Роль остатка Ala198 в стабильности и коферментной специфичности бактериальных формиатдегидрогеназ

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, остаток Ala198, расположенный в коферментсвязывающем домене NAD+-зависимых формиатдегидрогеназ [КФ 1.2.1.2] (ФДГ) из бактерий Pseudomonas sp. 101 и Moraxella sp. C-1 (PseFDH и MorFDH соответственно), имеет неоптимальные значения углов ψ и φ. Методом направленного мутагенеза этот остаток был заменен на остаток Gly. Мутантные PseFDH A198G и MorFDH A198G экспрессировали в клетках Escherichia coli и получили в высокоочищенном (> 95% чистоты) виде. Исследование кинетики термоинактивации показало, что PseFDH A198G и MorFDH A198G в 2.5 раза более стабильны, чем соответствующие ферменты дикого типа. Анализ кинетических свойств свидетельствует, что введение замены A198G в PseFDH и MorFDH приводит к уменьшению величины Км по NAD+ с 60 до 35 и с 80 до 45 мкМ соответственно, в то время как величина Км по формиату остается неизменной. Замена A198G была введена также в мутантную PseFDH D221S, коферментная специфичность которой была изменена от NAD+ к NADP+. В этом случае также наблюдалось увеличение термостабильности, однако эффект на кинетические параметры был противоположным – константа Михаэлиса по NADP+ увеличилась с 190 до 280 мкМ, а по формиату возросла с 43 до 89 мМ. Полученные данные позволяют с высокой вероятностью предположить, что ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 ранее была NADP+-, а не NAD+-зависимым ферментом.