Интернализация и рециркуляция рецептора HER2 при взаимодействии адресного фототоксичного белка DARPin-miniSOG с клетками аденокарциномы молочной железы человека

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Моноклональные антитела и их производные широко используются в биомедицинской практике для селективного, прицельного поражения опухолевых новообразований человека [1, 2]. Вместе с тем, успехи в разработке методов получения неприродных белков, высокоаффинных к специфическим мишеням (создание синтетических библиотек, разработка эффективных технологий отбора белков, высокоаффинных к специфической мишени), позволили создать новые, так называемые каркасные белки (скаффолды) неиммуноглобулиновой природы с единым основным каркасом и возможностью варьировать специфичность по отношению к мишени [3-5]. Зачастую каркасные белки, обладая такой же высокой аффинностью и специфичностью к мишени, как соответствующие моноклональные антитела, превосходят их по своим физико-химическим свойствам. Так, для каркасных белков характерно отсутствие агрегации, небольшой размер, обеспечивающий эффективное проникновение в ткани, быстрый фолдинг и высокая химическая, протеолитическая и термическая стабильность. Возможность получения нужного каркасного белка с единственным остатком цистеина в его составе облегчает последующую конъюгацию с цитотоксинами, флуорофорами или наночастицами, а отсутствие дисульфидных связей позволяет экспрессировать эти белки в цитоплазме Escherichia coli и нарабатывать белки, высокоаффинные к конкретной мишени, без иммунизации животных. Перечисленные особенности дают каркасным белкам неоспоримые преимущества перед иммуноглобулинами в качестве альтернативных адресных компонентов в составе мультифункциональных соединений, предназначенных для диагностики и терапии различных заболеваний. К каркасным белкам, представляющим альтернативу моноклональным антителам, относятся аднектины, аффибоди, антикалины, а также искусственные белки, сконструированные на основе природных белков с повторяющимися структурными мотивами (анкириновые и тетратрикопептидные повторы) [3-5]. В лаборатории А. Плюктуна на основе искусственных белков с анкириновыми повторами - DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins), получен ряд белков, обладающих высокой аффинностью к рецептору 2 эпидермального фактора роста человека HER2 (ERBB2) [6]. Поверхностный клеточный рецептор HER2 cверхэкспрессируется в 20-30% опухолей молочной железы и яичников [7, 8]. Как правило, сверхэкспрессия этого рецептора коррелирует с агрессивным фенотипом опухоли и активным метастазированием [9], что делает его привлекательной мишенью для иммунотерапии рака, поскольку в норме HER2 экспрессируется лишь в небольших количествах на поверхности эпителиальных клеток. Таким образом, создание и исследование новых высокоаффинных белковых соединений, способных избирательно и эффективно уничтожать раковые клетки, сверхэкспрессирующие HER2, остаются актуальной задачей. В своей работе мы использовали DARPin_9-29 в качестве адресного домена, способного доставить к HER2-положительным клеткам аденокарциномы молочной железы человека фототоксический белок miniSOG [10]. Цель данного исследования состояла в изучении способности гибридного белка DARPin-miniSOG взаимодействовать с опухолевыми клетками, сверхэкспрессирующими HER2, и возможности интернализации образующегося комплекса HER2/DARPinminiSOG. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Клеточные линии и условия культивирования Культивируемые клетки аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, сверхэкспрессирующие HER2, и клетки яичников китайского хомячка CHO растили в среде McCoy’s 5A (Life technologies, США) с 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (HyClone, Бельгия) в атмосфере 5% CO2 при 37°C. Получение белка DARPin-miniSOG Кодирующую последовательность адресного модуля DARPin_9-29 амплифицировали с плазмиды pCG-Hnse-DARPin-d18-9-29 (любезно предоставлена А. Плюктуном, Университет Цюриха). ПЦРфрагмент обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeI и HindIII и лигировали с вектором pET22b, предварительно обработанным этими же эндонуклеазами рестрикции. Кодирующую последовательность цитотоксического модуля miniSOG амплифицировали с плазмиды pSD-4D5scFv-miniSOG [11], обрабатывали эндонуклеазами рестрикции HindIII и XhoI и клонировали в вектор pET22b в одной рамке считывания с кодирующей последовательностью DARPin_9-29. В результате экспрессионная кассета содержала индуцибельный промотор фага Т7, последовательности, кодирующие DARPin-9_29, miniSOG и олигогистидиновый пептид. Белок DARPin-miniSOG экспрессировали в штамме BL21(DE3). Экспрессию индуцировали 1 мМ IPTG при достижении культурой OD600 = 0.5-0.7. После индукции биомассу растили при 25°С в течение 8 ч. Белок DARPin-miniSOG выделяли из растворимой фракции с использованием металл-хелатной аффинной хроматографии согласно протоколу производителя. Проточная цитофлуориметрия Опыты по проточной цитофлуориметрии выполняли на проточном цитометре BD Accuri C6 (Becton Dickinson, США). Адгезивные клетки снимали с подложки раствором Версена («ПанЭко», Россия) и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, «ПанЭко», Россия). Для определения субпопуляций живых и мертвых клеток пробу инкубировали в 100 мкл PBS с йодидом пропидия (конечная концентрация 2.5 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) в темноте на льду в течение 5 мин. Для каждого образца собирали не менее 104 событий. При измерении последовательно выделяли популяции одиночных клеток, затем живых клеток (не окрашенных йодидом пропидия). Для детекции использовали следующие параметры: напряжение на лазере 20 мВт и фильтры 533/30 (FL1-канал) для детекции флуоресценции DARPin-miniSOG, 585/40 (FL2-канал) для детекции флуоресценции йодида пропидия. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения BD Accuri C6. Конкурентный анализ Специфичность связывания рекомбинантного белка DARPin-miniSOG с клеточным рецептором HER2 определяли по уровню флуоресценции HER2сверхэкспрессирующих клеток, окрашенных белком DARPin-miniSOG, с помощью проточной цитофлуориметрии в отсутствие и в присутствии конкурирующего агента. Клетки линии SK-BR-3, достигшие конфлюэнтности, снимали с подложки раствором Версена, промывали дважды PBS. На один опыт брали ~105 клеток. Клетки инкубировали с белком DARPin-miniSOG (500 нМ) на льду в течение 30 мин, затем дважды отмывали раствором PBS от несвязавшегося белка и анализировали уровень флуоресценции в канале FL1 (зеленая флуоресценция). В качестве параметра интенсивности флуоресценции в работе использовали среднее значение интенсивности флуоресценции Mean FL1. В качестве конкурирующего агента использовали DARPin_9-29 в эквимолярной концентрации. В качестве отрицательного контроля использовали анти-HER2-мини-антитело 4D5scFv, специфичное к другому эпитопу HER2. Оценка интернализации HER2 при взаимодействии c DARPin-miniSOG Клетки SK-BR-3 выращивали в течение 14 ч на среде McCoy’s 5A (Life technologies, США), содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Бельгия). Культуральную среду удаляли, клетки снимали с пластика и дважды промывали стерильным PBS. Суспензию клеток в количестве 4 × 105 в течение 30 мин инкубировали на льду в 250 мкл 1 мкМ раствора DARPin-miniSOG в PBS, осаждали центрифугированием на охлажденной центрифуге в течение 5 мин при 800g, однократно промывали холодным PBS и делили на четыре части. Первую из них использовали для измерения уровня флуоресценции клеток, окрашенных белком DARPinminiSOG при 4°С. Для контроля уровня базовой аутофлуоресценции клеток использовали клетки, не инкубированные с белком DARPin-miniSOG. Остальные три части суспензии клеток (по 1 × 105 клеток в каждой), однократно окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С, помещали в среде McCoy’s с 1% сывороткой в 24-луночный планшет и оставляли в CO2-инкубаторе в атмосфере 5% CO2 при 37°С до следующего измерения. Через 4, 8 и 12 ч после первого измерения клетки второй, третьей и четвертой части соответственно снимали с пластика раствором Версена, дважды промывали PBS, половину оставляли для контроля уровня базовой флуоресценции, вторую половину инкубировали в течение 30 мин в 50 мкл 1 мкМ раствора DARPin-miniSOG на льду. После окончания инкубации клетки однократно промывали холодным PBS. Флуоресценцию DARPin-miniSOG измеряли в обеих полученных пробах для каждого временного интервала. Оценка динамики окраски белком DARPinminiSOG клеток SK-BR-3, обработанных папаином Клетки SK-BR-3 выращивали в течение 14 ч на среде McCoy’s 5A (Life technologies, США), содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Бельгия). Культуральную среду удаляли, клетки снимали с пластика и дважды промывали стерильным PBS. Для удаления внеклеточного домена HER2 суспензию клеток 1.5 × 106 инкубировали в 1% растворе папаина (AppliChem, Германия) при 37°С в течение 15 мин. Клетки промывали холодным PBS, делили на семь частей. Первую часть (нулевой момент времени) делили пополам, одну половину (~12.5 × 104 клеток) окрашивали белком DARPinminiSOG (1 мкМ) при 4°С, вторая половина клеток служила контролем уровня аутофлуоресценции. Оставшиеся пять частей клеток помещали в среде McCoy’s с 1% сывороткой в 24-луночный планшет и оставляли в CO2-инкубаторе в атмосфере 5% CO2 при 37°С на 2, 4, 8, 12, 24 и 72 ч. По истечении указанного временного периода клетки снимали с подложки раствором Версена, промывали холодным PBS, делили пополам, одну половину окрашивали белком DARPin-miniSOG, как описано выше, вторую оставляли неокрашенной и проводили измерение флуоресценции двух проб для каждого временного интервала. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ранее в лаборатории С.М. Деева (ИБХ РАН) был создан адресный белок DARPin-miniSOG для селективного фотодинамического поражения раковых клеток человека. Адресная часть DARPin-miniSOG представлена белком неиммуноглобулиновой природы DARPin_9-29, обладающим высоким сродством к рецептору HER2 [6]. В отличие от часто используемого анти-HER2-мини-антитела 4D5scFv, которое взаимодействует с субдоменом IV внеклеточного домена HER2, DARPin_9-29 узнает субдомен I того же HER2 [12]. В качестве цитотоксического модуля в рекомбинантном белке DARPin-miniSOG использован генноинженерный флавопротеин miniSOG [10], способный под действием синего света генерировать активные формы кислорода. Возбуждение miniSOG синим светом приводит к эмиссии в зеленой области спектра (λmax = 500 нм), что позволяет прямо детектировать связывание белка с клетками методом проточной цитофлуориметрии. Созданный рекомбинантный адресный фототоксин DARPin-miniSOG проявляет фотоиндуцированную цитотоксичность на HER2-положительных клеточных линиях in vitro, вызывая некроз клеток, подвергнутых облучению. Представлялось необходимым изучить особенности взаимодействия гибридного белка DARPin-miniSOG с опухолевыми клетками, сверхэкспрессирующими HER2, и оценить влияние цитотоксического модуля в составе гибридного белка на способность адресного домена DARPin_9-29 специфически связываться с рецептором HER2. Для оценки специфичности взаимодействия DARPin_9-29 в составе гибридного белка с HER2 мы исследовали эффективность окрашивания клеток SK-BR-3, экспрессирующих рецептор HER2 в количестве ~106 молекул на клетку, гибридным флуоресцентным белком DARPin-miniSOG с использованием метода конкурентного ингибирования. В качестве конкурирующего агента использовали свободный полипептид DARPin_9-29. Клетки SK-BR-3 инкубировали с белком DARPin-miniSOG (500 нМ) или с эквимолярной смесью белка DARPin-miniSOG (500 нМ) и конкурирующего агента DARPin_9-29 (500 нМ). Для оценки уровня флуоресценции клетки SK-BR-3 инкубировали с белком при температуре 4°С, что исключает возможность интернализации комплекса рецептор-белок. Было показано, что средняя интенсивность флуоресценции клеток, обработанных белком DARPinminiSOG, почти в 2 раза выше, чем интенсивность флуоресценции клеток, обработанных смесью белков DARP_9-29 и DARPin-miniSOG (рис. 1А, красная и зеленая линии соответственно), т.е. полипептид DARPin_9-29 конкурирует с белком DARPin-miniSOG за связывание с клетками SKBR3. Отметим, что при использовании мини-антитела 4D5scFv, узнающего на поверхности HER2 эпитоп, отличный от эпитопа DARPin_9-29, снижения в значении флуоресценции не происходит (рис. 1А, синяя линия). HER2-отрицательные клетки CHO не дают флуоресцентного сигнала при инкубации с белком DARPin-miniSOG (рис. 1Б). Таким образом, установлено, что адресный гибридный белок DARPinminiSOG высокоспецифично связывается с клетками аденокарциномы молочной железы, сверхэкспрессирующими рецептор HER2, а присутствие в его составе цитотоксического модуля miniSOG не влияет на специфичность адресного домена по отношению к HER2. Для установления механизмов воздействия адресного фототоксина DARPin-miniSOG на опухолевую клетку необходимо было