека, не требующие его обязатель ного синтеза. Можно предположить, что ПОБ каким то образом участвует во взаимодействии бактерий микробиоты кишечника, где этот биополимер син тезируется, с клетками иммунной системы и эпите лием слизистой кишечника. В пользу этой версии свидетельствует особая роль ПОБ в симбиозе бак терий микробиоты и организма животного-хозяина. Например, синтез ПОБ играет важную роль во взаи модействии бактерий рода Burkholderia с их организ мом-хозяином клопом Riptortus pedestris, повышая устойчивость бактерий к иммунной системе этого клопа [88]. Показано также, что биосинтез ПОБ имеет большое значение для микробиоты голотурии (мор ской огурец) Apostichopus japonicus. Синтез ПОБ, по-видимому, модулирует микробиоту голотурии, что способствует многократному увеличению разме ров животного [89]. Заслуживает внимания работа, в которой изучали способность гистамина регулиро вать синтез низкомолекулярного кПОБ у Escherichia coli. Гистамин играет важную роль как средство ком муникации бактерий с организмом-хозяином и регу лятор иммунной системы кишечника, позволяющий бактериям быть «своими» для организма-хозяина, поэтому влияние гистамина на синтез кПОБ может свидетельствовать о вовлечении этого биополимера в процессы адаптации и сосуществования с орга низмом-хозяином [90]. Более того, показана эффек тивность ПОБ при инфекционных заболеваниях: использование в качестве корма порошка ПОБ за щищало рачков Artemia nauplii от заболевания, вы зываемого Vibrio campbellii, причем эффективность ПОБ была в 100 раз выше, чем у 3-гидроксимасляной кислоты [91]. Кроме того, ПОБ способен подавлять не только Vibrio sp., но также E. coli и Salmonella sp. [92]. Показано также, что продукты биодеградации некоторых пПОА, например, 3-гидроксиоктаноат, обладают антимикробной активностью в отношении целого ряда грамотрицательных и грамположитель ных бактерий, а также ингибируют продукцию ме таболитов, ассоциированных с патогенной активно стью этих бактерий, тогда как для цитотоксического воздействия на фибробласты человека необходима значительно большая концентрация пПОА [93]. На возможность того, что ПОБ может выполнять какие-то сигнальные функции в организме, указы вает также и такой интересный факт, что димеры и тримеры 3-оксибутирата являются половыми фе ромонами у пауков [94]. Не исключено, что эти феро моны могут быть продуктами биосинтеза бактериями микробиоты членистоногого. Так, например, у жуков Costelytra zealandica половым феромоном является фенол, который синтезируется из тирозина в спе циальных железах симбиотическими бактериями Morganella morganii [95]. Димеры и тримеры 3-окси бутирата обнаружены у гриба Hypoxylon truncatum, однако механизм их синтеза не установлен [96]. На основе П4ОБ и ПОБ4ОБ получают целый ряд биоразлагаемых медицинских изделий: хирургиче ских нитей, тканых сетчатых эндопротезов и плаг эндопротезов, скаффолдов для регенерации мягких тканей. Благодаря измененной химической струк туре П4ОБ, как ПМК и ПГК, подвергаются преиму щественно гидролитической деградации. В природе этих полимеров не существует, их получают био технологическим путем с помощью биосинтеза ге нетически модифицированным штаммом-продуцен том E. coli K12. Мономер П4ОБ - 4-гидроксибутират (γ-оксимасляная кислота), как и 3-оксибутират, яв ляется естественным метаболитом и одним из ней ромедиаторов, который используется как мощное психоактивное вещество и даже входит в перечень наркотических средств [97]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, наблюдаемая многими исследова телями биологическая активность ПОА, например, способность этих полимеров стимулировать реге нерацию костных и хрящевых тканей, может быть связана не только с физико-химическими свойства ми ПОА или со структурой изделий на их основе, но и с наличием собственной активности ПОА, ко торая, в свою очередь, обусловлена природными функциями предшественника этих полимеров - ПОБ (таблица). Подобная связь имеется также и между способностью ПОА, используемых для изготовления медицинских изделий, к биодеградации в тканях человека и природной функцией ПОБ как запасного биополимера в бактериальной клетке, так как, чтобы выполнять свою функцию, запасное вещество долж но обладать способностью к расщеплению клеточ ными ферментами. Возможно, что этот биополимер выполняет некие сигнальные функции в нашем ор ганизме, посредством которых бактерии микробио ты взаимодействуют с клетками иммунной системы, слизистой кишечника и других тканей, вызывая у них тот или иной физиологический ответ. Можно предположить, что структура ПОА, полученных с помощью как химического синтеза, так и биотех нологических методов, сходна со структурой ПОБ, что позволяет имитировать биологические свойства ПОБ, связанные с теми его функциями, которые этот биополимер приобрел в процессе долгой эволюции синтезирующих его организмов. Несмотря на то что подавляющее большинство изделий и лекарственных форм на основе ПОА из готовлены из синтетических ПОА, уже разрабо таны и применяются несколько изделий на основе природных ПОА. Это, например, биополимерная мембрана для замещения дефектов мягких и хря щевых тканей ЭластоПОБ (АО «БИОМИР сервис», г. Краснознаменск, Московская область, РФ) [98] и композитный сетчатый эндопротез TephaFLEX (Tepha Inc., США) Phasix™ Plug [97] (рис. 2). Незатихающий интерес к природным ПОА, исполь зуемым как в промышленности (упаковка, текстиль, косметика, бытовые изделия), так и в медицине дока зывает также строящийся биотехнологический завод итальянской компании Bio-on (http://www.bio-on.it/ index.php) для крупнотоннажного промышленного производства ПОБ и его сополимеров. Таким образом, рассмотренная нами область на уки требует глубокого и тщательного исследования, которое позволит установить природные функции используемых в медицине полимеров - биомиме тических аналогов природных предшественников, и разработать новые природоподобные технологии создания полимерных медицинских изделий и ле карственных препаратов нового поколения.

Об авторах

А. П. Бонарцев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

Г. А. Бонарцева

Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

И. В. Решетов

Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

К. В. Шайтан

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

М. П. Кирпичников

Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы