Исследование взаимосвязи структура-функция-стабильность в дрожжевой оксидазе D-аминокислот: гидрофобизация альфа-спиралей

Гидрофобизация α-спиралей является одним из общих подходов повышения температурной стабильности ферментов. На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей оксидаз D-аминокислот из различных источников и анализа трехмерной структуры оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO, [КФ 1.4.3.3]) найдены 11 остатков Ser, расположенных в α-спиралях. По результатам дальнейшего структурного анализа восемь из них отобрали (в положениях 67, 77, 78, 105, 270, 277, 335 и 336) для замены на остатки Ala. Замены Ser78Ala и Ser270Ala привели к сильной дестабилизации фермента - мутантные варианты инактивировались в процессе их выделения из клеток. Остальные шесть мутантных TvDAAO были получены в высокоочищенном состоянии и изучены их свойства. Замены Ser277Ala и Ser336Ala привели к дестабилизации белковой глобулы, мутанты TvDAAO Ser77Ala и TvDAAO Ser335Ala по термостабильности были близки к ферменту дикого типа, в то время как замены Ser67Ala и Ser105Ala повысили температурную стабильность приблизительно в 1.5 и 2 раза. Кроме того, каталитическая эффективность мутантной TvDAAO Ser105Ala с D-Asn, D-Tyr, D-Phe и D-Leu была в среднем в 1.2-3 раза выше, чем у фермента дикого типа.