Клональные реаранжировки и опухолевые клоны при периферической Т-клеточной лимфоме

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Периферическая Т-клеточная лимфома, неуточненная (ПТКЛн) - гетерогенная группа лимфом с иммунофенотипом зрелых периферических (посттимических) Т-лимфоцитов. Данный диагноз охватывает более 29% Т-клеточных лимфом, которые не попадают под другие нозологические формы и является диагнозом исключения [1, 2]. Клинически заболевание протекает агрессивно (пятилетняя общая выживаемость не превышает 32%), часто носит распространенный (у 69% пациентов диагностируется стадия III/IV) и внеузловой характер, поражает костный мозг, кожу, подкожную клетчатку, легкие [3]. Считается, что морфологическим субстратом опухоли являются Т-лимфоциты, имеющие иммунофенотип зрелых Т-клеток с αβ-вариантом Т-клеточного рецептора на поверхности (TCRαβ) и маркерами CD2+, CD3+, CD5+, CD7+, CD4+ или CD8+, экспрессия которых несет признаки аберрантности (утрата одного или нескольких из них). ПТКЛн чаще имеет иммунофенотип CD4+/CD8-, реже CD4-/CD8+. В некоторых случаях у периферических Т-клеточных лимфом наблюдается очень скудная экспрессия Т-клеточных маркеров на поверхности, например только CD2 или СD3. Кроме того, небольшое число ПТКЛн - это лимфомы из γδ-Тлимфоцитов, которые невозможно отнести по клинико-морфологическим данным к гепато-лиентальной γδ-лимфоме или γδ-варианту лейкоза из больших гранулированных лимфоцитов [3-6]. Исследование клональных реаранжировок генов Т-клеточных рецепторов при ПТКЛн позволяет в сложных диагностических случаях подтвердить Т-клеточную клональность и доказать наличие опухоли [7-11]. Суть метода состоит в ПЦР-амплификации и анализе области соединения V-D-J-сегментов генов Т-клеточных рецепторов δ (TCRD), γ (TCRG) и β (TCRB). В каждом нормальном Т-лимфоците данная область имеет уникальную нуклеотидную последовательность. При фрагментном анализе амплификатов, полученных из здоровой ткани, наблюдается множество пиков с Гауссовским распределением длин (рис. 1А). Моноклональные образцы, имеющие одинаковую длину ПЦР-продуктов, определяются в виде одного пика (моноаллельная реаранжировка, рис. 1Б) или двух пиков (биаллельная реаранжировка, рис. 1В). Длина моноклонального ПЦР-продукта уникальна для опухолевого клона и неизменна во всех пораженных тканях у данного пациента. Обнаружение клона, например, в пунктате костного мозга, будет указывать на поражение костного мозга. Кроме того, по характеру реаранжировок можно судить о степени зрелости лимфоидной опухоли. При созревании Т-лимфоцита в норме реаранжировки проходят последовательно: сначала перестраивается локус генов TCRD (Vδ-Dδ, Dδ-Dδ, Dδ-Jδ, Vδ-Jδ), затем TCRG (Vγ-Jγ) и неполностью TCRB (Dβ-Jβ). Несколько позже происходят полные реаранжировки TCRB (Vβ-Jβ) и α-локуса TCR (Vα-Jα) (рис. 2) [12, 13]. Так как гены TCRδ (TCRD) располагаются внутри локуса TCRα, то они вырезаются при реаранжировках TCRα. Таким образом, спектр наблюдаемых при лимфомах клональных реаранжировок можно разделить на ранние и более зрелые. Если в опухоли обнаруживают клональные продукты локусов TCRD, TCRG, неполные перестройки Dβ-Jβ, и не находят полных Vβ-Jβ-реаранжировок генов TCRB, то это говорит о раннем характере реаранжировок, что соответствует опухоли из γδ-Т-лимфоцитов. Чаще в опухоли представлен более зрелый спектр реаранжировок: одновременно присутствуют реаранжировки Vγ-Jγ, Dβ-Jβ и Vβ-Jβ, что характерно для большинства TCRαβ-лимфом, в том числе и ПТКЛ. Согласно опубликованным данным, клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB имеют 81-94% и 96% ПТКЛн соответственно [7, 8]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В Гематологическом научном центре Минздрава России (далее ГНЦ) проведен ретроспективный анализ результатов исследования клональности при ПТКЛн за последние 10 лет (2005-2015 гг.). Пациенты и образцы Выборка больных состояла из 30 человек (15 мужчин и 15 женщин, медиана возраста 56 лет (32-75)). Стадию заболевания определяли согласно классификации Ann-Arbor (1971), поражение костного мозга считали IV стадией. У четырех пациентов диагностирована стадия I, у четырех - III, у 22 - IV. Поражение лимфатических узлов отмечено у 18 (60%) пациентов, костного мозга у 22 (73%), селезенки у 14 (47%), кожи у 5 (17%), желудочно-кишечного тракта у 4 (13%), легких у 4 (13%), миндалин у 3 (10%), печени у 3 (10%), средостения у 2 (7%), оболочек головного мозга (нейролейкемия) у 2 (7%), молочных желез у 2 (7%), мягких тканей орбиты у 1 (3%) (табл. 1). Гистологические и иммуногистохимические исследования выполнены в патолого-анатомическом отделении ГНЦ, молекулярно-генетические исследования клональности - в лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ. Выделение ДНК из тканей Лейкоциты и ДНК из крови и костного мозга выделяли как описано ранее [14]. Для выделения ДНК из ткани, залитой в парафиновый блок, брали пять срезов по 5 мкм в пробирки Eppendorf. Ткань депарафинизировали методом нагревания [15, 16]. Свежезамороженную ткань для выделения ДНК размораживали и вырезали кусочек 1 × 1 × 1 мм. ДНК выделяли методом, основанным на растворении ткани в концентрированном аммиаке, с последующей нейтрализацией ледяной уксусной кислотой и высаливанием белков [17]. Концентрацию ДНК определяли на УФ-спектрофотометре. Образцы ДНК хранили при -20°С. Исследование реаранжировок генов TCR при помощи ПЦР и фрагментного анализа Т-клеточную клональность оценивали с использованием мультиплексных систем праймеров BIOMED-2 для фрагментного анализа [13] по перестройкам генов TCRG (Vγ-Jγ), TCRB (Vβ-Jβ, Dβ-Jβ). При γδ-Т-клеточных лимфомах анализировали также перестройки генов TCRD. Мультиплексную амплификацию генов TCRD, согласно протоколу BIOMED-2, проводили в двух пробирках - Tube A и Tube B, а амплификацию генов TCRB в трех пробирках - Tube A, Tube B и Tube C (описание реакций см. в табл. 2). Для амплификации генов TCRD, TCRG использовали праймеры производства «Синтол», Россия. Реакционная смесь в конечном объеме 20 мкл включала: 100 нг ДНК, 10 мкл 2 × смеси для ПЦР (PCR Master Mix Promega), 5 пмоль каждого праймера. Гены TCRB амплифицировали с использованием коммерческого набора TCRB Gene Clonality Assay ABI Fluorescence Detection (Invivoscribe Technologies) и ДНК-полимеразу AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) в соответствии с инструкцией производителя. Условия ПЦР: предварительная денатурация 95°С (5 мин); 35 циклов - 92°С (35 с), 60°С (35 с), 72°С (35 с); окончательная элонгация - 72°С (10 мин). ПЦР проводили на автоматическом термоциклере DNA Engine (BioRad, Hercules, США). Для фрагментного анализа ПЦР-продуктов использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для этого 2 мкл разведенного в 20 раз ПЦР-продукта смешивали с 10 мкл формамида (Applied Biosystems) и 0.04 мкл GeneScan 500-LIS Size Standard (Applied Biosystems). После денатурации при 95°C в течение 3 мин и последующего охлаждения 10 мкл смеси вносили в лунку 96-луночной плашки и проводили капиллярный электрофорез высокого разрешения на полимере POP-4 (Applied Biosystems). Флуоресценцию амплификатов и их профиль (распределение по длинам) анализировали при помощи компьютерной программы GeneMapper v. 4.0 (Applied Biosystems). Статистический анализ Для сравнения результатов, полученных двумя методами, вычисляли критерий ранговой корреляции Спирмена по формуле: rs = 1 - 6Σd2/(N3 - N), где N - число членов совокупности, d - разность рангов для каждого члена выборки, rs - коэффициент Спирмена. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клональность генов TCR выявлена у 29 из 30 пациентов (97%): по генам TCRG - у 27 из 30 (90%), по генам TCRB - у 29 из 30 (97%). В некоторых образцах ПТКЛ реаранжировка обнаружена только в одном из локусов - TCRG или TCRB, что обусловлено аномальной дифференцировкой опухолевых клеток и часто сочетается с незрелым и аберрантным иммунофенотипом. Например, у опухолевых клеток пациента № 27, в костном мозге которого найдена лишь одна клональная реаранжировка Dβ-Jβ, на поверхности не найдены CD3, CD5, CD4 или CD8, а обнаружены только CD2 и CD7. Наиболее вероятная причина отсутствия клональных пиков при исследовании генов TCR (пациент № 25) - малое количество опухолевых клеток в образце (много реактивных Т-лимфоцитов). Методом ПЦР поражение костного мозга или лейкемизация (присутствие клональных лимфоцитов в крови) обнаружено у 93% (у 25 из 27) пациентов (табл. 1). При этом клональные реаранжировки в костном мозге не обнаружены только у пациентов № 25 и № 26, у которых клональные пики также отсутствовали или были сомнительными в лимфоузлах. У четырех пациентов (№ 16-19) морфологическими методами поражение костного мозга не выявлено, тогда как методом ПЦР клональные клетки выявлены в костном мозге. Обнаружение клональных реаранжировок генов TCRG в костном мозге или крови считается плохим прогностическим фактором при ПТКЛ [18]. У большинства пациентов мы наблюдали множественные (более двух) клональные реаранжировки в одном локусе. Клон опухолевых лимфоцитов может иметь реаранжировку на одной хромосоме (моноаллельная реаранжировка) или на двух гомологичных хромосомах (биаллельная реаранжировка). Таким образом, для каждого гена (TCRD или TCRG, или TCRB) в одном опухолевом клоне мы можем обнаружить только один или два клональных пика. В качестве исключения описано появление дополнительной реаранжировки Dβ2-Jβ (рис. 3) [19, 20]. В этом случае при фрагментном анализе мы наблюдаем появление дополнительного клонального пика в диапазоне 170-210 п.н. в пробирке С (Tube С, см. табл. 2) при амплификации генов TCRB. У 13 из 30 (43%) пациентов, хотя бы в одной ткани обнаружены три и более клональных пика в одном локусе генов TCR (у 10 пациентов в локусе TCRG, у 11 - в локусе генов TCRB). При этом множественные (три и более) клональные пики с одинаковой частотой обнаруживались в костном мозге, лимфоузлах и/или селезенке (у 10 из 13 пациентов). Теоретически «лишние» пики можно было бы отнести на счет реактивных Т-клеток, однако мы столкнулись с совершенно иной ситуацией. У 63% пациентов (15 из 24), у которых анализировали несколько тканей, мы наблюдали появление новых клональных пиков и соответственно новых клонов в различных тканях. Зафиксированные ранее клональные реаранжировки либо не определялись, либо частично сохранялись. При этом картина по генам TCRG и TCRB совпадала, т.е. обнаружение нового клонального пика по генам TCRG обычно сопровождалось выявлением новой клональной реаранжировки генов TCRB. Такую картину можно объяснить только присутствием нескольких опухолевых клонов и различным их представительством в тканях и органах. В общей сложности у 19 из 30 пациентов (63%) мы обнаружили несколько клонов. Число клонов варьировало от двух до семи (табл. 1). Корреляции с возрастом (p = 0.43) и стадией заболевания (p = 0.29) не обнаружено. Выявление нескольких клонов коррелировало с количеством проанализированных тканей (rs = 0.6, p < 0.0005). Возможно, данный феномен не был обнаружен у других пациентов лишь из-за малого количества изученных тканей. Ниже приведены наиболее репрезентативные примеры исследования клональности при ПТКЛ. Пациент 11 (рис. 4). При постановке диагноза у пациента 11 выявлена типичная для зрелой Т-клеточной лимфомы картина: биаллельная реаранжировка генов TCRG (212 и 224 п.н.) и полная реаранжировка генов TCRB (Tube B 262 п.н.). При исследовании костного мозга выявлено еще два клона с неполными реаранжировками генов TCRB (Tube C 187 и 193 п.н.). Прогрессия заболевания приводит к поражению кожи, при котором обнаружены один или два новых клона с реаранжировкой генов TCRG (201 п.н.) и полной реаранжировкой генов TCRB (Tube A 254 п.н.). Дальнейшая прогрессия приводит к развитию нейролейкемии. В спинномозговой жидкости (СМЖ) отсутствуют клоны, обнаруженные в опухоли ранее (TCRG 212 и 224 п.н.), но найден клон с реаранжировкой генов TCRG длиной 201 п.н. и новый клон с реаранжировкой генов TCRG длиной 174 п.н. Через 11 месяцев в связи с нарастающей цитопенией пациенту проведена спленэктомия и биопсия печени. В селезенке и печени картина клональных реаранжировок совпадает с первоначальной картиной в лимфоузле и желудке. Таким образом, у пациента 11 в общей сложности выявлены четыре реаранжировки генов TCRG: две полные реаранжировки генов TCRB и две неполные реаранжировки генов TCRB. Динамика появления новых реаранжировок в ходе прогрессии заболевания свидетельствует о пяти или более различных опухолевых клонах. Пациент 9 (рис. 5). У пациента 9 выявлены множественные клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB с различным представительством клонов в тканях и органах. При первичной диагностике исследовали кровь, костный мозг, биоптат миндалины и лимфоузла № 1. В крови и костном мозге выявлено пять и более реаранжировок генов TCRG и TCRB. В миндалине и лимфоузле № 1 найдены три и четыре клональных реаранжировки TCRG соответственно, и четыре реаранжировки генов TCRB. При прогрессии заболевания выполнена биопсия лимфоузла № 2 и кожи. В биоптате лимфоузла найдено пять реаранжировок генов TCRG и восемь - TCRB. За исключением реаранжировки генов TCRB (A) 267 п.н. и генов TCRB (B) 262 п.н., которые в большинстве тканей присутствуют одновременно, остальные реаранжировки генов TCRB распределены произвольно и относятся к различным опухолевым клонам. Данные молекулярного исследования клональности свидетельствуют о наличии у данного пациента семи или более опухолевых клонов. Пациент 8 (рис. 6). У пациента 8 выявлено пять различных реаранжировок TCRG (177, 183, 204, 225, 248 п.н.), при этом в исследованных тканях представлены разные клоны. Найдено четыре реаранжировки генов TCRB: три полные реаранжировки (Tube A и B) и одна неполная Dβ2-Jβ2 (Tube C). В данном случае нет четкой связи между картиной реаранжировок генов TCRG и TCRB. Например, в лимфоузеле № 1 и коже доминируют реаранжировки генов TCRG 183 и 248 п.н., однако в случае генов TCRB картина различается. Количество клонов у данного пациента - четыре или более, однако не исключено, что клонов может быть гораздо больше. Например, клоны только с реаранжировкой TCRG или TCRB, или клоны с реаранжировкой генов TCRG 177 п.н. и TCRB 260 п.н., TCRG 177 п.н. и TCRB 189 п.н. и т.д. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Присутствие нескольких опухолевых клонов, описанное при острых лимфобластных лейкозах (ОЛЛ), объясняется «текущим» незавершенным процессом реаранжировок генов иммуноглобулинов и TCR в ранних клетках-предшественниках [21-24]. Секвенирование клональных продуктов при манифестации ОЛЛ и в рецидиве показало, что при ОЛЛ одновременно присутствуют клоны с незавершенной реаранжировкой генов TCRD или TCRB и производные от них клоны с завершенными реаранжировками. Кроме того, в ряде случаев происходит изменение завершенной реаранжировки. Ген V заменяется другим (вышележащим) либо реаранжировка полностью заменяется на другую из вышележащих генов V и нижележащих J, т.е. генов, которые находятся дистальней предыдущей реаранжировки. Иногда в рецидиве наблюдается делеция и исчезновение клональной реаранжировки генов TCR. Мы предполагаем, что молекулярные события, происходящие при ОЛЛ, могут иметь место и при ПТКЛ. В опухолевой клетке нарушены механизмы контроля, которые при наличии продуктивной реаранжировки останавливают дальнейшие перестройки локуса: повышена активность ферментов RAG1 и RAG2, изменена организация хроматина и т.д. Вероятно, при ПТКЛ реаранжировки могут заменяться новыми и/или возможна замена незавершенных Dβ-Jβ на завершенные Vβ-Jβ. Кроме того, наблюдается общая хромосомная нестабильность, которая может приводить к делециям или дупликациям локуса генов TCR. Делеция локуса, вероятно, запускает механизм дальнейших реаранжировок на гомологичной хромосоме. Комплексные хромосомные изменения, в том числе триплоидия, тетраплоидия, потери хромосом, трисомия 7q, транслокации с участием локусов генов TCR (14q11, 7q34-35, 7p13-21), описаны при различных периферических Т-клеточных лимфомах [25-27]. В любом случае клональные реаранжировки - это лишь маркер, который показывает гетерогенность данной опухоли и клональную эволюцию при прогрессии заболевания. У большинства пациентов нами выявлена «многоклоновость», однако пока неясно, присущ ли данный феномен только ПТКЛ. Возможно, некоторые другие лимфомы также обладают значительной клональной гетерогенностью, но для их «визуализации» требуются другие подходы и методы. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение клональности по генам TCRG и TCRB позволяет эффективно доказывать присутствие опухоли у большинства (97%) пациентов с ПТКЛ. Методом ПЦР показано поражение костного мозга и/или лейкемизация у большинства (93%) обследованных, тогда как морфологически поражение костного мозга подтверждено только у 73% пациентов. Специфическая картина реаранжировок при ПТКЛ (множественные реаранжировки генов TCRG и TCRB, утрата и появление новых, присутствие нескольких опухолевых клонов) наблюдалась у большей части пациентов (63%) и безусловно должна учитываться при использовании данного метода в диагностических целях. Появление новых клональных пиков (клонов) не должно расцениваться как появление новой опухоли. Кроме того, множественные реаранжировки крайне затрудняют оценку минимальной остаточной болезни при ПТКЛ.

Об авторах

Ю. В. Сидорова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

Н. Г. Чернова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

Н. В. Рыжикова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

С. Ю. Смирнова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

M. Н. Синицына

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

Ю. E. Виноградова

Первый Московский государственный медицинский университет им И.М. Сеченова

Email: dusha@blood.ru
Россия

У. Л. Джулакян

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

A. M. Ковригина

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

E. E. Звонков

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

A. Б. Судариков

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: dusha@blood.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы