Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1054010.32607/20758251-2014-6-3-76-88Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleStudy of the Structure-Function-Stability Relationships in Yeast D-amino Acid Oxidase: Hydrophobization of Alpha-HelicesИсследование взаимосвязи структура-функция-стабильность в дрожжевой оксидазе D-аминокислот: гидрофобизация альфа-спиралейGolubevI. V.ГолубевИ. В.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comKomarovaN. V.КомароваН. В.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comRyzhenkovaK. V.РыженковаК. В.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comChubarT. A.ЧубарьТ. А.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comSavinS. S.СавинС. С.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comTishkovV. I.ТишковВ. И.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comM.V. Lomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. ЛомоносоваInnovations and High Technologies MSU LtdООО «Инновации и высокие технологии МГУ»A.N. Bach Institute of BiochemistryИнститут биохимии им. А.Н. Баха РАН1509201463VOL 6, NO3 (2014)ТОМ 6, №3 (2014)768817012020Copyright ©; 2014, Golubev I.V., Komarova N.V., Ryzhenkova K.V., Chubar T.A., Savin S.S., Tishkov V.I.Copyright ©; 2014, Голубев И.В., Комарова Н.В., Рыженкова К.В., Чубарь Т.А., Савин С.С., Тишков В.И.2014Golubev I.V., Komarova N.V., Ryzhenkova K.V., Chubar T.A., Savin S.S., Tishkov V.I.Голубев И.В., Комарова Н.В., Рыженкова К.В., Чубарь Т.А., Савин С.С., Тишков В.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10540

Hydrophobization of alpha-helices is one of the general approaches used for improving the thermal stability of enzymes. A total of 11 serine residues located in alpha-helices have been found based on multiple alignments of the amino acid sequences of D-amino acid oxidases from different organisms and the analysis of the 3D-structure of D-amino acid oxidase from yeast Trigonopsis variabilis (TvDAAO, EC 1.4.3.3). As a result of further structural analysis, eight Ser residues in 67, 77, 78, 105, 270, 277, 335, and 336 positions have been selected to be substituted with Ala. S78A and S270A substitutions have resulted in dramatic destabilization of the enzyme. Mutant enzymes were inactivated during isolation from cells. Another six mutant TvDAAOs have been highly purified and their properties have been characterized. The amino acid substitutions S277A and S336A destabilized the protein globule. The thermal stabilities of TvDAAO S77A and TvDAAO S335A mutants were close to that of the wild-type enzyme, while S67A and S105A substitutions resulted in approximately 1.5- and 2.0-fold increases in the TvDAAO mutant thermal stability, respectively. Furthermore, the TvDAAO S105A mutant showed on average a 1.2- to 3.0-fold higher catalytic efficiency with D-Asn, D-Tyr, D-Phe, and D-Leu as compared to the wild-type enzyme.

Гидрофобизация α-спиралей является одним из общих подходов повышения температурной стабильности ферментов. На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей оксидаз D-аминокислот из различных источников и анализа трехмерной структуры оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO, [КФ 1.4.3.3]) найдены 11 остатков Ser, расположенных в α-спиралях. По результатам дальнейшего структурного анализа восемь из них отобрали (в положениях 67, 77, 78, 105, 270, 277, 335 и 336) для замены на остатки Ala. Замены Ser78Ala и Ser270Ala привели к сильной дестабилизации фермента - мутантные варианты инактивировались в процессе их выделения из клеток. Остальные шесть мутантных TvDAAO были получены в высокоочищенном состоянии и изучены их свойства. Замены Ser277Ala и Ser336Ala привели к дестабилизации белковой глобулы, мутанты TvDAAO Ser77Ala и TvDAAO Ser335Ala по термостабильности были близки к ферменту дикого типа, в то время как замены Ser67Ala и Ser105Ala повысили температурную стабильность приблизительно в 1.5 и 2 раза. Кроме того, каталитическая эффективность мутантной TvDAAO Ser105Ala с D-Asn, D-Tyr, D-Phe и D-Leu была в среднем в 1.2-3 раза выше, чем у фермента дикого типа.

D-amino acid oxidase from yeast Trigonopsis variabilisprotein engineeringhydrophobization of alpha-helicesite-directed mutagenesisubstrate specificityhermal stabilityбелковая инженериягидрофобизация α-спиралинаправленный мутагенезоксидаза D-аминокислот из Trigonopsis variabilisсубстратная специфичностьтемпературная стабильностьThis work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grant № 14-04-00859-a).Работа поддержана РФФИ (грант № 14-04-00859-а).[1] Tishkov V.I., Khoronenkova S. V. // Biochemistry (Moscow) 2005, V.70, №1, P.40-54[2] Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2008, V.73, №13, P.1511-1518[3] Pollegioni L., Piubelli L., Sacchi S., Pilone M.S., Molla G. // Cell. Mol. Life Sci. 2007, V.64, №11, P.1373-1394[4] Pollegioni L., Molla G. // Trends Biotechnol. 2011, V.29, №6, P.276-283[5] Pollegioni L., Molla G., Sacchi S., Rosini E., Verga R., Pilone M.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, V.78, №1, P.1-16[6] Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. // Biotechnol. Prog. 2004, V.20, №2, P.467-473[7] Gabler M., Hensel M., Fischer L. // Enzyme Microb. Technol. 2000, V.27, №8, P.605-611[8] Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, V.65, P.627-633[9] Geueke B., Weckbecker A., Hummel W. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, V.74, №6, P.1240-1247[10] Savin S.S., Chernyshev I.V., Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. // Moscow Univ. Chem. Bul. 2006, V.61, №1, P.13-19[11] Cherskova N., Khoronenkova S., Tishkov V. // Rus. Chem. Bull. 2010, V.59, №1, P.1-7[12] Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. 2006, V.23, №2-3, P.89-110[13] Komarova N.V., Golubev I.V., Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. // Rus. Chem. Bull. 2012, V.61, №7, P.1489-1496[14] Wong K.-S., Fong W.-P., Tsang P.W.K. // Nat. Biotechnol. 2010, V.27, №1, P.78-84[15] Wang S.-J., Yu C.-Y., Lee C.-K., Chern M.-K., Kuan I.-C. // Biotechnol. Lett. 2008, V.30, №8, P.1415-1422[16] Komarova N.V., Golubev I.V., Khoronenkova S.V., Chubar T.A., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2012, V.77, №10, P.1181-1189[17] Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. // Anal. Biochem. 2008, V.374, №2, P.405-410[18] Poltorak O.M., Chukhray E.S., Torshin I.Y. // Biochemistry (Moscow). 1998, V.63, №3, P.303-311[19] Munoz V., Serrano L. // Nat. Struct. Biol. 1994, V.1, P.399-409[20] Munoz V., Serrano L. // J. Mol. Biol. 1995, V.245, P.275-296[21] Rose G., Geselowitz A., Lesser G. // Science. 1985, V.229, №7, P.834-838[22] Rojkova A., Galkin A., Kulakova L., Serov A., Savitsky P., Fedorchuk V., Tishkov V. // FEBS Lett. 1999, V.445, №1, P.183-188[23] Alekseeva A.A., Serenko A.A., Kargov I.S., Savin S.S., Kleymenov S.Y., Tishkov V.I. // Protein Eng. Des. Sel. 2012, V.25, №11, P.781-788[24] Alekseeva A.A., Savin S.S., Kleimenov S.Y., Uporov I.V., Pometun E.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2012, V.77, P.1199-1209