выяснить, что происходит с образовавшимся комплексом рецептор-белок после специфичного связывания DARPin-miniSOG с HER2-положительными клетками. Происходит ли интернализация HER2, и если да, то какова дальнейшая судьба HER2 после интернализации - рециркуляция или деградация в поздних лизосомах? Способность рецептора HER2 к интернализации в настоящее время активно изучается. Процесс лиганд-индуцированной интернализации других рецепторов семейства эпидермального фактора роста (EGFR/HER1 и HER3) описан весьма детально: рецептор, активированный лигандом, подвергается быстрому рецептор-опосредованному эндоцитозу [13]. После интернализации возможна сортировка комплекса рецептор-лиганд в ранней эндосоме (быстрая рециркуляция) или в мультивезикулярных тельцах (медленный возврат). И в том и в другом случае рецептор снова экспонируется на мембране. Но возможен и третий путь: деградация комплекса рецептор-лиганд в лизосоме. Судьба рецептора определяется чувствительностью комплекса рецептор-лиганд к кислотной деградации на пути от эндосом к лизосомам. Менее стойкие комплексы диссоциируют раньше, и рецептор подвергается рециркуляции. Более устойчивые комплексы диссоциируют позже, и рецепторы в комплексе с лигандом деградируют в лизосомах [14]. В современной научной литературе существуют две диаметрально противоположных точки зрения на интернализацию рецептора HER2. В то время как одни исследования указывают на то, что HER2 не способен к эндоцитозу [15, 16], в других показано, что HER2 интернализуется, но снова экспонируется на клеточной мембране в результате быстрой эффективной рециркуляции из ранней эндосомы [17-19]. Хорошо известно, что HER2, в отличие от других членов семейства, не имеет природных лигандов, а его внутриклеточный домен лишен сигнала интернализации [20]. Следовательно, изучать эндоцитоз гомодимеров, индуцированный лиганд-рецепторным взаимодействием, невозможно. Есть данные, свидетельствующие о том, что экспрессия HER2 подавляет формирование клатриновых ямок на клеточной поверхности [16, 21]. Приведены доказательства того, что HER2 способен ингибировать лиганд-активированную интернализацию других рецепторов семейства эпидермального фактора роста при образовании гетеродимеров с ними [22]. На сегодняшний день доказано, что гуманизированное моноклональное антитело Трастузумаб (Herceptin), широко применяемое в терапии HER2-положительных опухолей молочной железы, само по себе не способно приводить к интернализации HER2 [23], как предполагалось первоначально. Однако сочетанное использование Трастузумаба с другим, неконкурентным, антителом - Пертузумабом (Perjeta) или с антителом L26, которое, как и Пертузумаб, препятствует образованию гетеродимеров рецептора HER2 с другими членами семейства эпидермального фактора роста, приводит к эффективной интернализации HER2 и его деградации [24-26]. Есть данные, согласно которым не только полноразмерные антитела, но и мини-антитела формата scFv, специфичные к внеклеточному домену HER2, вызывают интернализацию рецептора HER2. Так, в работе [27] показано, что инкубация HER2-положительных клеток BT-474 c комплексом 4D5scFv-дибарназа, представляющим собой одноцепочечный вариабельный фрагмент миниантитела 4D5 к рецептору HER2/neu, соединенный с двумя молекулами барназы - цитотоксической РНКазы из Bacillus amyloliquefaciens, при 37°С приводит к полному удалению рецептора с поверхности клеток. При этом рецептор обнаруживается в эндосомах и мультивезикулярных тельцах [27]. Также возможность интернализации рецептора HER2 показана при его взаимодействии с гибридным белком DARPin-mCherry, узнающим внеклеточный домен HER2 [28]. В настоящей работе изучена интернализация рецептора HER2 при его связывании с белком DARPinminiSOG. Схема эксперимента представлена на рис. 2А. При этом сначала определяли уровень флуоресценции клеток, окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С (условия, в которых интернализация не идет) (рис. 2Б, темно-зеленый столбец, время 0 ч), в сравнении с аутофлуоресценцией (рис. 2Б, голубой столбец, время 0 ч). Затем определяли уровень флуоресценции этих однократно окрашенных клеток через 4, 8 и 12 ч после инкубации при 37°С в СО2-инкубаторе (условия, в которых идет интернализация) без повторного окрашивания (рис. 2Б, синие столбцы, время 4, 8 и 12 ч соответственно) и после их повторной окраски на холоду белком DARPin-miniSOG (рис. 2Б, светло-зеленые столбцы, время 4, 8 и 12 ч соответственно). Отметим, что белок DARPin-miniSOG для этих опытов брали в количестве, избыточном по отношению к количеству рецептора на клетках. Об интернализации комплекса HER2/DARPinminiSOG свидетельствует резкое падение интенсивности флуоресценции клеток SK-BR-3, инкубированных с белком DARPin-miniSOG при 37°С, по сравнению с клетками, инкубированными с белком DARPin-miniSOG при 4°С: в течение 10 мин инкубации при 37°С происходит падение средней интенсивности флуоресценции более чем в 2 раза (рис. 2В). При этом показано, что средняя интенсивность флуоресценции клеток SK-BR-3, предварительно окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С, после их инкубации при 37°С (в условиях интернализации) превышает исходный уровень средней интенсивности аутофлуоресценции в 1.4 раза через 4 ч, в 1.3 раза через 8 ч и снижается почти до исходного уровня аутофлуоресценции через 12 ч (рис. 2Б, синие столбики). Способность клеток SK-BR-3 повторно окрашиваться белком DARPin-miniSOG при 4°С по сравнению с контрольными клетками SK-BR-3, однократно обработанными белком DARPin-miniSOG при 4°С (темно-зеленый столбик), через 4 ч снижается в 1.2 раза, а через 8 ч - в 1.4 раза (рис. 2Б, светло-зеленые столбики). Через 12 ч способность клеток SK-BR-3 повторно окрашиваться белком DARPin-miniSOG при 4°С возвращается к первоначальному уровню. Способность клеток повторно окрашиваться белком DARPin-miniSOG после инкубации при 37°С может обусловливаться распадом комплекса HER2/DARPin-miniSOG и возвратом рецептора HER2 на мембрану, а также быстрым биосинтезом новых молекул рецептора. Для изучения вклада биосинтеза новых молекул рецептора была изучена динамика окрашивания белком DARPin-miniSOG клеток SK-BR-3, с поверхности которых с помощью папаина удален внеклеточный домен HER2. Через 12 и 24 ч после удаления внеклеточного домена HER2 уровень флуоресценции клеток SK-BR-3, окрашенных DARPin-miniSOG, составлял всего 43 и 57% от исходного соответственно и достигал первоначального уровня лишь через 72 ч (рис. 3). Таким образом, показано, что за 12 ч клетки SK-BR-3, лишенные рецептора HER2, не успевают полностью восстановить способность окрашиваться белком DARPin-miniSOG, т.е. наработать рецептор HER2 в количестве, соответствующем клеткам SK-BR-3, не обработанным папаином (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень рецептора HER2 на поверхности клеток SK-BR-3 аденокарциномы молочной железы не является неизменным: при связывании белка DARPinminiSOG с рецептором HER2 происходит интернализация комплекса HER2/DARPin-miniSOG, число молекул рецептора на поверхности клетки при этом уменьшается и соответственно уменьшается флуоресценция клеток, повторно окрашенных белком DARPin-miniSOG (рис. 2). Через ~12 ч среднее значение интенсивности флуоресценции повторно окрашенных клеток достигает исходного значения. Таким образом, на основании проведенных экспериментов и учитывая динамику биосинтеза HER2, следует сделать вывод, что после интернализации комплекса HER2/DARPin-miniSOG происходит его распад и медленный возврат рецептора HER2 на клеточную мембрану. При этом поступление вновь синтезированных молекул рецептора HER2 на мембрану клеток невелико и не вносит большого вклада в среднее значение интенсивности флуоресценции окрашенных клеток. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе выявлены закономерности специфического взаимодействия белка DARPinminiSOG с рецептором HER2, получены данные, свидетельствующие об интернализации рецептора HER2 в комплексе с DARPin-miniSOG и последующем возврате рецептора на клеточную мембрану. Полученные данные важны для дальнейшей разработки методов терапии HER2-положительных опухолей на основе нового фотоцитотоксического белка DARPin-miniSOG.

Об авторах

O. Н. Шилова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.shilova.n@gmail.com
Россия

Г. M. Прошкина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: olga.shilova.n@gmail.com
Россия

E. Н. Лебеденко

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: olga.shilova.n@gmail.com
Россия

С. M. Деев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: olga.shilova.n@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы